可溶性Klotho蛋白抑制THP-1源性泡沫细胞形成

目的:探讨可溶性Klotho(KL)蛋白对THP-1源性泡沫细胞形成的影响。方法:THP-1单核细胞与160 nmol/L佛波酯孵育48 h后,诱导分化为THP-1源性巨噬细胞,给予THP-1源性巨噬细胞不同浓度(25、50、100和200μg/L)的可溶性KL蛋白预处理后,再由氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导其转变为泡沫细胞。油红O染色观察细胞内脂滴形成情况,通过液体闪烁计数法测定THP-1源性泡沫细胞内胆固醇流出情况,酶荧光法检测细胞内游离胆固醇及胆固醇酯的含量,并分别用Western blot法及RT-qPCR法检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)和ATP结合盒转运体A1(ABCA1)的蛋白及mRNA表达。结果:可溶性KL蛋白能增加THP-1源性巨噬细胞内胆固醇流出,抑制THP-1源性泡沫细胞形成,且可溶性KL蛋白呈一定浓度依赖性地抑制ox-LDL诱导的泡沫细胞形成过程中ACAT1表达的上调和ABCA1表达的下调(P<0.05)。结论:可溶性KL蛋白能够抑制THP-1源性泡沫细胞形成,其机制可能与靶向调控细胞内ACAT1和ABCA1的表达有关。     

Ghrelin对THP-1细胞泡沫化过程中酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1表达的影响

目的： 研究单核/巨噬细胞分化成为泡沫细胞过程中ghrelin对人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(ACAT-1)表达以及细胞内胆固醇酯的影响。方法: 体外培养人源单核细胞系（THP-1）,由佛波酯（PMA）作用使其分化为巨噬细胞,后者可在氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）存在条件下进一步转变为泡沫细胞。巨噬细胞加入不同浓度的ghrelin预孵2 h后再加入ox-LDL,油红O染色法观察细胞内脂滴含量,运用RT-PCR法检测ACAT-1 mRNA水平,Western blotting法检测ACAT-1蛋白表达,采用酶法,通过荧光分光光度计检测细胞内胆固醇酯含量。结果: Ghrelin可明显减少THP-1源性泡沫细胞内脂滴的形成,显著降低细胞内胆固醇酯含量,并能显著降低单核/巨噬细胞泡沫化过程中ACAT-1 mRNA 水平和蛋白表达,且此干预作用呈浓度依赖性。结论: Ghrelin可能通过ACAT-1转录翻译水平的下调延缓动脉粥样硬化的发生。     

PPAR γ-ACAT1途径在肺炎衣原体诱导巨噬细胞泡沫化中的作用

目的： 观察过氧化物酶体增殖活化受体γ （PPAR γ）和酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1（ACAT1）在肺炎衣原体（C.pn）诱导巨噬细胞泡沫化中的作用。方法：给予C.pn （1×105-1×106IFU）感染 和/或PPAR γ的配体罗格列酮（1-20 μmol/L）孵育 THP-1源性巨噬细胞48h。运用油红O染色观察细胞浆内脂滴的变化,酶荧光学法检测细胞内胆固醇酯含量的变化。分别运用RT-PCR和Western blotting检测ACAT1、PPAR γ mRNA和蛋白表达。结果：高浓度的C.pn（5×105和1×106 IFU）感染使THP-1源性巨噬细胞内脂滴明显增多,胆固醇酯与总胆固醇的比值明显增加（>50%）。C.pn感染呈浓度依赖性上调ACAT1 mRNA和蛋白表达,并且浓度依赖性地下调PPAR γ mRNA和蛋白表达（P<0.05）。高浓度的罗格列酮（10、20 μmol/L）明显抑制C.pn诱导的细胞内脂质滴的增多和胆固醇酯含量的增加, 同时罗格列酮呈浓度依赖性抑制C.pn诱导的ACAT1 mRNA和蛋白表达的上调（P<0.05）。结论：C.pn 经PPAR γ途径上调ACAT1表达,进而诱导巨噬细胞泡沫化,这为进一步阐明C.pn感染促进动脉粥样硬化发生发展提供一个新的理论依据。     

Effects of ADMA on the expression of acyl-coenzyme A:Acylcholesterol transferase-l ( ACAT-I ) in cell differentiation from mononuclear/macrophage cells to foam cells

目的 观察不对称二甲基精氨酸(ADMA)对单核/巨噬细胞分化为泡沫细胞过程中酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶-1(ACAT-1)表达的影响.方法 1)THP-1单核细胞与160 nmol/L佛波酯(PMA)孵育48 h后,再与80 mg/L氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)孵育24h,用油红O染色在光镜下鉴定细胞形态及变化.2)将THP-1单核细胞、巨噬细胞、泡沫细胞分别用20 μmol/L ADMA干预24h,酶法测泡沫细胞内胆固醇酯的含量,RT-PCR方法检测ACAT-1mRNA表达,Western blot方法检测其蛋白表达.结果 1)ADMA可显著增加泡沫细胞内胆固醇酯的含量.2)与THP-1单核细胞相比,巨噬细胞(P＜0.05)、泡沫细胞(P＜0.01)中ACAT-I mRNA及蛋白表达增加;而与巨噬细胞相比,泡沫细胞中ACAT-I mRNA及蛋白表达增加但无显著性差异.3)与各自的对照组相比,经ADMA作用后3种细胞中ACAT-I mRNA及蛋白表达水平均增加(P＜0.01).结论 ADMA增加泡沫细胞内胆固醇酯的含量可能是通过上调ACAT-1的mRNA及蛋白表达来实现的.     

不对称二甲基精氨酸对单核/巨噬细胞分化为泡沫细胞过程中酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶-1表达的影响

 [摘要] 目的 观察不对称二甲基精氨酸（ADMA）对单核/巨噬细胞分化为泡沫细胞过程中酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶-1（ACAT-1）表达的影响。 方法 （1）THP-1单核细胞与160nmol/L佛波酯（PMA）孵育48h后,再与80mg/L氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）孵育24h,用油红O染色在光镜下鉴定细胞形态及变化。（2） 将THP-1单核细胞、巨噬细胞、泡沫细胞分别用20μmol/L ADMA干预24h,酶法测泡沫细胞内胆固醇酯的含量,RT-PCR方法检测ACAT-1mRNA表达,Western blot方法检测其蛋白表达。 结果 （1）ADMA可显著增加泡沫细胞内胆固醇酯的含量。（2）与THP-1单核细胞相比,巨噬细胞（p<0.05）、泡沫细胞（p<0.01）中ACAT-1mRNA及蛋白表达增加;而与巨噬细胞相比,泡沫细胞中ACAT-1mRNA及蛋白表达增加但无显著性差异。（3）与各自的对照组相比,经ADMA作用后3种细胞中ACAT-1mRNA及蛋白表达水平均增加（p<0.01）。结论 ADMA增加泡沫细胞内胆固醇酯的含量可能是通过上调ACAT-1的mRNA及蛋白表达来实现的。     

METTL3调控SPRING1促进巨噬细胞脂质蓄积

目的 探讨METTL3调控SPRING1促进巨噬细胞脂质蓄积的作用及机制。 方法 100 ng/mL PMA诱导THP-1细胞贴壁后,50 μg/mL Ac-LDL孵育THP-1细胞。Western blot测定METTL3和SPRING1蛋白;qRT-PCR测定SPRING1mRNA水平;细胞内总胆固醇、胆固醇酯以及游离胆固醇变化用高效液相色谱法检测;SRAMP和RMBase网站分析SPRING1 mRNA上的m6A修饰位点情况;质膜红色荧光标记探针Dil-Ac-LDL观察巨噬细胞脂滴摄取情况。 结果 与对照组相比,Ac-LDL孵育后THP-1细胞METTL3和SPRING1蛋白表达上调,并且SPRING1 mRNA水平上调;过表达METTL3会使SPRING1蛋白表达上调,巨噬细胞对脂质摄取增加,细胞内Dil-Ac-LDL明显增多;反之,沉默METTL3表达,SPRING1蛋白表达下调;甲基化抑制剂环亮氨酸处理可部分抑制METTL3过表达对SPRING1表达的促进作用;生物信息学分析显示,SPRING1 mRNA存在m6A修饰位点。 结论 METTL3上调SPRING1表达,促进巨噬细胞脂质蓄积。     

酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1反义寡核苷酸对泡沫细胞形成的影响

目的：观察酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1（ACAT1）反义寡核苷酸对泡沫细胞（FC）形成的影响。 方法： 体外培养人THP-1单核细胞系，由佛波酯（PMA）作用使其分化为巨噬细胞；并建立过表达ACAT1基因的THP-1单核细胞系。在脂质体的介导下将针对ACAT1基因序列的反义和错义寡核苷酸分别作用于上述细胞6 h后加入Ac-LDL进行脂质负荷，以Western blotting法检测ACAT1蛋白表达，放射性同位素标记底物法检测ACAT酶活性的变化，油红O染色法观察泡沫细胞的形成情况。 结果： ACAT1反义寡核苷酸可明显抑制巨噬细胞和过表达ACAT1基因的THP-1单核细胞内的ACAT酶活性，而且可明显抑制Ac-LDL负荷后泡沫细胞的形成；错义寡核苷酸则无此作用。 结论： ACAT1反义寡核苷酸可抑制ACAT的生物学活性及泡沫细胞的形成。     

脂肪分化相关蛋白反义寡核苷酸降低乙酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶活性

目的：已经发现随着细胞内胆固醇酯的积聚，脂肪分化相关蛋白的表达明显增加。本文进一步探讨脂肪分化相关蛋白干预细胞内胆固醇代谢的作用位点。 方法： Ox-LDL组为80 mg/L 氧化低密度脂蛋白与C57BL/6J小鼠腹腔巨噬细胞共同孵育，Ox-LDL+antisense组另加1 mmol/L脂肪分化相关蛋白反义寡核苷酸，在不同的时点取样，共观察4 d。使用荧光分光光度计观察细胞内胆固醇酯的改变；使用脂肪分化相关蛋白抗体间标法结合流式细胞术，观察脂肪分化相关蛋白表达量的变化；使用Ox-r［CL-3H］LDL和液体闪烁计数器观察细胞对氧化低密度脂蛋白摄入量的变化，并同时测定乙酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶的活性。 结果： 72 h后，Ox-LDL+antisense组细胞内胆固醇酯（19.9±1.9）mg/g protein显著低于Ox-LDL组（46.6±3.4）mg/g protein。4 d观察期间，脂肪分化相关蛋白蛋白的表达量两组细胞都增加，从12 h时点开始，Ox-LDL组大于Ox-LDL+antisense组，在4 d时点，Ox-LDL组明显高于Ox-LDL+antisense组。两组细胞摄入Ox-r［CL-3H］LDL的量逐渐增加，但是，Ox-LDL+antisense组摄入量从1 d后明显低于Ox-LDL组，在2 d和4 d时点，两组差别仍有显著性。乙酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶相对活性从6 h到2 d表现为增加，在2 d时点，两组比较差别显著，Ox-LDL+antisense组的活性明显低于Ox-LDL组。但从2 d到4 d，乙酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶相对活性稳定。ACAT的活性与脂肪分化相关蛋白蛋白的表达量相关分析表明，Ox-LDL组R2＝0.6176 （P＜0.05），Ox-LDL+antisense组R2＝0.8212（P＜0.05）。 结论： 抑制脂肪分化相关蛋白表达能引起细胞摄入外源性脂蛋白减少和乙酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶的活性降低，提示脂肪分化相关蛋白与脂滴的代谢功能密切相关，且乙酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶有可能是其潜在的位点。     

内脂素通过上调ACAT1诱导THP-1源性泡沫细胞形成

目的:观察酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)在内脂素(visfatin)诱导THP-1源性泡沫细胞形成中的作用,以初步探讨visfatin诱导泡沫细胞形成的分子机制。方法:THP-1单核细胞诱导分化为巨噬细胞,予不同浓度的visfatin(1×10-7~1×10-5mol/L)分别作用0~48小时,运用油红O染色观察细胞浆脂滴变化,酶荧光法检测细胞内总胆固醇(TC)和游离胆固醇(FC)含量,TC与FC之差为胆固醇酯(CE)含量。分别运用RT-PCR和Western blot检测ACAT1 mRNA和蛋白表达。结果:与对照组比较,visfatin干预组细胞浆脂滴明显增多,CE与TC的比值明显增加(>50%)。visfatin呈浓度和时间依赖性地上调ACAT1 mRNA和蛋白表达(P<0.05)。结论:ACAT1表达上调是visfatin诱导THP-1源性泡沫细胞形成的机制之一,这可能为visfatin致动脉粥样硬化发病机制的研究提供一个新的理论依据。     

Sortilin调控ABCA1蛋白水平影响荷脂巨噬细胞内脂质流出

目的　探讨Sortilin对荷脂THP-1巨噬细胞ABCA1蛋白表达及胞内脂质流出的影响。 方法　采用Western blot和qRT-PCR检测细胞内ABCA1蛋白和mRNA表达水平；Co-IP实验检测Sortilin和ABCA1的结合情况；高效液相色谱法检测细胞内总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇酯含量变化；油红O染色观察细胞内脂滴情况。 结果　Sortilin下调细胞内ABCA1蛋白水平，但对其mRNA水平无显著影响；Co-IP结果表明Sortilin能与ABCA1结合；与对照组相比，Sortilin过表达后荷脂巨噬细胞内胆固醇流出减少，胞内脂质含量增加且脂滴肥大，数量明显增多，Sortilin沉默后荷脂巨噬细胞胆固醇流出增加，胞内脂质含量减少，脂滴瘦小，数量减少；溶酶体抑制剂氯喹共处理可部分逆转Sortilin过表达对巨噬细胞ABCA1蛋白和胆固醇流出的抑制作用。 结论　Sortilin下调巨噬细胞ABCA1蛋白水平，抑制胆固醇流出，促进胞内脂质蓄积。     

胰岛素对人单核/巨噬细胞ACAT1基因P1和P7启动子活性的影响

 目的：研究胰岛素对人单核/巨噬细胞酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1（acyl coenzyme A:cholesterol acyltransferase 1, ACAT1）基因P1和P7启动子的活性及其转录产物表达的影响,从而探讨它们在胰岛素调控ACAT1基因表达中的作用。方法：将人ACAT1基因P1和P7启动子调控的报告基因载体pGL3E-P1和pGL3E-P7 瞬时转染入体外培养人THP-1 单核细胞系,给予不同剂量的胰岛素处理,通过双萤光素酶报告系统检测P1和P7启动子的活性。体外培养THP-1细胞和由佛波脂诱导分化的巨噬细胞,同样用不同剂量的胰岛素干预24 h,应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测THP-1细胞ACAT1 基因P1和P7启动子转录产物表达,用SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR方法检测THP-1细胞和诱导分化的巨噬细胞ACAT1 mRNA的表达。结果：不同剂量胰岛素处理的人THP-1细胞,与对照组相比,ACAT1基因 P1启动子的活性及其转录产物量均显著增强,并随胰岛素剂量的增加而升高。应用实时定量RT-PCR方法检测ACAT1 mRNA的表达与上述结果相一致。结论：胰岛素可通过激活人单核/巨噬细胞ACAT1 基因P1启动子上调ACAT1 mRNA的表达,其作用呈剂量依赖性。     

IL-1通过PKC/MAPK通路上调泡沫细胞ACAT-1的表达及活性

 摘要 目的 研究白细胞介素1(Interleukin 1, IL-1)是否通过蛋白激酶C/丝裂原激活蛋白激酶（PKC/MAPK）信号通路上调泡沫细胞中脂酰CoA胆固醇酯酰转移酶-1（ACAT-1）的表达及活性。方法 复苏并培养人单核细胞株THP-1细胞,与200nM乙酸肉豆蔻佛波酯（PMA）共孵育48h,再与氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）共孵育24h,油红O染色观察细胞质内脂质沉积;检测泡沫细胞、泡沫细胞加IL-1及泡沫细胞加IL-1/IL-1单克隆抗体三组细胞中PKC和MAPK的活性;在三组细胞中分别加入PKC和MAPK抑制剂,分别以Western blot及液相闪烁计数法检测ACAT-1的蛋白表达及酶活性。结果 与PMA共孵育48h后,THP-1细胞逐渐伸出突起,由圆形、悬浮式生长转变为多角形、梭形,呈阿米巴样贴壁生长;经Ox-LDL诱导24h后,油红O染色胞质内可见大量吞噬的脂质小滴。与泡沫细胞组相比,泡沫细胞加IL-1组PKC活性（P<0.05）、MAPK活性（P<0.05）、ACAT-1蛋白表达及活性增加（P<0.05）;PKC抑制剂和MAPK抑制剂能显著抑制IL-1上调ACAT-1表达（P<0.05）及活性（P<0.05）的作用。结论 IL-1上调泡沫细胞ACAT-1表达及活性的作用是通过PKC/MAPK信号通路途径实现的。     

高糖对THP-1细胞及平滑肌细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体4表达的影响

目的：探讨高糖对单核/巨噬细胞系THP-1细胞及人主动脉平滑肌细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体4(TRAIL-R4)表达的影响。方法：用PMA孵育THP-1细胞，诱导其分化成为巨噬细胞。流式细胞仪检测成功诱导的巨噬细胞粘附分子CD11b及CD11c。采用不同糖浓度干预THP-1细胞，用Western blotting技术检测TRAIL-R4的表达。用25 mmol/L 高糖培养液在不同时点孵育人主动脉平滑肌细胞，观察TRAIL-R4蛋白表达的变化。用PKC激动剂干预THP-1细胞后，用Western blotting技术检测TRAIL-R4的表达。结果：佛波酯(PMA)孵育THP-1细胞48 h可诱导其分化成为巨噬细胞。20 mmol/L 高糖明显上调人THP-1细胞TRAIL-R4的表达。高糖对人主动脉平滑肌细胞TRAIL-R4表达上调的影响随着刺激时间的增加而增加。PKC激活后THP-1细胞TRAIL-R4的表达明显上调。结论：高糖上调TRAIL-R4蛋白表达，TRAIL-R4通过抑制巨噬细胞及平滑肌细胞的凋亡促进动脉粥样硬化。     

伤寒杆菌IVB型菌毛激活PKC信号通路诱导THP-1细胞IL-6表达

目的 探讨伤寒杆菌IVB型菌毛激活PKC信号通路诱导THP-1细胞IL-6表达。方法将THP-1细胞分别与有IVB型菌毛的A21-6菌、缺失IVB型菌毛的pilS^-菌共同孵育,分别检测蛋白激酶C(PKC)活性、IL-6产量及IL-6 mRNA的表达水平;用PKC抑制剂DECA预处理THP-1细胞,然后再以A21-6菌诱导,测定PKC活性和IL-6产量。结果THP-1细胞经有IVB型菌毛的A21-6菌刺激后,IL-6的产生水平、mRNA的表达水平以及PKC活性均显著高于相应的处理组。PKC活性在一定范围内呈时效关系,刺激10min后即明显升高,并于30min左右达到峰值。PKC抑制剂DECA一定程度上能够抑制IVB型菌毛诱导的THP-1细胞PKC活性和IL-6产生水平。结论IVB型菌毛在伤寒杆菌诱导单核／巨噬细胞产生IL-6过程中是一种重要的刺激因素;PKC参与了该过程的细胞内信号转导。