慢病毒载体感染成年食蟹猴骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有增殖和多向分化潜能,临床应用广泛,近年来备受关注。另一方面,MSCs易于转导和表达外源基因,是理想的基因工程细胞。非人灵长类(NHPs)和人类具有非常相近的遗传背景,NHPs模型在评价药物疗效和移植治疗等方面具有不可替代的价值。本研究采用密度梯度离心法分离成年食蟹猴骨髓单核细胞(Marrow mononuclear cells,MNCs),贴壁培养MSCs。同时构建表达绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的慢病毒载体,感染成年食蟹猴MSCs。结果显示,体外培养的成年食蟹猴MSCs均感染猴泡沫病毒(Simian foamy virus,SFV),体外培养成年食蟹猴MSCs必须添加抗病毒药物Tenofovir。但由于食蟹猴MSCs感染SFV,以及培养中添加了抗病毒药物Tenofovir,慢病毒载体的感染效率明显降低(10%)。本研究通过停用抗病毒药,在细胞复苏后6d转染慢病毒,可大幅提高慢病毒的感染效率(50%)。为成年食蟹猴MSCs作为基因工程细胞应用于实验和临床研究提供了技术保证。     

多模式追踪食蟹猴骨髓间充质干细胞

近年来, 在细胞治疗和再生医学领域, 自体或异体细胞移植治疗疾病正在成为现实. 骨髓间充质干细胞具有分化成多种细胞的潜能, 已被广泛用于各种疾病的研究和治疗. 活体追踪移植细胞, 检测移植细胞的生存及功能状态对于评价移植治疗效果至关重要. 目前, 利用磁共振对比剂超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO), 活体追踪和监测标记细胞已被广泛用于动物实验研究和一些临床疾病诊断. 但 MRI 信号不能显示移植细胞在体内的生物学特征. 本研究中, 对食蟹猴骨髓间充质干细胞体外标记Molday ION rhodamine-B^TM(MIRB), 探讨MIRB 标记后cMSCs 的细胞生物学特性, 以及脑内移植后的活体MRI 影像学及组织学追踪. 结果表明, MIRB 具有生物组织相容性, 能高效标记cMSCs, 可用于体内多模式追踪移植细胞, 为利用MIRB 追踪和检测移植细胞, 以及干细胞移植治疗机制的研究提供资料.     

GDNF慢病毒载体感染食蟹猴骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是基因工程和细胞治疗的种子细胞之一,本研究利用含胶质源性神经营养因子(glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)基因的慢病毒载体感染成年食蟹猴MSCs,探讨转染后GDNF在MSCs中的体外表达水平及其影响因素。首先,通过密度梯度离心法分离食蟹猴骨髓单核细胞(marrow mononuclear cells,MNCs),体外培养食蟹猴MSCs。同时构建表达GDNF的慢病毒载体,并感染食蟹猴MSCs,分别利用酶联免疫吸附(ELISA)方法和Real-time PCR方法,测定感染不同拷贝数病毒和不同转染组细胞GDNF的蛋白分泌水平和基因表达水平。实验结果显示,表达GDNF基因的慢病毒载体成功转染成年食蟹MSCs,体外培养的MSCs持续表达分泌GDNF。感染慢病毒的拷贝数可以影响GDNF分泌水平,相同条件下感染拷贝数越高,GDNF分泌量越多,其基因表达水平越高。     

人脐带间充质干细胞食蟹猴连续静脉输注后免疫毒性与免疫调节作用研究

该文旨在研究人脐带间充质干细胞在食蟹猴体内的免疫毒性与免疫调节特性。连续14天给予食蟹猴不同剂量(2.0×10~6个·kg~(-1)和2.0×10~7个·kg~(-1))的人脐带间充质干细胞静脉滴注,检测食蟹猴血清IgG浓度、抗人脐带间充质干细胞抗体、淋巴细胞活化增殖和T细胞亚群的变化,以及胸腺和脾脏组织学变化。结果显示,连续14天静脉给予人脐带间充质干细胞对食蟹猴血清IgG浓度无影响,不刺激动物产生抗人脐带间充质干细胞抗体。人脐带间充质干细胞显著抑制食蟹猴淋巴细胞的活化增殖,降低CD3~(+)T细胞比例,刺激Treg细胞的增殖分化。组织学检查发现,部分动物出现与给药相关的胸腺皮质萎缩和脾脏淋巴生发中心增多增大。该研究得出,人脐带间充质干细胞的免疫毒性极低,静脉输注后不引起食蟹猴体内免疫排斥等异常反应,提示其在临床上异体应用的安全性。     

食蟹猴胚胎干细胞向间充质前体细胞诱导分化及鉴定

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可以诱导分化成脂肪、软骨、骨骼和骨骼肌细胞,并可作为骨骼、软骨或肌肉移植中的再生干细胞,广泛应用于细胞治疗和组织工程。胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)具有体外培养无限增殖和多向分化的特性,能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。该研究通过无血清条件下诱导食蟹猴ESCs形成类胚体(embryoid bodies,EBs),然后在血清条件下贴壁分化EBs成间充质前体细胞(mesenchymal precursor cells,MPCs),再经过长期体外培养,纯化和扩增MPCs。结果显示,纯化后的MPCs具有MSCs生物学特征,并能在体外诱导分化成脂肪细胞和骨细胞。将这些细胞皮下注射给SCID小鼠,并未发现形成肿瘤,提示食蟹猴ESCs来源的MPCs具有一定的安全性。     

菲立磁标记食蟹猴骨髓间充质干细胞的脑内移植示踪研究

中枢神经系统损伤后的再生修复问题一直是神经科学领域关注的重点之一,骨髓间充质干细胞移植治疗拓宽了人类中枢神经系统损伤的治疗前景,而非侵入性的磁共振成像能活体追踪移植细胞,评价移植效果。应用菲立磁标记食蟹猴骨髓来源的间充质干细胞,在脑立体定位仪引导下,自体脑内移植。结果显示,菲立磁标记间充质干细胞的有效率高达90%以上,移植区磁共振影像呈明显的低信号改变。标记的间充质干细胞移植后在脑内存活,并向周围的脑实质内迁移。移植8周后,发现移植细胞通过血管向对侧脑部迁移,但并未发现移植细胞向神经细胞分化。这些结果提示,菲立磁可用于标记、追踪脑内移植的食蟹猴骨髓间充质干细胞,标记的移植细胞可在脑内存活、迁移。     

Reconstitution of Telomerase Activity Extends the Proliferative Life-span and Maintains the Neurogenetic Potential of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Fetal Muscle

目的 :通过重建端粒酶活性延长胎儿肌肉源间充质干细胞寿命 ,并对其成神经潜能进行研究 ,为组织工程神经修复提供种子细胞。方法 :将人端粒酶催化亚基 (hTERT)基因通过脂质体转染法导入胎儿肌肉源间充质干细胞 ,RT PCR检测hTERTmRNA的表达 ,TRAP PCR检测细胞端粒酶活性。用bFGF诱导已重建端粒酶活性的肌肉源间充质干细胞向神经细胞分化 ,免疫荧光及免疫印迹法检测分化情况。结果 :转染hTERT的胎儿肌肉源间充质干细胞能稳定表达端粒酶活性。转染后传 75代的细胞经bFGF诱导仍维持着自我更新及向神经细胞分化的潜能 ,且无恶性转化倾向。结论 :重建端粒酶活性可延长胎儿肌肉源间充质干细胞寿命并维持自我更新及成神经潜能 ,为建立组织工程标准细胞系提供了新的实验手段     

软骨细胞上清液诱导冻存复苏后人骨髓间充质干细胞的研究

目的:探讨人软骨细胞培养上清诱导冻存人骨髓充质干细胞向软骨细胞分化的可行性.方法:取进行全髋关节置换术老年患者的骨髓和软骨组织,利用密度梯度离心法、全骨髓培养法分别培养骨髓间充质干细胞,冻存备用.培养软骨细胞,观察细胞生长,收集软骨细胞培养上清.复苏冻存的人骨髓间充质干细胞,观察复苏后细胞生长状态.利用收集的软骨细胞培养上清对复苏间充质干细胞进行定向诱导,诱导培养2周,观察细胞外观表型变化,Ⅱ型胶原免疫组化检测诱导后人骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原的表达.结果:密度梯度离心法与全骨髓培养法均可分离获得人骨髓间充质干细胞,原代生长前者优于后者.复苏细胞仍进行可传代,与正常生长骨髓间充质细胞无明显差异,均可传至第8代.软骨细胞培养上清诱导2周后,细胞形状向圆形,多角形转变,冻存骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原免疫组化检测Ⅱ型胶原表达阳性.结论:老年人骨髓间充质干细胞仍具有向软骨细胞转化的能力,冻存不影响其转化能力.     

食蟹猴肺上皮细胞株MFLE-001的建立及生物学特性研究

该研究建立了食蟹猴肺上皮细胞株并鉴定其生物学特性。以食蟹猴肺部组织进行原代培养,用差速贴壁法纯化细胞株,并通过倒置显微镜、透射电镜、扫描电镜观察,绘制生长曲线,进行核型分析以及肺上皮标志物检测等方法研究其生物学特性。结果显示,体外培养细胞生长均一、稳定,细胞倍增时间为4.8天,免疫组化CK(+)、CK-7(+)、波形蛋白(+),染色体分析表明,具有正常2倍染色体数目(2n=42),符合食蟹猴肺上皮细胞株特性。该研究成功建立第一株食蟹猴肺上皮细胞株,命名为MFLE-001,为肺部疾病研究和药物筛选提供了理想的体外实验模型。     

猪骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

目的:建立猪骨髓间充质干细胞(pMSCs)体外分离培养、纯化和鉴定的方法,为下一步实验研究奠定基础.方法:采用密度梯度离心法获得骨髓单核细胞,接种后形成单层贴壁的成纤维样细胞.免疫荧光及PCR检测细胞表面标志及多能性基因的表达,并鉴定分离细胞的多向诱导分化潜能.结果:体外培养的原代细胞10天达到融合,传代后仍具有成纤维样的形态;免疫荧光结果见波形蛋白(Vimention)和Oct4标记阳性,CD45阴性;PCR分子检测见多能性基因OCT-4,nanog的表达;细胞具有分化为成骨细胞和成脂细胞的能力.结论:采用密度梯度离心法获得的pMSCs体外增殖能力强,纯度高,具有间充质干细胞的特性,pMSCs分离培养体系的成功建立为下一步实验研究奠定基础.     

骨髓间充质干细胞在组织工程研究中的应用新进展

骨髓间充质干细胞又称为骨髓源性间充质干细胞,是指存在于骨髓基质细胞系统中的一类干细胞,具有高度稳定的体外扩增能力和多向分化潜能等特点。骨髓间充质干细胞因其取材方便,易于分离和培养,以及在适当条件下可诱导分化为皮肤、骨骼、内脏、血液、神经等多种组织细胞的独特优势,目前被广泛应用于药物开发、免疫调节、组织修复、器官重建等多个研究领域。近年来,骨髓间充质干细胞作为种子细胞在组织工程领域有着非常诱人的潜在应用前景。本文就骨髓间充质干细胞在组织工程学研究中应用的最新进展作一综述。     

猫骨髓间充质干细胞的体外分离培养、纯化、鉴定

目的:分离、培养、纯化家猫的骨髓间充质干细胞,并对获得细胞的表面标志物进行鉴定,为进一步利用骨髓间充质干细胞的细胞移植实验奠定基础。方法:采用全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化家猫骨髓间充质干细胞,通过多次更换培养液获得较纯化的骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜下对细胞形态进行观察;根据第1、3、5、7、9代细胞的镜下增殖情况绘制出生长曲线;通过流式细胞仪检测细胞表面标志抗原CD34、CD44和CD90的表达率。结果:在倒置相差显微镜下观察,分离培养的骨髓间充质干细胞贴壁呈梭形或纺锤形;原代细胞生长丛集成片,5~7 d达到融合,进行传代;培养到第三代以后,细胞出现相对均匀的梭形扁平外观,迅速增殖的细胞呈涡流样排列;第3、5代骨髓间充质干细胞增殖能力强于第7、9代;采用流式细胞仪分析结果显示细胞的CD34、CD44和CD90阳性率分别为17.5%、97.9%和91%,这与骨髓间充质干细胞表面抗原的表达一致。结论:分离培养的细胞具有骨髓间充质干细胞特性,成分相对单一,第3、5代细胞纯度高,增殖能力强,适用于进一步的实验研究。     

表达神经营养因子Neurturin的骨髓间充质干细胞的构建及体外活性检测

研究神经营养因子Neurturin(NTN)在由于神经元损伤而造成的神经退行性疾病中对神经元的保护和修复作用。利用重组腺病毒载体将NTN基因转入恒河猴骨髓间充质干细胞(rMSC),通过RT-PCR、IF及Western blot方法检测NTN的转录和表达,并采用鸡胚背根神经节体外培养实验和胚胎大鼠中脑多巴胺能神经元存活实验对NTN进行体外活性检测。结果表明NTN在rMSC中稳定表达和分泌,并具有体外生物学活性,为由于神经元损伤造成的神经退行性疾病的干细胞移植治疗奠定了一定的基础。     

IL-10在人骨髓间充质干细胞移植治疗食蟹猴脑缺血中的作用

目的探讨食蟹猴脑缺血模型在人骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells,hBMSCs）移植后IL-10的表达及其对脑缺血损伤的保护作用。方法食蟹猴8只,在脑定位仪定位下,应用光化学法构建食蟹猴脑缺血模型,并将其随机分为高剂量治疗组、低剂量治疗组和模型组,分别在脑缺血部位附近注射高、低密度的hBMSCs和生理盐水。手术后,通过影像学、神经功能评分及组织病理学观察对hBMSC的治疗效果进行评价。并应用原位细胞凋亡检测的方法观察脑缺血周围神经细胞的凋亡情况。应用免疫组织化学、RT-PCR以及real-time PCR法检测检测脑损伤周围IL-10的表达水平。结果与模型组相比,hBMSC治疗组损伤部位周围细胞凋亡明显减少,免疫组织化学显示[L-IO阳性细胞的数量及染色强度均较模型组明显升高,IL-10在mRNA水平表达也明显升高。结论hBMSCs对食蟹猴脑缺血模型具有修复作用,其治疗机制可能与促进炎症抑制因子IL-10的表达有关。     

HSV-1感染大鼠骨髓间充质干细胞及形成潜伏感染的初步研究

在体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察单纯疱疹病毒1型感染骨髓间充质干细胞情况.分离并鉴定BMSCs;HSV-1感染BMSCs,观察细胞病变(CPE);建立BMSCs的HSV-1潜伏感染模型.提取总DNA,PCR法扩增BMSCs内的HSV-1特异性片段,检测HSV-1感染BMSCs及潜伏感染.结果显示骨髓间充质干细胞经14d诱导后,碱性磷酸酶含量增高、形成钙结节,表现出成骨细胞特性.HSV-1感染BMSCs,出现典型的CPE,PCR法证实BMSCs内存在HSV-1的特异性片段.HSV-1潜伏感染的BMSCs,未出现明显的CPE,细胞传至7代,仍可测到HSV-1的基因片段,表明BMSCs有可能形成HSV-1的潜伏感染.大鼠骨髓间充质干细胞在体外可以向成骨细胞方向分化,可作为组织工程学的种子细胞.HSV-1可以在体外感染骨髓间充质干细胞并有形成潜伏感染的趋势.     

恒磁场抑制缺血缺氧条件下大鼠骨髓间充质干细胞凋亡

目的:研究恒磁场对体外缺血缺氧培养条件下大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs) 凋亡的影响并探讨其作用机制.方法:采取大鼠骨髓,以密度梯度离心分离出单个核细胞(MNCs),于体外培养并由牛垂体提取物(PEX)诱导扩增传代培养出骨髓间充质干细胞(MSCs).经形态学和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定后,将骨髓间充质干细胞(BMSCs)在缺血缺氧条件下培养,通过TUNEL检测比较不同组别细胞的凋亡率和蛋白印迹法(western blot)来观察细胞中特定蛋白质的变化.结果:①经形态学观察和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定,提示骨髓间充质干细胞培养成功.②缺血/缺氧组与缺血/缺氧+磁场组比较,缺血缺氧组的凋亡率显著性增加,Akt磷酸化水平显著上升(P＜0.05).提示恒磁场可以使PI3K(Phosphoinositide-3kinase)/Akt(ProteinkinaseB,PKB)信号通路被激活而抑制凋亡的发生.结论:恒磁场通过激活PI3K/Akt信号通路抑制体外缺血缺氧条件下培养的骨髓间充质干细胞的凋亡.     

猪骨髓间充质干细胞的分离培养及核移植后重构胚胎发育能力的研究

不同类型的细胞核移植效率不同,原因之一可能是不同类型细胞核移植后进行重编程的潜力不同.本实验对猪骨髓间充质干细胞(porcine bone marrow mesenchymal stem cells,pMSCs)体外分离培养的方法进行了优化.对猪骨髓间充质干细胞的增殖及生长特性进行了观察分析,并以其作为供体细胞进行核移植,对此类型细胞进行重编程的潜力进行了评估.结果表明用密度梯度离心法分离猪骨髓间充质干细胞优于全骨髓贴壁法:猪骨髓间充质干细胞数目在培养第6天达到峰值,传代培养10 h时,贴壁率达到78.50%;传代培养后第4天分裂指数最高,为24.00‰;以猪骨髓间充质干细胞(pMSCs)和猪胎儿成纤维细胞(PF)分别作为供核细胞构建核移植胚胎,其体外囊胚发育率分别为14.63%与15.07%(P＞0.05),孤雌对照组囊胚发育率为30.91%(P＜0.05);而三组囊胚细胞数分别为30.67±17.7、24.1±6.5和25.8±11.4(P＞0.05).实验表明,体外培养的猪骨髓间充质干细胞生长增殖旺盛,生物学性状稳定.并适合作为核移植供体细胞.     

人骨髓间充质干细胞脑内移植对食蟹猴脑出血的治疗作用

目的评价人骨髓间充质干细胞脑内移植对食蟹猴脑出血模型的治疗作用。方法符合普通级标准的成年食蟹猴12只,用自体股动脉抗凝血脑内注射方法建模后1周,用脑立体定位法在血肿周围植入人骨髓间充质干细胞,细胞数分别为高剂量5×106、低剂量1×106、对照组等体积生理盐水。利用MRI、PET、神经功能缺损评分和组织病理学对干细胞移植效果进行评价。结果神经功能评分显示干细胞移植1周后动物神经功能明显改善。PET结果显示干细胞移植后2周高剂量组血肿周围皮层、基底节核团的SUV%值与对照组间存在显著性差异(P=0.02)。移植后3周高、低剂量组血肿周围皮层、基底节核团的SUV%值与对照组间差异存在显著性(P值分别为0.03和0.04)。MRI显示剂量组血肿吸收速度大于对照组。病理检查可见剂量组坏死灶面积小于对照组,出血灶周围有大量新生血管生成,剂量组与对照组间差异存在显著性(P<0.01)。结论在损伤脑组织周围移植hBMSC可促进食蟹猴损伤神经组织的恢复,为hBMSC治疗脑出血的临床应用提供了重要实验依据。     

不同干预时间正弦电磁场对大鼠骨髓基质干细胞成骨性分化的影响

目的:研究不同治疗时间正弦电磁场(50 Hz,1.8mT)对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞成骨性分化的影响,筛选出最佳临床治疗时间.方法:采用贴壁筛选法培养原代大鼠骨髓间充质干细胞,每天在频率为50 Hz,强度为1.8 mT的磁场环境中处理0.5 h、1.0h、1.5 h、2.0h和2.5h;同时设立未经电磁场处理的细胞作为对照组.于处理后的第3 d、6d、9d和12 d分别测定细胞碱性磷酸酶活性、骨钙素分泌量、钙化结节数以及Ⅰ型胶原表达量,并比较各组间差异;于处理后12 h提取细胞总RNA,用RT Real-Time PCR法检测成骨性分化基因Osterix表达情况.结果:正弦电磁场干预1.0h能明显促进骨髓间充质干细胞的成骨性分化,表现在该组的碱性磷酸酶活性、骨钙素分泌量、钙化结节数、Ⅰ型胶原表达量以及成骨性分化基因的表达量最高,亦显著高于对照组(P＜0.05).结论:50Hz、1.8mT强度的正弦电磁场能促进骨髓间充质干细胞的成骨性分化,以作用1.0h成骨效果最为明显.     

表皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞向视网膜神经细胞分化的体外研究

目的:研究表皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞向视网膜神经细胞分化的可能性。方法:体外培养骨髓间充质干细胞,利用流式细胞仪分析其细胞表型。采用含EGF的培养液诱导骨髓间充质干细胞向视网膜神经细胞分化,并利用免疫荧光法进行鉴定。结果:从骨髓中分离培养的细胞具有成纤维细胞样形态,贴壁生长,表型相对均一,表面标志为CD90、CD44、CD147阳性;而CD34、CD38、CD45、CD14、HLA-DR阴性。体外诱导后可以得到神经干细胞标志物nestin、神经胶质细胞标志物GFAP和视网膜光感受器细胞标志物Rhodopsin呈阳性表达的细胞。结论:从骨髓中分离培养得到的间充质干细胞具有向视网膜神经细胞分化的潜能。