骨髓间充质干细胞向肌成纤维细胞转化及一贯煎的影响

目的:观察体外诱导骨髓间充质干细胞向肌成纤维细胞分化及一贯煎的影响。方法:骨髓间充质干细胞分离、培养和鉴定,取第3代细胞加入转化生长因子(TGF-β1 5μg.L-1)诱导定向分化。骨髓间充质干细胞随机分为正常组、TGF-β1诱导组,TGF-β1诱导加一贯煎组,2周后通过免疫荧光、实时定量PCR法检测骨髓间充质干细胞分化情况及一贯煎的影响。结果:骨髓间充质干细胞鉴定结果显示CD44强阳性表达,CD29弱阳性表达。TGF-β1诱导后,免疫荧光及实时定量PCR均显示TGF-β1诱导组细胞α-SMA阳性表达,一贯煎组细胞α-SMA表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:经体外诱导骨髓间充质干细胞可以向肌成纤维细胞分化,一贯煎可阻止骨髓间充质干细胞向肌成纤维细胞分化。     

毛冬青甲素促进骨髓间充质干细胞迁移的实验研究

目的观察毛冬青甲素（ilexonin A, IA）干预大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）后基质细胞衍生因子（SDF-1）特异性受体CXCR4和Wnt通路中β-连环蛋白（β-catenin）、糖原合成激酶（GSK-3β）的表达情况,探讨IA预处理促进BMSCs体外迁移的分子机制。方法采用全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠并行BMSCs鉴定。将BMSCs分为对照组、Wnt3a组、IA组、IA + Wnt3a组、IA + Dkk1组、Dkk1组。以Wnt 信号通路的激动剂Wnt3a、抑制剂Dkk1干预,Western blot法观察β-catenin、GSK-3β与CXCR4的表达关系。结果与对照组比较,Wnt3a组、IA组CXCR4、β-catenin蛋白表达显著增强、GSK-3β蛋白表达显著减弱;（P<0.05）,Dkk1组CXCR4、β-catenin蛋白表达显著减弱（P<0.05）;与Wnt3a组、IA组分别比较,IA+Wnt3a组CXCR4蛋白显著增强,GSK-3β蛋白表达显著减弱（P<0.05）;与Dkk1组比较,IA+Dkk1组CXCR4、β-catenin蛋白表达显著增强,GSK-3β蛋白表达显著减弱（P<0.05）;与IA组比较,IA+Dkk1组β-catenin的表达显著减弱,GSK-3β蛋白表达显著增强（P<0.05）。结论IA上调CXCR4 的表达,可能与 BMSCs 的Wnt/β-catenin信号通路激活有关,发挥其促迁移的作用。     

珠子参皂苷诱导骨髓干细胞分化为肝样细胞的体外实验研究

目的:观察珠子参皂苷对骨髓干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)分化为肝细胞的影响。方法:在无菌条件下快速处死SD大鼠,收集骨髓细胞,快速悬浮于预冷的NH4Cl低渗盐溶液中裂解红细胞,离心去上清,收集沉淀的细胞,D-HankS充分洗涤后,用含10%的低糖型DMEM培养基进行扩增培养;取生长状态良好的第四代细胞,随机选择空白组、HGF组(20ng/ml)、珠子参皂苷(50、100和200μg/ml)组,分别与第7天和第14天后观察细胞形态、检测细胞合成糖原,摄取LDL及分泌尿素的能力,进行HGF、c-MET、AFP、Albumin、CK18基因表达和AFP、Albumin、CK18蛋白表达分析。结果:珠子参皂苷和HGF可诱导BMSCs分化为肝细胞,促进其合成糖原、摄取LDL及分泌尿素的能力;可显著增加肝细胞特异性HGF、c-MET、AFP、Albumin、CK18基因表达和AFP、Albumin、CK18蛋白表达。结论:珠子参皂苷体外能促进BMSCs分化为肝细胞,本研究为后续体内进行BMSCs移植和珠子参皂苷联用治疗终末期肝病(ESLD)提供了理论基础和实验依据。     

肉苁蓉含药血清对BMSC分化为神经细胞的诱导作用研究

目的：观察肉苁蓉含药血清对骨髓间充质干细胞（BMSC）分化为神经细胞的诱导作用。方法：原代培养BMSC并鉴定;SD大鼠灌胃肉苁蓉水煎剂,给药10天后取大鼠血清,将不同浓度的含药血清加入到培养至第三代的BMSC中诱导细胞分化;5小时后免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经巢蛋白（Nestin）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）3种蛋白的表达;流式细胞仪检测细胞周期变化。结果：肉苁蓉含药血清能诱导BMSC向神经细胞分化,与对照组比较,各浓度组细胞的NSE、Nestin表达均升高（P〈0.05）,且高、低浓度组之间比较有统计学意义（P〈0.05）,GFAP表达极低;流式细胞仪检测细胞周期结果显示,肉苁蓉含药血清诱导后,中、低浓度组G0/G1期细胞明显减少（P〈0.05）,S期细胞增多（P〈0.05）。结论：肉苁蓉含药血清能诱导BMSC向神经细胞分化,并促进细胞增殖。     

鳖甲煎丸含药血清诱导大鼠骨髓间充质干细胞转化为肝细胞的实验研究

目的:探讨鳖甲煎丸含药血清对大鼠骨髓间质干细胞(BMSC)向肝细胞分化的影响。方法:体外分离培养大鼠BMSC,取第3代BMSC随机分为空白对照组、肝细胞生长因子联合成纤维生长因子-4(HGF加FGF-4)组、鳖甲煎丸组、HGF加FGF-4+鳖甲煎丸联合组,分别于诱导第7、14、21、28天免疫细胞化学法检测肝细胞标志物甲AFP、ALB及CK18阳性细胞率。结果:各组AFP阳性细胞率均于21 d达到峰值,28 d表达逐渐下降,各组ALB、CK18阳性细胞率随着时间的延长,其阳性比率逐渐升高;在相同时间点,各给药组的ALB、AFP、CK18的阳性细胞率明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P0.05或P0.01);在第14天至第28天,鳖甲煎丸组、HGF加FGF-4+鳖甲煎丸联合组AFP、CK18阳性细胞率高于HGF加FGF-4组(P0.05或P0.01);鳖甲煎丸组在诱导后21、28 d的ALB阳性细胞率明显高于HGF加FGF-4组(P0.05或P0.01),而HGF加FGF-4+鳖甲煎丸联合组在诱导后第14天开始,其ALB阳性细胞率均高于HGF加FGF-4组(P0.05或P0.01)。结论:鳖甲煎丸含药血清可提高BMSCs向肝细胞定向分化的能力。     

人参皂甙与肝细胞生长因子诱导骨髓间质干细胞分化为肝细胞的实验研究

目的探讨人参皂甙(CS)与肝细胞生长因子(HGF)体外诱导骨髓间质干细胞(MSC)分化为肝细胞的协同效应及分子机制。方法采用 Ficoll-Paque 液离心分离鼠 MSC,体外扩增,在 LDMEM 培养液中加入 HGF 和 GS 进行诱导分化。通过细胞形态学观察、免疫组化检测白蛋白、CK8/18的表达以及 RT-PCR 检测白蛋白、CK18等肝细胞特征性蛋白的 mRNA 转录水平、糖原染色等来分析诱导分化的效果。结果鼠MSC 体外扩增3代,细胞数可达(1～2)×10~7左右。加入 HGF 和 GS 诱导后,MSC 形态逐渐分化为肝细胞样,免疫组化染色见胞浆内出现棕黄色颗粒,表达肝细胞特有的白蛋白以及 CK8/18等蛋白。RT-PCR 显示有白蛋白、CK18等的 mRNA 转录。糖原染色亦呈阳性反应。结论人参皂甙与肝细胞生长因子在体外可以诱导骨髓间质干细胞分化为肝细胞样细胞。     

建立人诱导多能干细胞诱导生成的类肝细胞的肝毒性检测模型及其用于中药对肝功能影响的初步评价

摘要：目的对人诱导多能干细胞（人iPS细胞）分化成的类肝细胞的分化特征进行观察与鉴定性研究及对已成功分化的类肝细胞给予不同浓度的雷公藤冻干粉后检测肝功能多项指标,观察雷公藤对人iPS细胞诱导生成的类肝细胞模型肝功能的影响,初步探讨模型在中药毒性体外评价中的应用。方法通过细胞因子四步诱导分化方法,即加入激活素A（Activin A）、骨形态发生蛋白-4（BMP-4）、成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）、肝细胞生长因子（HGF）、制瘤素M（Oncostatin M）等细胞因子23天,将人iPS细胞分化成类肝细胞,使用细胞免疫荧光、RT-PCR、吲哚青绿（ICG）摄取等实验来鉴定类肝细胞的特异性功能。细胞免疫荧光方法检测限定性内胚层细胞特异性蛋白叉头框转录因子A2（FOXA2）和性别决定区Y框蛋白17（SOX17）,肝细胞特异性蛋白甲胎蛋白(AFP)和白蛋白（ALB）,肝细胞功能蛋白细胞色素P4503A4（CYP3A4）和α1 -抗胰蛋白酶（AAT）,RT-PCR方法检测肝细胞特异性基因甲胎蛋白(AFP)、白蛋白（ALB）、细胞角蛋白8（CK8）、细胞角蛋白18（CK18）和细胞角蛋白19（CK19）是否表达做最终的验证,ICG摄取实验检测类肝细胞排泌功能。在成功诱导的类肝细胞 模型中加入雷公藤冻干粉（相当于生药量1,2,4,8 mg?mL-1）作用后,取培养液上清检测AST和ALT的活性、取细胞检测MDA的含量,GSH和SOD的活性。结果人iPS细胞经过23天的诱导成类肝细胞,RT-PCR检测结果显示细胞FOXA2和SOX17的mRNA在内胚层诱导阶段表达,在肝细胞分化与扩增阶段AFP和ALB表达,CYP3A4和AAT在肝细胞成熟阶段有表达;RT-PCR检测结果显示肝细胞特异性基因AFP、ALB、CK8、CK18和CK19在诱导完成的类肝细胞中表达;并且ICG摄取实验显示类肝细胞具有肝细胞的特异性排泌功能。加入不同剂量的中药雷公藤冻干粉后,检测AST和ALT活性,MDA浓度,GSH和SOD活性,经统计学检测,实验组相比于对照组具有显著性差异（P<0.01;P<0.05）结论细胞因子四步诱导法能诱导分化人iPS细胞成类肝细胞,加入不同剂量的雷公藤冻干粉检测AST、ALT、MDA、GSH和SOD肝功能相关指标与对照组相比具有统计学意义,提示干细胞诱导分化的类肝细胞可应用于中药肝毒性检测的体外初筛模型。     

丹酚酸B对大鼠骨髓间充质干细胞分化过程中Desmin、α-actin mRNA表达的影响

[目的]探讨丹参单体丹酚酸B（SalB）在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为心肌样细胞的情况及Desmin和d—actinmRNA的表达，确定大鼠MSCs体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点。[方法]选用成年近交系Wistar大鼠，利用percoll分离液进行密度梯度离心法和直接贴壁法进行分离、提纯MSCs，并进行培养扩增。免疫组化方法对第9代MSCs表面抗原进行鉴定。分别应用10μmol／L5-氮胞苷（5-azacytidine，5-aza）及250μg，LSalB联合5-aza（5-aza＋SalB）对第9代的MSCs进行联合诱导24h，于诱导后第4周，用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法检测Desmin、α-actinmRNA的表达。[结果]1）第9代MSCs免疫组化染色CD44呈阳性表达，CD34呈阴性表达。2）诱导4周后，细胞体积变小，可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构。5-aza组、5-aza＋SalB组均出现明确的心肌早期分化基因与5-aza组相比，5-aza＋SalB组的Desmin和α—actinm RNA表达明显增强。[结论]SalB具有促进5-aza诱导的MSCs向心肌样细胞分化的作用。     

骨髓间充质干细胞移植对四氯化碳大鼠肝损伤的影响及一贯煎的干预作用

该研究观察BMSCs早期尾静脉移植对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)肝损伤模型大鼠的影响以及一贯煎的干预作用。雌性Wistar大鼠65只,随机分为正常组,模型组,细胞移植组,一贯煎组和一贯煎加细胞移植组。造模各组大鼠按3 mL·kg^-1每周2次腹腔注射50%CCl4橄榄油溶液,共9次;细胞移植组和一贯煎加细胞移植组在首次注射CCl4后立即经尾静脉注入第3代BMSCs 1×10^6个;用药组灌胃一贯煎水煎液。结果可见细胞移植和一贯煎均可降低首次造模48 h的血清ALT和AST。造模4周后,模型组血清ALT,AST,γ-GT活性增高,TBIL含量增高;肝组织SOD活性降低,MDA和TG含量增加;肝组织病理可见大泡型脂肪变性,油红O染色可见大量脂滴,天狼猩红染色未见明显胶原增生,血清TNF-α和IL-6含量升高(P<0.05)。BMSC细胞移植组大鼠肝功能和组织病理较模型组进一步恶化,肝组织可见少量胶原增生,肝组织SOD活性更低,MDA和TG含量进一步增高(P<0.05),血清TNF-α和IL-6含量较模型组升高(P<0.05);经一贯煎干预后,各检测指标均较模型组和细胞移植组有所改善。SRY原位杂交检测显示,BMSC移植后在心、肝、脾、肺、肾均可检测到SRY阳性表达,但以肝脏最多,经一贯煎干预后,SRY阳性细胞在肝脏表达减少。Western blot结果显示正常组高表达Wnt和β-catenin,CCl4造模后表达明显减少,细胞移植后有进一步降低的趋势,一贯煎组干预后则表达增高。该研究表明早期尾静脉BMSCs移植可加重大鼠CCl4肝损伤,促进肝纤维化形成,一贯煎可改善BMSCs移植加重的CCl4肝损伤,其机制与减少BMSCs归巢肝脏,上调Wnt/β-catenin信号通路有关。     

血府逐瘀汤含药血清体外诱导骨髓基质干细胞表达Desmin和α-actin的实验研究

目的 观察血府逐瘀汤含药血清能否诱导骨髓基质干细胞（MSCs）分化为心肌样细胞,以寻找安全有效诱导MSCs向心肌细胞分化的诱导剂。方法 采用血清药理学方法进行诱导,制备血府逐瘀汤大鼠含药血清,分离培养大鼠 MSCs,MTT法检测血清细胞毒性,选用生长良好的P3细胞进行实验,将实验细胞分为3组,即空白对照组、血府逐瘀汤大鼠含药血清诱导组、5－氮胞苷诱导组。免疫细胞化学染色法检测心肌结蛋白（Desmin）,α型心肌肌动蛋白（α-actin）的表达情况。结果 诱导前各组MSCs细胞Desmin和α-actin表达阴性,个别弱阳性;其弱阳性表达率各组比较差异无统计学意义（P>0.05）。诱导后空白对照组MSCs细胞Desmin和α-actin表达阴性,个别弱阳性;血府逐瘀汤含药血清组和5－氮胞苷体外培养诱导组,MSCs细胞Desmin和α-actin表达阳性,其阳性表达率与空白对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 血府逐瘀汤含药血清具有体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为心肌样细胞的趋势,其作用可能参与了Desmin和α-actin的表达。     

丹酚酸B体外诱导MSCs向心肌细胞分化中β-catenin表达的实验研究

【目的】体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌细胞分化,检测分化过程中p—catenin蛋白表达的变化。【方法】大鼠MSCs经采用密度梯度离心法和贴壁筛选法培养,免疫细胞化学法检测MSCs的表面抗原表达,取纯化稳定的P3代MSCs,将其分为4组：空白对照组、5-氮胞苷组、丹酚酸B组、5-氮胞苷联合丹酚酸B组、进行诱导,诱导4周,观察细胞形态学改变;免疫组化方法检测心肌特异性蛋白cTnT的表达,逆转录——聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测MSCs诱导前后糖原合成激酶（GSK）、B—catenin基因mRNA表达。【结果】诱导分化后的各组不同程度的阳性表达心肌细胞特异性蛋白心肌肌钙蛋白T（cTnT）,RT-PCR显示诱导组GSK基因表达上调,B—catenin基因表达下调。【结论】丹酚酸B促进MSCs向心肌细胞分化,并伴有wnt经典信号通路的抑制。     

姜黄素诱导骨髓间充质干细胞分化成肝细胞

目的研究姜黄素诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝细胞的作用。方法贴壁筛选法体外培养骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测其表面抗原。分组诱导培养14 d:1组(空白对照组),2组(10 ng/mL成纤维细胞生长因子-4,FGF-4),3组(10 ng/mL FGF-4+20 ng/mL肝细胞生长因子,HGF),4组(10 ng/mL FGF-4+5μmol/L姜黄素),5组(20μmol/L姜黄素)。观察细胞形态学改变;利用western-blotting分析肝特异性蛋白HNF-3β的表达。结果大鼠骨髓间充质干细胞细胞表面抗原CD34、CD14、CD45阴性表达,CD44、CD73、CD90表达阳性;药物诱导后光镜下观察到骨髓间充质干细胞细胞由梭形渐变成圆形肝细胞;诱导分化后的细胞表达肝特异性蛋白HNF-3β。结论姜黄素具有促进骨髓间充质干细胞分化为肝细胞的作用。     

低剂量雷公藤甲素抑制Wnt3α/β-catenin信号通路活性改善高剂量D-葡萄糖诱导的足细胞转分化

探讨雷公藤甲素（triptolide,TP）改善高剂量D-葡萄糖（高糖）诱导的足细胞上皮-间充质转分化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用和分子机制。将体外培养的小鼠永生化足细胞分为正常组（normal group,N）、高剂量D-葡萄糖组（high dose of D-glucose group,H-TP）、低剂量TP组（low dose of TP group,L-TP）、高剂量TP组（high dose of TP group,H-TP）以及甘露醇组（mannitol group,MNT）,分别进行不同的干预：N组加入D-葡萄糖（D-glucose,DG,5 mmol·L^-1）;HG组加入HG（25mmol·L^-1）;L-TP组加入HG（25 mmol·L^-1）＋TP（3μg·L^-1）;H-TP组加入HG（25 mmol·L^-1）＋TP（10μg·L^-1）;MNT组加入DG（5 mmol·L^-1）＋MNT（24.5 mmol·L^-1）。在干预后的各时间点（24,48,72 h）,首先,观察TP对足细胞增殖活性的影响;其次,检测足细胞上皮细胞标志性分子（nephrin和podocin）、间充质细胞标志性分子（desmin和Ⅰ型胶原）以及EMT相关介质snail的蛋白表达水平;最后,检测足细胞Wnt3α/β-catenin信号通路关键信号分子Wnt3α和β-catenin蛋白表达水平。结果表明,HG不仅能引起足细胞nephrin和podocin蛋白低表达,desmin,Ⅰ型胶原和snail蛋白高表达,诱导足细胞EMT,而且,能促使足细胞Wnt3α和β-catenin蛋白高表达,激活Wnt3α/β-catenin信号通路。此外,L-TP对足细胞增殖能力没有影响,与HG联合干预不仅能明显恢复足细胞nephrin和podocin蛋白表达水平,抑制其desmin,Ⅰ型胶原和snail蛋白表达水平,改善足细胞EMT,而且,能明显降低HG诱导的足细胞Wnt3α和β-catenin蛋白高表达,抑制Wnt3α/β-catenin信号通路活性。总之,HG在体外能激活Wnt3α/β-catenin信号通路而诱导足细胞发生EMT;L-TP在体外能明显抑制Wnt3α/β-catenin信号通路活性而改善足细胞EMT,这可能是其干预足细胞EMT的作用和分子机制之一。     

十四酸甾醇酯调控Wnt/β-catenin信号通路促皮肤创面修复的研究

目的探讨十四酸甾醇酯(cholesterol myristate)对大鼠皮肤创面修复过程中Wnt/β-catenin通路的调控。方法十四酸甾醇酯作用于大鼠触须部皮肤创面,观察皮肤创面的修复情况,免疫荧光检测皮肤组织中Wnt/β-catenin通路蛋白的表达;体外分离培养SD乳鼠毛囊干细胞(Hair Follicle Stem Cells,HFSCs),免疫荧光检测细胞表面标志物CD34、CK15的表达,CCK-8法检测十四酸甾醇酯对HFSCs增殖的影响,RT-q PCR、Western-blot检测其对HFSCs中Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达。结果术后7 d,十四酸甾醇酯组创面基本愈合,表皮细胞排列紧密,表皮与真皮层连接牢固,可见新生毛细血管;对照组表皮与真皮连接不牢固,表皮排列不规则,仍有炎症浸润。术后4 d,免疫荧光检测十四酸甾醇酯组修复皮肤中β-catenin、Lymphoid enhancing factor 1(LEF1)、cancer-myc(c-myc)、cyclin D1的表达均强于对照组。所培养的细胞表达HFSCs标志物CD34、CK15,十四酸甾醇酯对HFSCs有促增殖作用(P0.01),且β-catenin、LEF1、c-myc、cyclin D1表达上调。结论十四酸甾醇酯通过激活HFSCs中的Wnt/β-catenin通路促皮肤修复。     

淫羊藿素通过Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成软骨分化

该文研究GDF-5联合淫羊藿素(ICT)诱导BMSCs成软骨分化,并探讨Wnt信号通路在其中的作用。采用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,取P3代细胞分成6组:BMSCs组,ICT组,GDF-5组,GDF-5+ICT组,GDF-5+ICT+SB216763组,GDF-5+ICT+XAV-939组,连续诱导培养14 d。倒置相差显微镜观察细胞形态学改变;Alcian Blue染色检测蛋白聚糖变化;RT-PCR检测aggrecan,Col2,Sox9,Dvl1,Gsk3β,β-catenin mRNA表达水平;Western blot检测Ⅱ型胶原蛋白和β-catenin蛋白表达水平。结果提示,与BMSCs组相比,GDF-5组,GDF-5+ICT组,GDF-5+ICT+SB216763组蛋白聚糖Alcian blue染色均明显较深;成软骨分化标记基因aggrecan,Col2,Sox9 mRNA表达水平及Ⅱ型胶原蛋白表达水平,Wnt信号通路相关基因β-catenin mRNA及蛋白表达均逐渐增加,Gsk3βmRNA表达量逐渐减少。相反,相对于GDF-5+ICT组,添加XAV-939组则表现为成软骨分化及Wnt信号通路相关基因Dvl1,β-catenin表达下调,Gsk3βmRNA表达增加,Ⅱ型胶原蛋白及β-catenin蛋白表达水平均下降,上述差异均有统计学意义。GDF-5联合淫羊藿素能够诱导大鼠BMSCs成软骨分化,其中ICT起促进作用。ICT可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进大鼠BMSCs体外成软骨分化。     

大鼠MSCs的体外分离、培养及鉴定的实验研究

[目的]体外分离、培养及鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）。[方法]密度梯度离心法体外分离、培养7周龄sD大鼠MSCs,利用差速贴壁原理纯化MSCs,并通过形态学观察、细胞表面抗原标志物、多细胞系诱导分化对其进行鉴定。[结果]第3代（P3代）不表达抗原CD34,表达抗原CD44,符合MSCs表面标志物特征。[结论]密度梯度离心法能够建立稳定的MSCs体外分离培养体系。     

毛蕊花糖苷通过Wnt/β-catenin信号通路对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤的改善作用

目的：探究毛蕊花糖苷通过调控Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路对缺血缺氧性脑损伤（HIE）新生大鼠的作用。方法：将72只新生SD雄性大鼠随机分为6组：假手术组、模型组、阳性药物组、毛蕊花糖苷高剂量组、毛蕊花糖苷低剂量组、毛蕊花糖苷+通路抑制组,每组12只,按组分别给予相应的干预。神经学评分评估大鼠神经行为学功能;TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测大鼠海马组织细胞凋亡率;干湿重法检测脑组织含水量;采用ELISA检测海马组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)的含量;荧光定量PCR法检测海马组织中Wnt1、Wnt3a、β-catenin mRNA表达水平;Western Blot法检测海马组织中Bcl-2相关x蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Wnt1、Wnt3a、β-catenin蛋白的表达水平。结果：与模型组比较,毛蕊花糖苷高剂量组、毛蕊花糖苷低剂量组大鼠神经学评分,脑组织含水量,细胞凋亡率,凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3及炎症因子TNF-α、IL-1β含量均显著降低（P<0.05）,Wnt1、Wnt3a、...     

丹参酮ⅡA对高糖诱导肾小管上皮细胞转分化中Wnt/β-catenin信号途径的影响

目的 探究高糖诱导肾小管上皮细胞转分化过程中Wnt/β-catenin信号途径的表达及丹参酮ⅡA对其影响。方法 将人近端肾小管上皮细胞(HK-2),分为正常糖组（NG组）、高糖组（HG组）、高糖+丹参酮ⅡA干预组（HG+T组）。采用免疫细胞化学观察β-catenin表达情况;Western印迹检测β-catenin、上皮细胞标志性蛋白E-钙粘蛋白(E-cadherin)、间充质细胞标志性蛋白α-SMA的表达;RT-PCR检测β-catenin、E-cadherin mRNA表达水平。结果 与NG组比较,HG组β-catenin蛋白及mRNA表达显著增强（P<0.01),E-cadherin表达显著降低（P<0.01),β-catenin蛋白在胞浆与胞核表达增强。终浓度为100 μmol/L的丹参酮ⅡA可显著减少β-catenin的异位表达;在该浓度下,β-catenin在胞核蛋白及mRNA的表达量显著下降, 而E-cadherin蛋白及mRNA的表达水平上升,同时间充质细胞标志性蛋白α-SMA的表达明显下降。结论Wnt / β-catenin信号途径参与了高糖诱导肾小管上皮细胞转分化过程,丹参酮ⅡA可能通过下调Wnt / β-catenin信号途径的活性而抑制转分化过程,进而发挥保护肾脏的作用。     

龟鹿二仙胶诱导大鼠骨髓基质干细胞成骨分化作用及对Wnt通路的影响

目的观察龟鹿二仙胶含药血清对SD大鼠骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)成骨分化的作用及其对Wnt信号通路相关因子的影响。方法 100只3月龄雌性SD大鼠经腹腔入路切除双侧卵巢,按随机数字表法分为低剂量组、中剂量组、高剂量组和空白组,每组25只。按体表面积换算龟鹿二仙胶剂量并灌胃给药,连续7天后腹主动脉采血制备含药血清。1月龄SD大鼠全骨髓贴壁法分离BMMSCs,流式细胞法(flow cytometry,FCM)法检测F3代细胞CD45和CD90表达;不同浓度龟鹿二仙胶含药血清干预F3代BMMSCs 72 h后,FCM法检测细胞周期的影响并计算增殖指数,确定最佳干预浓度。F3代细胞分为FBS组、空白组、龟鹿二仙胶组和经典诱导组,诱导培养21天后,茜素红(alizarin red staining,ARS)染色法观察BMMSCs成骨分化,RT-PCR检测成骨分化相关基因碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨钙素(osteocalcin,OC)mRNA的表达;RT-PCR和Western blot检测Wnt5a、β-连环蛋白(β-catenin)、淋巴样增强因子-1(lymphoid enhancer factor-1,Lef-1)mRNA和蛋白的表达。结果 F3代细胞CD45阳性表达率为1.46%±0.23%,CD90阳性表达率为96.97%±3.21%;浓度为10%的龟鹿二仙胶中剂量组含药血清能显著促进BMMSCs增殖;龟鹿二仙胶组和经典诱导组ARS染色可见橘红色钙结节。与空白组及FBS组比较,龟鹿二仙胶组和经典诱导组OC和ALP mRNA表达上调(P0.05),Wnt5a、β-catenin mRNA和蛋白表达上调(P0.05);与空白组、FBS组和经典诱导组比较,龟鹿二仙胶组Lef-1 mRNA和蛋白表达均升高(P0.05);与FBS组和空白组比较,经典诱导组Lef-1蛋白表达上调(P0.05)。结论龟鹿二仙胶含药血清具有促进BMMSCs增殖,诱导BMMSCs向成骨细胞分化的作用,其机制可能与调控Wnt信号通路相关因子的表达有关。     

丹酚酸B对大鼠骨髓间充质干细胞分化过程中Desmin、α-actinmRNA表达的影响

[目的]探讨丹参单体丹酚酸B(SalB)在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的情况及Desmin和α-actin mRNA的表达,确定大鼠MSCs体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点.[方法]选用成年近交系Wistar大鼠,利用percoll分离液进行密度梯度离心法和直接贴壁法进行分离、提纯MSCs,并进行培养扩增.免疫组化方法对第9代MSCs表面抗原进行鉴定.分别应用10μmol/L5-氮胞苷(5-azaeytidine,5-aza)及250μg/L SalB联合5-aza(5-aza+SalB)对第9代的MSCs进行联合诱导24 h,于诱导后第4周,用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PcR)法检测Desmin、α-actin mRNA的表达.[结果] 1)第9代MSCs免疫组化染色CD44呈阳性表达,CD34呈阴性表达.2)诱导4周后,细胞体积变小,可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构.5-aza组、5-aza+SalB组均出现明确的心肌早期分化基因与5-aza组相比,5-aza+SalB组的Desmin和α-actin mRNA表达明显增强.[结论] SalB具有促进5-aza诱导的MSCs向心肌样细胞分化的作用.