农杆菌介导的几个甘蓝型油菜下胚轴转化体系研究

选择四川目前推广的中双9号等8个甘蓝型双低常规油菜品种,以5~6 d无菌苗下胚轴为外植体,MS培养基为基本培养基,设置了8组激素配比组合,探讨其对植株再生的影响,初步建立了不同油菜品种下胚轴的高效再生体系。选择其中再生频率较高的4个品种:中双9号、中双7号,中双6号,川油18号下胚轴作为农杆菌转化材料,对影响转化的相关因素进行研究,建立了4个品种下胚轴的遗传转化体系,并运用该转化体系将pta与sb401融合基因导入,成功获取了一批经PCR检测的转基因植株。     

甜瓜自交系‘羊角蜜’植株再生及遗传转化体系的建立

组培再生体系是进行植物遗传转化、开展功能基因组学研究的前提条件,然而目前甜瓜的组培再生及遗传转化体系仍不成熟,限制了该领域基因的功能研究和育种应用。本研究以薄皮甜瓜(Cucumis melo L.)自交系‘羊角蜜(YJM)’为试材,系统比较和分析了外植体类型、基础培养基、激素浓度、抗生素和农杆菌菌株等因素对其组培再生和遗传转化的影响。结果表明播种后2 d子叶节的不定芽分化率显著高于5 d后子叶节和下胚轴;相较B5、N6、WHITE和SH四种诱导培养基,外植体在MS或LS上具有更高的愈伤诱导率及不定芽分化率;当培养基中6-BA浓度为0.5 mg L^-1时,不定芽诱导率最高、生长状态最好;据此提出‘YJM’播种后2 d子叶节的最佳诱导培养基配方为(MS/LS基础培养基+0.5 mg·L^-1 6-BA+1 mg·L^-1 ABA+30 g·L^-1蔗糖+9 g·L^-1 Agar)。随后,我们比较了三种生根培养基(MS+9 g·L^-1 Agar、MS+0.5 mg·L...     

影响马铃薯再生体系建立的主要因素

再生体系的建立是进行马铃薯遗传转化的基础,从影响马铃薯高效再生体系建立的遗传因素、外植体的生理状态、培养基配方和环境条件等内外因素进行了总结,以期为马铃薯无性变异系的筛选和基因工程改良提供依据。     

农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化体系的建立与优化

以“中苜一号”紫花苜蓿品种作为受体材料,建立了适用于农杆菌介导的转基因组培体系,并对GUS 基因进行转化,经 GUS 组织化学染色,以获得抗性愈伤组织分析为目的,转化优化条件为:叶片预培养 4~5 d,用农杆菌菌液(A600=0.3~0.8)侵染 20 min,然后在培养基上铺一层灭菌滤纸共培养 7 d 后清洗。     

宁夏水稻农杆菌转化组培体系的建立

高效的组培再生体系是水稻农杆茵遗传转化的基础,以宁夏4个主栽水稻品种为受体材料,对农杆菌转化水稻过程中影响转化效率的几个主要因素进行了研究,结果表明:花药和幼胚的愈伤组织诱导率高于成熟胚,而且愈伤状态好,有利于转化;在共培养基上铺上1张灭菌滤纸共培养时,农杆茵在培养基及受体材料表面上不会过度生长.共培养条件以26℃,共培养2天的抗性愈伤频率最高;共培养后不经洗茵处理直接进行筛选的抗性愈伤频率高于洗茵处理;经过预分化培养可提高分化率;干燥处理不仅可以有效杀死农杆茵,而且可以改善愈伤组织状态,提高转化率.初步建立了宁夏几个主栽品种的农杆菌转化体系.     

提高埃及糖橙遗传转化效率的研究

为提高农杆菌介导的甜橙遗传转化效率，以埃及糖橙实生苗上胚轴节间茎段为外植体，对实生苗生长过程中的光照条件和农杆菌侵染时的共培养条件进行优化，并将无核基因转入糖橙中。结果表明，暗培养20 d后光照10 d实生苗外植体的再生率和转化率均较高；乙酰丁香酮(AS)浓度是影响转化效率的主要因素，共培养基中加入质量浓度20 mg/L 的AS、共培养温度控制在19 ℃、共培养基pH为5.4~5.7时最有利于转化，经GUS染色分析，最高GUS阳性率可达29.4%；经PCR进一步分析，可以初步确证外源基因已经整合到糖橙基因组中。     

三倍体薄皮甜瓜高效再生体系和遗传转化体系的建立

目的:建立起高效三倍体薄皮甜瓜再生体系和遗传转化体系。方法:以哈研3号薄皮甜瓜为试材,采用组织培养技术,在二倍体甜瓜再生体系的基础上,摸索外植体类型、外源调节剂种类和配比,以及各阶段的培养条件。结果:三倍体薄皮甜瓜再生最佳外植体为带有叶芽的茎段,芽诱导率为94%;芽诱导培养基最佳组合为:MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L,Agr 1.0%;芽伸长培养基最佳组合为:MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L,Agr 1.2%;壮苗培养基为:MS+6-BA 0.2 mg/L+GA30.1 mg/L,Agr 1.2%;生根培养基最佳组合为:1/2MS+NAA 0.5 mg/L,Agr 1.0%;培养条件为:25℃、14h光照/12h黑暗;确定卡那霉素的筛选浓度为2.5mg/L;确定头孢唑啉钠的除菌浓度为500 mg/L。结论:建立三倍体薄皮甜瓜高效再生体系和遗传转化体系,为今后的大量扩繁和转基因研究打下基础。     

欧美杨108离体叶片和茎段再生体系的优化(英文)

[目的]优化欧美杨108的无性繁殖再生体系的培养条件。[方法]以欧美杨108无菌苗为材料,采用正交试验优化叶片直接分化和茎段愈伤组织分化再生体系的培养条件。[结果]欧美杨108的叶片适宜在光照下进行直接再生分化,茎段适宜在光照下进行愈伤组织诱导再生分化。叶片不定芽分化的培养基为MS基本培养基(琼脂7.0 g/L、pH 6.0、蔗糖20 g/L)附加0.6 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA;茎段愈伤组织诱导培养基为WPM固体培养基附加0.75 mg/L KT和1.5 mg/L 2,4-D。不定芽诱导生根培养基为WPM固体培养(蔗糖30 g/L)附加2.0 mg/L IBA。[结论]该研究优化了欧美杨108叶片的直接分化再生体系和茎段愈伤组织再生体系的培养条件,为其组织培养及遗传转化体系的构建提供了基础支持。     

激素和硝酸银对芥菜型油菜下胚轴再生植株的影响

为建立芥菜型油菜高效遗传转化体系,以芥菜型油菜品种‘四川黄籽’的下胚轴为外植体,采用农杆菌介导法进行遗传转化,对愈伤诱导、芽分化及生根培养3个阶段的激素、硝酸银及其配比进行优化处理。结果表明:用含1.0 mg/L 2,4?D的预培养基诱导愈伤,愈伤再生率达到100%;用含3.0 mg/L 6-BA+5.0 mg/L AgNO3的分化培养基诱导芽再生,芽再生率达28.33%,平均芽丛数为1.73个;在含2.5 mg/L IBA+0.05mg/L NAA生根培养基中,不定芽生长11 d后开始生根,生根率达到100%;经PCR检测抗卡拉霉素转化苗,阳性率达到23.80%,且GUS染色呈阳性,说明建立的芥菜型油菜遗传转化体系高效可行。     

以pmf为筛选标记的水稻转基因研究

[目的]建立一种快速、高效的甘露糖安全筛选体系。[方法]以绿色荧光蛋白（GFP）编码基因为报告基因,用农杆菌介导的方法将磷酸甘露糖异构酶基因（pmi）转入水稻品种皖粳97,并对转化和筛选条件进行优化。[结果]受体品种皖粳97,在32oC光照条件下诱导愈伤的出愈率可达90．3％,且生长较快;培养基中甘露糖筛选压力以5∥L蔗糖＋15g／L甘露糖较为适宜,在该条件下筛选21d,进而分化成苗。转化频率可达20．6％。[结论]该研究确立的甘露糖筛选体系,能明显缩短筛选周期、提高转化效率,有利于转基因水稻的安全生产。     

基因型及基本培养基对玉米成熟胚培养的影响

[目的]筛选出适宜玉米成熟胚组织培养的基因型和基本培养基。[方法]以9个基因型的玉米成熟胚为外植体,研究基因型与基本培养基对成熟胚愈伤组织诱导和继代的影响。[结果]试验中表现较好的基因型依次是853-35、853-209、丹34和81162;对于玉米成熟胚愈伤组织的诱导培养,MS培养基比N6培养基更适宜,而对于玉米成熟胚愈伤组织的继代培养,N6的培养基比MS培养基更适宜。[结论]进一步完善了以玉米成熟胚为外植体的组织培养体系。     

不同大豆品种对农杆菌EHA105和GV3101敏感性及共培养条件的优化

不同的大豆品种对于农杆菌的敏感性不同,易感型的品种更有利于转化的进行。为了进一步优化大豆转化体系,实验利用农杆菌菌株EHA105、GV3101对东农50等10个大豆栽培品种进行敏感性测定。同时对2个易感性品种,东农50、中豆32共培养中添加光照处理,统计GUS染色率。结果表明,农杆菌GV3101的侵染能力较强,10个品种的平均GUS染色率达到66.7%,远远高于EHA105的平均值(38.4%);2个菌株对中豆32和东农50进行侵染,GUS染色率平均达到69.93%和73.62%,其他品种的GUS平均染色率显著低于东农50和中豆32;但个别品种对2个菌株的敏感性差异显著,在大豆遗传转化中对于品种和菌株的选择具有重要的意义。农杆菌的侵染时间为30~60min时效果较好;在共培养阶段进行光照处理有利于提高转化率。     

结球甘蓝游离小孢子培养胚发生能力的研究

试验对20个基因型的结球甘蓝材料进行游离小孢子培养,探讨基因型、蔗糖浓度、激素配比与浓度、活性炭等因素对结球甘蓝小孢子胚发生能力的影响。实验结果表明:基因型、蔗糖浓度对胚发生能力影响最大,除个别基因型对蔗糖浓度有较高的要求外,蔗糖浓度在13%、激素组合NAA(0.05 mg/mL) BA(0.1 mg/mL)的培养基适合较多基因型的小孢子胚发生。在培养基中滴加活性碳(10 mg/L)每皿1~2滴,诱导效果明显优于不加活性炭。实验中共有11个基因型的甘蓝材料获得了胚状体,并成功筛选出基因型G 8小孢子胚高频发生的最佳蔗糖与激素浓度配比。     

小麦大龄幼胚再生性能改进与农杆菌转化

 【目的】小麦幼胚再生率与幼胚大小关系密切,改进小麦大龄幼胚再生性能促进小麦转基因研究。【方法】以18个普通小麦基因型和5个硬粒小麦基因型为材料,对其开花授粉后15—17 d的大龄幼胚进行破碎处理、组织培养和农杆菌转化,对转化后的幼胚组织和获得的抗性再生植株分别进行组织化学染色检测和PCR检测。【结果】大龄幼胚培养2 d后破碎处理的再生率为18.2%,显著高于完整胚对照(.7%),培养2 d后进行破碎处理的再生效果高于4和6 d后破碎处理;不同基因型小麦大龄幼胚破碎处理后再生率为16.9%—46.7%,其中,Bobwhite和中8423大龄幼胚再生率达到了40%以上;大龄幼胚破碎后在弱光条件下培养,再生率进一步提高,较对照(完整胚黑暗培养)提高5.4%—47.4%;农杆菌侵染后GUS瞬时表达率为0—76.7%,其中科农199高达76.7%,其次为Verry(64.4%)和Alondra(47.2%);经PCR检测,农杆菌转化小麦大龄破碎幼胚获得了候选转基因植株。【结论】破碎处理和弱光培养显著提高了小麦大龄幼胚再生率,比对照提高5—10倍;科农199、Verry和Alondra大龄幼胚对农杆菌侵染比较敏感,适宜作为农杆菌转化的受体材料;农杆菌转化小麦大龄幼胚可以获得转基因植株。     

根癌农杆菌介导的叶用莴苣基因转化系统的建立

以叶用莴苣微茎尖为试材，在含有BA和NAA的MS液体培养基上旋转培养，诱导出大量愈伤组织；进一步分化培养，获得大量不定芽并生根；将愈伤组织碎块与根癌农杆菌共培养，对经卡那霉素筛选后所得到的再生植株进行X-Gluc染色，蓝色反应阳性率为80％，表明建立了叶用莴苣愈伤组织基因转化系统。     

番茄外源基因转化系统的研究

本文结合反义ＡＣＣ基因的番茄中的导入,就番茄外源基因转化系统建立中的几个问题做了研究。结果表明,转基因番茄的组织培养比普通番茄更复杂和困难,需要对其培养基的激素配比做系统研究,以选择更适合的培养基,抗生素的使用要掌握好剂量,在番茄的子叶上以５０ｍｇ／Ｌ为宜;叶盘法转化番茄子叶时采用的菌液浓度及处理时间对转化也有很大的影响,以农杆菌过夜培养液用ＭＳ液体培养基稀释１０倍,浸泡时间为５ｍｉｎ为宜;转基因     

根癌农杆菌介导苹果遗传转化研究进展

论述和分析了影响苹果高效离体再生的主要因素 ,包括试验材料苹果的基因型、外植体生理状态、培养基类型、植物激素、Ag NO3、前期暗培养、抗生素等内外因子 ,以及影响根癌农杆菌介导苹果遗传转化的主要因素 ,包括苹果基因型、外植体生理状态、菌株类型、菌液浓度、活化物质的应用、共培养、预培养、选择培养、培养基成分等内外因子。并对其研究现状、存在的问题及应用前景作了简要概述     

Regular Production of Transgenic Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens

Wheat is the number one crop both in acreage and total yield in the world. Therefore, it is very important to improve wheat by gene engineering techniques even though it belongs to the plants insensitive to gene transformation, especially to Agrobacterium-mediated transformation. Wheat immature embryos of 1.0-1.5mm in size, C58c1 of Agrobacterium strain harboring pPTN249, pPTN270, pPTN254, and pSIS-GFP respectively (all the vectors contain the aphA selectable gene driven by enhanced 35S promoter and a target gene controlled by ubi promoter or E35S promoter), AB medium for Agrobacterium activate culture, WCC medium for co-culture, were used in this study. The embryos with 4 days of pre-culture were transferred onto selection medium with 10mg/L geneticin, 50mg/L ticarcillin, 50mg/L vancomycin, and 50mg/L cefotaxine after 30 minutes of infection and 2 days of co-cultivation with Agrobacterium. Followed callus production,shoot regeneration on selection medium, 114 resistant plantlets were obtained from 10 transformation experiments of four genotypes. By nptⅡ ELISA (nptⅡ enzyme assay), PCR, Southern blot and leaf bleach,29 positive plants were identified from two genotypes of Bobwhite and Yanglmai 10, with an average transformation efficiency of 0.82 %. The result tested by Southern blot also showed that the transgenic plants with single- copy integration of target gene took 65.52% among total positive plants. The ELISA value of transgenic plant was also related to the copies of alien DNA integrating into wheat chromosomes, the transgenic plants with single copy integration giving higher ELISA value than the ones with 2 or 3 copies integration.     

水稻规模化转基因技术体系构建与应用

水稻作为重要的粮食作物和遗传转化的模式植物,其遗传转化一直受到广泛重视。自世界首例转基因水稻于1988年获得成功以来,水稻遗传转化技术体系迅猛发展,尤其是1994年首次通过农杆菌介导实现对粳稻的高频转化,经过近20年的发展,水稻遗传转化技术体系已经比较完善。目前,应用于水稻中的转基因技术主要包括基因枪介导法和农杆菌介导法,一些实验室也采用花粉管通道法、电击法、PEG转化法等。其中,农杆菌介导的转基因方法以其低成本、易操作、转化效率高、单位点插入比例高、后代表达稳定等特点已经成为水稻转化的主流方法,约占水稻转基因报道总数的80%以上。虽然国内外刊物时有转基因方法改进的报道,但是由于种种原因,水稻的转化还受一些因素的限制,例如部分粳稻品种和籼稻受基因型的限制十分明显,转基因效率普遍较低,严重制约了转基因技术在水稻生产中的应用;某些转基因程序过于繁琐,耗时长,成本高,不但导致效率低,而且长时间的组织培养诱发逆转座子转座引起无性系变异干扰了功能研究和育种工作。因此,迫切需要建立高效、安全、规模化和标准化的水稻转基因技术体系。文章综述了国内外水稻转化技术的发展历程,重点回顾了近5年中国水稻规模化转基因技术研究进展,包括围绕不同水稻基因型高效转化体系优化及建立,对影响农杆菌转化效率及植株分化频率等诸多因素如水稻基因型、外植体类型、农杆菌菌株和质粒载体、培养基组分、共培养时间、侵染方式等方面的研究和探索。整合国内外已有研究结果进行技术集成创新,分别以粳稻和籼稻成熟胚、幼胚为外植体,采用农杆菌转化方法,通过优化受体材料和愈伤状态、农杆菌侵染浓度和分化温湿度、工艺流程标准化等多种组分,突破了成熟胚分化难的技术瓶颈,整合了无选择标记等安全转基因技术,实现了粳稻和部分籼稻转化技术的标准化和工厂化,初步建立了安全、高效、规模化水稻转基因技术体系。但与国际先进水平相比,尤其与一些跨国生物技术公司相比,在转化规模和转化效率方面仍然存在较大差距。认为安全、高效、规模化是转基因水稻新品种培育和产业化的重大技术瓶颈。建立水稻主栽品种快速、高效、稳定的转化系统,开发安全型转化技术,开展多基因、大片段基因转化,实现转基因的定点整合和时空控制表达等是水稻转基因技术的发展趋势,针对水稻规模化转基因技术体系存在的问题,提出了相应的对策,对于促进转基因水稻新品种培育和功能基因组学研究具有一定参考价值。     

一种快速、高效的大豆农杆菌转化技术

【目的】拟通过改进大豆外植体的组织培养、农杆菌侵染以及植株再生等关键性环节,构建快速、高效的大豆转基因技术体系,解决外源基因难以导入大豆的难题。【方法】成熟大豆种子在环境温度25～28℃、含有1 mg•L-1 6-苄氨基嘌呤的MSB5培养基上催芽24 h。保留大豆下胚轴、胚尖及1片子叶作为外植体,并在相同条件下预培养24 h。将外植体转入2/3 MSB5液体培养基（1 mg•L-1 6-苄氨基嘌呤＋100 μmol•L-1乙酰丁香酮＋携带有Ti质粒pBI121的根瘤农杆菌GV3101）中,在28℃黑暗环境下侵染21 h。侵染后的外植体在28℃黑暗条件下共培养3 d。外植体经无菌水处理后移栽到灭菌土中,并在适宜条件下培养。【结果】分子检测结果表明,本研究涉及的新型外植体的再生率高达90%以上（中品661为95%,垦农18为93%,绿75为90%）,转化效率明显提高;而利用子叶节和胚尖进行培养获得的外植体的再生率仅50%和70%。此外,本研究涉及的大豆转化体系省去了外植体后期繁琐、耗时的组织培养步骤,再生周期明显缩短。【结论】与前人报道的大豆遗传转化体系技术相比,本研究所使用的方法更加快速、高效,可为农杆菌介导的大豆转基因、突变体构建等基因组学研究提供强有力的技术平台。