ggpps 5′-侧翼序列的克隆及其启动子功能验证

目的：研究栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPs）基因启动子的活性;方法：从曼地亚红豆杉细胞中克隆ggpps基因5′-侧翼序列,并将该侧翼序列代替pBI121质粒上的CaMV35S启动子,以Gus基因作为报告基因构建植物表达载体,并进一步导入农杆菌LBA4404中获得阳性转化子,然后用叶盘转化法验证该侧翼序列的启动子活性;结果：本研究从曼地亚红豆杉细胞中成功克隆了ggpps基因的5′-侧翼序列,并且验证了该侧翼序列具有启动子活性;结论：ggpps基因的5′-侧翼序列的测序结果表明本实验成功克隆了该侧翼序列,启动子功能验证结果表明ggpps 5′-侧翼序列具有启动子活性,这些结果为进一步的通过缺失法进行ggpps基因启动子功能研究奠定了基础。     

曼地亚红豆杉植株中GGPP合成酶的克隆与分析

从 5年生曼地亚红豆杉 (Taxusmedia)的当年生新鲜枝叶中提取分离出mRNA ,然后根据已知植物的牛儿基牛儿基焦磷酸合成酶基因 (GGPPS基因 )DNA序列保守区设计特异简并引物。RT PCR获得了一条大小约 60 0bp的扩增谱带 ,回收该特异谱带并进行TA克隆 ,蓝白斑筛选 ,得到若干阳性克隆。经过质粒大小比较和PCR验证后 ,进行序列测定和同源性比较。发现该序列属于GGPP合成酶的片断 ,与Taxuscanadensis (AAD 1 60 1 8 1 )和Abiesgrandis (AAL1 761 4 2 )的GGPP合成酶相应区段的氨基酸序列一致性为 98%和 86%。蛋白质序列分析发现该序列含有一个特征的异戊二烯合成酶保守的结构域。进化树分析表明 ,曼地亚红豆杉GGPPS在进化上位于植物类 ,靠近古细菌类。曼地亚红豆杉GGPPS基因的克隆为研究红豆杉生产紫杉醇的分子机理和转基因植株的构建奠定了良好的基础。     

人牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶的cDNA克隆、基因定位及组织表达谱分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)在真核生物中主要参与对包括Rho/Rac,Rap和Rab家族在内的多种蛋白质的翻译后修饰及细胞凋亡的调控.牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)是合成GGPP的关键酶,它催化法呢基焦磷酸与异戊烯焦磷酸的缩合反应而产生GGPP.报道了从人睾丸cDNA文库中克隆到一个与果蝇GGPPS cDNA高度同源的基因转录本,它的序列长1466 bp,其中nt 239～1138是一个完整的可读框,编码一个由300个氨基酸组成的35 ku蛋白质.该推导蛋白质的氨基酸序列与果蝇GGPPS的一致性和相似性分别达到了57.5%和75%,并且含有异戊二烯转移酶中保守的5个特征性结构域.Northern杂交结果显示人GGPPS基因在心脏中表达最高,在脾、睾丸、脑、胎盘、肺、肝、骨胳肌、肾、胰腺组织中为中度表达,而在其他组织中未见有明显的杂交带.采用辐射杂种细胞系定位技术,发现GGPPS位于人染色体lq43区.由于此前有遗传连锁资料证实该区域存在一个前列腺癌的易感位点,并且另有研究发现GGPP的结构类似物可抑制PC-3前列腺癌细胞系中p21rap蛋白的牻牛儿基牻牛儿基化,从而提示GGPPS有可能是与该病相关的候选基因之一.     

竹叶花椒ZaGGPPS基因克隆与表达分析

为了揭示竹叶花椒萜类代谢的分子机理及嫁接对其风味的影响,该文依据转录组数据设计特异性引物,采用RT-PCR方法从竹叶花椒(Zanthoxylum armatum)中克隆得到一个全新的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)基因的全长cDNA序列,命名为ZaGGPPS,并利用NCBI、ProParam、SignalP 4.1 server、DNAMAN和MEGA 7.0软件对ZaGGPPS基因进行生物信息学分析,并比较其在嫁接树和实生树中的表达量。结果表明:ZaGGPPS包含完整的cDNA开放阅读框(OFR),由1 086 bp组成,编码361个氨基酸。其蛋白的相对分子量为39 079.14 Da,理论等电点pI为6.38。Blast比对结果显示该蛋白质属于GGPPS家族蛋白,含有2个GGPPS蛋白特有的天冬氨酸富集基序,分别是"DDXXXXD"和"DDXXD",以及5个特征性功能结构域。系统进化树结果显示竹叶花椒与芸香科植物甜橙(Citrus sinensis)、克里曼丁桔(C. clementina)、柚子(C. maxima)等亲缘关系较近。荧光定量PCR检测显示,ZaGGPPS基因在竹叶花椒中的表达量从高到低分别为实生树的叶、嫁接树的叶、实生树的茎、嫁接树的茎。牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶是竹叶花椒萜类化合物生物合成途径中的关键酶,通过嫁接可影响ZaGGPPS基因在叶和茎中的表达量。该文对竹叶花椒ZaGGPPS基因进行了克隆与分析,为后续深入研究竹叶花椒香气形成的分子机理及利用分子生物学手段选育优良品种提供理论依据。     

茶树CsGGDPS7基因的克隆和表达分析

从茶树基因组鉴定得到牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CsGGDPS7,以铁观音茶树为材料克隆获得全长cDNA(GenBank登录号MH891780)。CsGGDPS7序列全长1 185bp,包含1 098bp开放阅读框(ORF),编码365个氨基酸。预测结果显示在N端包含叶绿体转运肽,亚细胞定位于叶绿体中。氨基酸序列分析结果显示,具有类异戊二烯合成酶家族的5个保守域和2个特征功能域(DDXXXXD和DDXXD)。进化树结果表明与油橄榄(Olea europaea)OeGGDPS7亲缘关系最近。荧光定量检测显示,CsGGDPS7在叶片中的表达量显著高于其他组织,但花发育阶段CsGGDPS7表达量差异不显著。在乌龙茶做青过程中,CsGGDPS7在晒青阶段就快速上调表达并在三摇达到峰值。CsGGDPS1和CsGGDPS2表达也受做青调控,但CsGGDPS4不受做青调控。研究推测,CsGGDPS7可能与乌龙茶萜类香气物质合成密切相关。     

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶和紫杉二烯合酶基因在灰盖鬼伞中的组合表达

紫杉二烯是紫杉醇合成途径中的前体物质。紫杉醇是红豆杉的一种重要的次级代谢产物,是一种重要的新型抗癌药物。然而,紫杉醇在植物中含量低且难提取,限制了高效应用。利用基因工程手段,借助担子菌类真菌灰盖鬼伞具有的内源类异戊二烯合成途径,构建含有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate,GGPP)合酶和紫杉二烯合酶的融合基因表达载体p Bg GGTS和独立表达盒表达载体p Bg GGg TS,并分别转入灰盖鬼伞LT2菌株中,经过选择性筛选、PCR鉴定、Southern blotting杂交验证,分别获得了5株融合表达的灰盖鬼伞工程菌和5株独立表达盒的灰盖鬼伞工程菌株。各随机挑选了1株工程菌株,分别提取菌丝体和发酵液分析。GC-MS分析表明,两种工程菌株与原出发菌株的菌丝提取物无明显差异峰,而与出发菌株的发酵液提取物相比,两种转基因灰盖鬼伞的发酵液中均出现了明显的差异峰,采用GC-MS特征质量离子分析方法判定为紫杉二烯,分别为44 ng/L(转化p Bg GGg TS)和30 ng/L(转化p Bg GGTS)。结果表明,通过在灰盖鬼伞融合基因或各自独立表达的形式共表达ggpps和ts基因,可以生物合成紫杉二烯。     

转基因水稻中过表达OsHGGT基因提高种子三烯生育酚含量的研究

旨在提高稻米中三烯生育酚的含量,将来源于日本晴尿黑酸牻牛儿基牛儿基牻转移酶(homogentisic acid gerany-lgeranyl transferase,HGGT)基因导入粳稻品种武育粳3号过量表达。经PCR和RT-PCR分析证明外源基因已导入水稻中并能够在水稻胚乳中表达。HPLC测定结果表明,过表达HGGT后,转基因水稻种子糠层及胚乳中γ-三烯生育酚和总三烯生育酚的含量分别是未转化对照的1.52和1.67倍,且三烯生育酚的积累并未导致总生育酚含量的降低,最终糠层及胚乳中总三烯生育酚与总生育酚的比值分别提高到0.82和1.82,极显著高于(P<0.01)未转化对照(分别为0.54和1.27)。     

发根农杆菌介导丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶1基因RNA干扰载体的转化

目的：利用发根农杆菌ACCC10060介导丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶1基因（SmGGPS1）RNA干扰（RNAi）载体转化丹参叶片,生成SmGGPS1的RNAi转基因毛状根。方法：根据已克隆到的SmGGPS1特异区域设计并合成2段RNAi序列,分别插入RNAi双元载体pK7GWIWG2D（Ⅱ）中,构建2个含卡那霉素（Kan）和绿色荧光蛋白（GFP）双筛选标记的植物表达载体pK7GWIWG2D（Ⅱ）-SmGGPS1-RNAi2和pK7GWIWG2D（Ⅱ）-SmGGPS1-RNAi3;利用带有上述2个RNAi载体的发根农杆菌ACCC10060侵染丹参叶片,诱导生成转基因毛状根;通过Kan抗性筛选和GFP绿色荧光观察统计转化率。结果：分别得到SmGGPS1-RNAi2和SmGGPS1-RNAi3转基因毛状根301根和399根,平均转化率为60.34%。结论：首次建立了发根农杆菌介导的外源基因转化丹参的体系。     

基于叶绿体基因组探讨桃金娘目及其近缘类群的系统发育关系

该研究基于叶绿体基因组数据,对桃金娘目(6科44属97种)及其近缘类群(牻牛儿苗目2科5属25种)的系统发育关系进行了分析.结果表明:(1)桃金娘目基因组大小为152～171 kb,包括的蛋白质编码基因数目为74～90个;牻牛儿苗目基因组大小为116～242 kb,包括的蛋白质编码基因数目为75～132个.(2)对比叶...     

紫杉醇合成关键酶BAPT基因的克隆及原核表达

目的:克隆曼地亚红豆杉紫杉醇生物合成途径中的关键酶3-氨基-3-苯基丙酰转移酶(3-amino-3-phenylpropanoyltrans-ferase,BAPT)基因,并在大肠杆菌中表达.方法:首先提取曼地亚红豆杉细胞的总RNA,反转录获得其sscDNA,并以其为模板扩增BAPT酶的基因,然后将其与原核表达载体pET32a(+)连接,构建重组质粒pET32a(+)-BAPT,并将重组质粒转入E.coli BL21宿主中诱导表达.结果:扩增获得1338 bp的BAPT基因序列,成功构建了原核表达质粒pET32a(+)-BAPT,并在E.coli BL21中实现高效表达.结论:BAPT基因表达产物的分子量约为51 kDa,与预期大小一致.该研究为进一步分析曼地亚红豆杉BAPT酶的酶学特性奠定了基础.     

橡胶树白粉菌(HO-73)启动子WY172不同长度片段的克隆及表达活性分析

旨在克隆橡胶树白粉菌启动子WY172及其上游2K序列上4个不同长度缺失片段,以分析启动子各片段的表达活性。基于实验室前期研究基础,以WY172上游2K序列作为研究对象进行渐变缺失突变,得到4个不同长度的可能具有启动子活性的片段,结合WY172,选用pBI121载体作为骨架,分别替换GUS基因前的CaMV35S启动子,并分别构建重组表达载体,通过ATMT法转化农杆菌;利用GUS染色法和酶活性检测,分析WY172启动子及不同长度片段的酶活性。分别构建了pBI121-WY172、pBI121-WY172Q、pBI121-WY172Q1、pBI121-WY172Q2、pBI121-WY172Q3共5个重组的植物表达载体,所有植物表达载体烟草瞬时表达GUS染色均有蓝色出现,且蓝色程度均强于阳性对照CaMV35S启动子,其中pBI121-WY172Q3的GUS染色相对最深;GUS酶活性测定结果显示所有缺失突变片段都具有调控基因表达的启动子活性,且启动活性均强于CaMV35S启动子,WY172Q3调控GUS基因表达的活性最高。因此我们判断WY172及其上游2K序列上4个不同长度缺失片段均具有启动子活性,其中以WY172Q3启动子片段的表达活性最强。     

转查尔酮合酶基因对烟草花色及花器官的影响

花色是重要的园艺性状,一直是育种工作者苦苦追求的目标。利用植物基因工程技术可定向改良花色。根据已知的CHS序列(序列号M20308.),用PCR方法从拟南芥中克隆CHS基因,并分别将其以正向、反向插入到真核表达载体pBI121,在农杆菌介导下用叶盘转化法转化烟草。对转基因烟草进行检测,结果表明,转基因烟草的花色变淡、花青素含量降低;叶片颜色变浅、叶绿素含量降低。转基因烟草花的形态也发生了明显变异。     

选择标记可去除的植物高效表达载体的构建

在常用的植物组成型表达载体pBI121的选择标记基因NPTII两侧插入同向的lox位点并用多克隆位点(MCS)取代了GUS基因序列,构建了NPTII基因可被去除的和可插入目的基因的通用植物表达载体pBI121-lox-MCS。替换pBI121-lox-MCS中驱动目的基因表达的35S启动子,可构建成一系列具有其他表达特性的植物表达载体,如本文描述的韧皮部特异表达载体pBdENP-lox-MCS。为方便地筛选去除选择标记基因的转基因植物,还构建了绿色荧光蛋白(GFP)表达框与NPTII表达框连锁的pBI121-gfp-lox-MCS载体。上述植物表达载体可广泛应用于培育选择标记可去除的转基因植物。     

香蕉花叶病毒外壳蛋白基因克隆及表达载体的构建

从海南大田感染香蕉花叶病的香蕉叶片 ,获得香蕉花叶病毒 ,提纯其 RNA,在 AMV反转录酶作用下合成 c DNA第一链 ,经 PCR扩增 ,获得一约 70 0 bp的 DNA片段 ,测序结果显示所克隆的 DNA片段包含一完整的香蕉花叶病毒株系 ( CMV-BHI)外壳蛋白基因 ,长度为 6 5 7bp,然后将此 DNA片段 ,分别克隆到p BI1 2 1和 p KHG4质粒 ,构成两个含 Ca MV35 s启动子 ( 5 '-端 )、NOS终止子 ( 3'-端 )和分别含 NPT 标记基因和 NPT 及 HPT标记基因的植物表达载体 ( p TBB和 p TBK)。然后用 p AHC1 8中的 UBI promoter换下p BI1 2 1的 Ca MV35 s promoter,构成 p BIAH;再用 CMV-BHI外壳蛋白基因换下 p BIAH中 GUS基因 ,构成一含单子叶植物启动子 UBI和 NPT 标记基因的植物表达载体 ( p TBBU)。从而为 CMV-BHI外壳蛋白基因在香蕉中表达打下了基础     

辣椒ML基因植物表达载体的构建及其转化

为分析辣椒ML基因在抗辣椒疫病方面的作用,构建了ML基因的植物表达载体pBI121-ML,采用快速冻融法将表达载体导入农杆菌EHA105,并用农杆菌介导法转化辣椒感病品种B12,对得到的转化植株经PCR和RT-PCR分子检测,结果显示,获得了4个辣椒转基因株系.     

影响农杆菌转化效率的植物因子H2A1基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

拟南芥组蛋白H2A1是影响农杆菌T-DNA整合到宿主基因组的关键因素之一。与其它H2A组蛋白一样,它含有1个保守的H2A结构域。本研究利用PCP技术从拟南芥中成功扩增到H2A1基因组序列的全长。产物纯化后克隆到pBI121(Kmr),从而构建了H2A1的植物表达载体pBI121-H2A1。PCR和DNA测序证实载体构建成功。最后用电击法将该重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404菌株中形成工程菌。此表达载体的构建为进一步研究H2A1的功能和提高外源基因在植物中稳定表达水平奠定了基础。     

人参皂苷合成相关βAS基因的克隆及其反义植物表达载体的建立

以发根农杆菌A4菌株诱导的人参发根为材料,用改良的异硫氰酸胍法提取总RNA,得到了纯度好的完整的总RNA。利用RT-PCR扩增了β香树素合成酶基因,测序结果表明该目的片段与Gene Bank上的β香树素合成酶基因序列一致。这一基因重组入克隆载体pMD-119T, 并转化大肠杆菌。 在此基础上,利用pBI121质粒载体,构建了人参β香树素合成酶基因的反义植物表达载体,为这一基因的反义调控研究打下基础。     

康乃馨ACC氧化酶cDNA的克隆及其反义植物表达载体的构建

以康乃馨（Dianthus caryophyllus L.)花瓣为材料,用改进的异硫氰酸胍一步法提取总RNA,根据已报道的康乃馨ACC氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,CO)基因的序列设计产合成一对引物,通过RT-PCR方法获得一约1.2kb特异片段,把该片段连接pGEM^(R)-Teasy vector上进行测序,其全长共1156bp,编码区915bp。共编码304个氨基酸残基,序列分析结果表明该序列与GenBankL35152中的康乃馨ACC氧化酶基因的cDNA序列完全相符,推断该基因在康乃馨种内可能是完全或高度保守的,随 后将此片段反向插入植物表达载体pBI121的35S启动子和NOS终止子之间,构建了一反义植物表达载体pBO;又把花特异表达启动子PchsA插入pBI121的HindⅢ Xbal位点构建中间载体pGHB,再把康乃馨ACC氧化酶基因反向插入中间载体pCHB的XbaI Satl位点构建成另一反义植物表达载体pCBO。