miRNAs对阿尔茨海默病淀粉样蛋白产生和tau蛋白代谢作用的研究进展

microRNA(miRNA)是一类长约为22 nt的小分子非编码单链RNA,由独立的非编码区RNA或蛋白编码基因的内含子转录而来,通过与其靶mRNA的3’非翻译区结合引起靶mRNA抑制发挥调节作用。近年来,miRNA在阿尔茨海默病中的角色引起广泛关注,本文从miRNA对β淀粉样蛋白和tau蛋白的影响两个方面总结了最新研究进展,以期为相关研究者提供参考。     

人基因组中Alu家族顺序的提取与鉴定

应用先分离反向重复顺序的方法,从人的DNA中是取含Alu家族的顺序,它们是分散在整个基因组中。应用分子杂交技术,证明恒河猴有类似顺序,用含α-珠蛋白基因的重组质粒pBR酶切后鉴定,证明Alu家族顺序存在于α-珠蛋白编码基因部分的下游HinC-Ⅱ-EcoRI酶切点之间。     

微小RNA在肾脏及其相关疾病中的调控作用

微小RNA(miRNA)是细胞内源性的一种非编码的RNA,可表达出原始miRNA转录物(pri-miRNA),较大的primiRNA经一种RNA内切酶Ⅲ(Drosha)和辅助因子Pasha(含有双链RNA结合区域)加工成单链miRNA前体,随后具有发卡结构的单链miRNA前体在细胞质中被双链RNA专一性RNA内切酶(Dicer)切割成约22 nt的miRNA.成熟的miRNA中的一条单链与RNA诱导的沉默复合体(RNAinduced silencingcomplex,RISC)结合,形成RISC复合体.通过与靶基因mRNA的3'非翻译区(3'UTR区域)的碱基完全或不完全配对,导致mRNA降解或mRNA翻译抑制,即转录后基因沉默[1].     

长链非编码RNA对创面愈合调控作用的研究进展

非编码RNA (non-coding RNA,ncRNA)是不被翻译为蛋白质,但具有功能的一类RNA分子,其在哺乳动物基因组中占额达98%,参与并调控细胞增殖、分化和凋亡等生物过程[1-4].长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度大于200 nt的非编码RNA分子,定位于细胞核或细胞质内,从表观遗传、转录水平和转录后水平等多种层面调控基因表达.目前,人体中已发现大约9 000多种,小鼠体内发现6 000多种,约占ncRNA的80%[5-6].根据lncRNA在基因组上相对于编码基因的位置,将lncRNA分为5类:正义(sense)lncRNA、反义(antisense)lncRNA、双向(bidirectional)lncRNA、内含子(intronic)lncRNA和基因间(intergenic)lncRNA,其功能由所处位置决定.     

miRNA在造血调控及白血病中的作用

生物体内除了编码蛋白质的基因外,还包括转录非编码RNA的基因,准确地说,非编码RNA是指除了成熟mRNA编码区以外的其他RNA及RNA片段。但是,现在普遍认为,非编码RNA是指细胞内除了成熟mRNA分子以外的所有独立存在的RNA分子。与编码mRNA相比,非编码mRNA没有多聚腺苷酸尾巴(Poly A)。近年来的研究表明,这些非编码RNA分子并非体内的“垃圾”,而是有着非常重要的调节功能。它们有很多种类,如m icroRNA、piRNA、siRNA、snoRNA等。其中,m icroRNA(m iR-NA)是一类长度约为22 nt的内源性单链短序列非编码小RNA,是通过体外进化的选择性扩增机制产     

人β-珠蛋白小分子RNAs调控γ-珠蛋白基因表达及开关机制研究

目的从RNA角度研究珠蛋白基因表达调控,探讨人γ-珠蛋白向β-珠蛋白转换的分子机制,为β-珠蛋白生成障碍性贫血的分子治疗提供新靶位,并为诱导肿瘤细胞分化治疗肿瘤提供依据。方法通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)比较白血病和非白血病患者外周血白细胞血红蛋白基因分子水平的差异,将β-珠蛋白基因转染K562细胞,运用噻唑蓝比色法、细胞流式分选等技术检测β-珠蛋白基因对K562细胞增殖、细胞周期与凋亡的影响,通过Western blot及RT-PCR分别从蛋白质水平和mRNA水平分析其调控γ-珠蛋白基因表达的作用,同时运用生物信息学预测人β-珠蛋白基因可以产生具有基因表达调控作用的小分子RNAs。结果白血病患者血红蛋白A1、血红蛋白B、血红蛋白E1、细胞珠蛋白、脑红蛋白的mRNA表达均显著低于非白血病患者(P<0.05)。β-珠蛋白基因能以时间依赖的方式诱导K562细胞增殖受抑,并在第7天达到最佳时间效应。用RT-PCR检测转染后K562细胞α、β、γ-珠蛋白等mRNA的表达,发现β-mRNA上升导致转染后的K562细胞γ-珠蛋白表达下调,同时α-珠蛋白表达上调;β-珠蛋白基因可能产生作用于γ-珠蛋白的小分子RNA,符合条件的二级结构在热力学上稳定,空间位阻也在一定范围内。结论白血病患者外周血白细胞珠蛋白基因低表达,β-珠蛋白基因能以时间依赖的方式诱导K562细胞增殖受抑,其高表达可诱导K562细胞增殖受抑和凋亡,并抑制K562细胞γ基因表达,通过小分子RNAs调控γ-珠蛋白基因表达沉默,有助于揭示人γ-珠蛋白向β-珠蛋白转换的基因表达调控及开关机制。     

hURAT1基因真核表达重组体的构建及意义

目的 构建pcDNA3.1(-)/hURAT1真核表达重组体.方法 提取人全血基因组DNA,进行PCR扩增,将纯化的扩增产物与表达载体pcDNA3.1(-)连接后转化DH5α感受态细胞.重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后,应用核苷酸序列测定方法进行鉴定.结果 PCR扩增得到hURAT1第2外显子至第5内含子长1 958 bp的基因片段.该片段与表达载体pcDNA3.1(-)连接后转化DH5α感受态细胞.重组质粒经酶切和核苷酸序列测定方法鉴定,证实hURAT1片段插入序列和方向正确.结论 hURAT1基因组DNA片段插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的序列和方向正确,可用于后续基因功能研究,尤其是编码序列和内含子序列变异的功能研究.     

过氧化物酶体增殖因子激活受体α激动剂抗肿瘤的研究进展

1 PPARα的结构和特性PPARα是第1个被鉴别出来PPAR的亚型,人PPARα(NR1C1)位于22号染色体长臂(22q12-q13.1),长约93.2kb,编码的mRNA包含8个外显子,第1、2外显子和部分3外显子编码5'非翻译区,第8外显子的后232个碱基编码3'非翻译区,其余的是翻译区,编码468个氨基酸组成的蛋白,相对分子     

C-反应蛋白与血栓形成的研究进展

1 C-反应蛋白的结构及生物学特性 1.1 CRP的基因结构：其人的编码基因位于1号染色体长臂上（1q21-1q23）,长约2.3kb,有2个外显子和1个内含子。第一个外显子编码一个信号肽,第二个外显子是编码成熟蛋白质的氨基酸。内含子为278个核苷酸的GT重复序列。而该内含子使编码区的信号肽（第一个外显子）与编码区的成熟蛋白（第二外个显子）隔开。CRP基因表达主要在转录水平调控,主要由IL6,IL1,TNF-α及其它细胞因子调控。     

MicroRNA与恶性淋巴瘤相关性研究进展

真核生物中存在着2种主要的小分子非编码RNA(non-coding RNA),一种是小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),另一种是微小RNA(microRNA,miRNA).siRNA是一类长约21～25 nt的双链RNA,其3'端带有2nt的凸出,在RNA干扰(RNA interference,RNAi)中具有广阔的应用前景.而miRNA是一类长约22nt的非编码RNA,它是由长60～110nt,带有发夹结构的前体miRNA剪切而成.这些miRNA能够识别特定的目标mRNA,并在转录后水平通过促进靶mRNA的降解和(或)抑制翻译过程而发挥负调控基因表达的过程,并与个体发育、干细胞分化和疾病发生密切相关.据计算机推测人类基因组可能存在     

MicroRNAs在干细胞的表达及其成骨分化中作用

微小RNA(miRNA)是一类内源性、长约22nt的非编码单链RNA分子,通过与靶mRNA特异性的结合导致靶mRNA降解或抑制其翻译,对基因进行转录后调控。本文就microRNA在干细胞中的表达特点及其作用、microRNA在干细胞向成骨定向分化扮演的角色以及microRNA成骨细胞增殖分化过程中的调控机制等方面的进展予以综述。     

人工反义基因对HLF细胞α1（Ⅰ）胶原基因表达的抑制作用

目的 研究纤维增生性疾病与Ⅰ型胶原蛋白异常表达的关系。方法 通过构建人工反义α1(Ⅰ）胶原基因真核表达质粒,探索反义RNA对人胚肺成纤维细胞（HLF细胞）α1(Ⅰ）胶原基因表达的抑制作用。结果 含有第Ⅰ内含子与第Ⅲ外显子区域的反义α1(Ⅰ）胶原基因片段的真核表达质粒能够在转录和翻译两个水平抑制α1(Ⅰ）胶原基因的表达。其中mRNA水平的抑制率为56．84％;蛋白水平的抑制率为54．24％。结论 反义RNA能够在转录和翻译两个水平抑制HLF细胞α1(Ⅰ）胶原基因的表达。     

乙型肝炎病毒核心基因克隆及其重组体的构建

【目的】构建含乙型肝炎病毒 (HBV)编码核心蛋白 (HBcAg)的核心 (C)基因的真核表达重组体 ,以进行核酸免疫及相关研究。【方法】以含HBV(ayw亚型 )全基因序列的质粒pHBV1为模板 ,用PCR的方法获得编码HBcAg的C基因片段(nt1889～ 2 45 7) ,该基因片段两端设计了BamHⅠ和EcoRⅠ的限制性内切酶位点 ,以便通过定向克隆将其插入真核表达质粒载体pcDNA3相应的多克隆位点。【结果】经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,以及重组体插入片段的DNA序列测定 ,证实成功地构建了含C基因的真核表达重组体pcDNA3 HBc。【结论】pcDNA3 HBc的构建成功为研究其表达及进行动物免疫研究提供了物质基础。     

层流切应力通过miRNAs抑制内皮细胞增殖

血管内皮细胞功能与心血管疾病发生及发展关系密切,血管内层流剪切应力由于血流层流与血管壁摩擦产生,可减少内皮细胞炎症发生及抑制内皮细胞增殖。微RNA(miRNA)是一系列高度保守非编码家族性小RNA,可在基因转录后水平调节目标信使RNA(mRNA)基因表达,参与调控血管内皮细胞功能。目前认为剪切应力可通过调控miRNA表达,从而发挥对血管内皮细胞功能调节作用。其中层流切应力可上调miR-19A、miR-101等发挥影响细胞周期进而抑制内皮细胞增殖已得到证实。     

Gi蛋白真核表达载体的构建及表达检测

目的:克隆抑制腺苷酸环化酶G蛋白(Gi蛋白)3个亚基α、β和γ基因,构建pEYFP-N-Giα1和pECFP-C-Giβ1-γ2真核表达载体,完成其在真核细胞中的表达检测.方法:培养肝癌细胞HepG2,提取总RNA后反转录成cDNA,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增α、β和γ的编码基因,在α亚基两端添加酶切位点,在β和γ亚基两端分别添加酶切位点和连接肽,经酶切和连接得到Giα1和Giβ1-γ2,再将Giα1和Giβ1-γ2基因分别构建到荧光蛋白报告载体pEYFP-N1和pECFP-C1中,利用脂质体法将真核表达载体转染到肝癌细胞中,激光共聚焦显微镜观察分析其表达活性.结果:PCR扩增获得Gi蛋白α、β和γ亚基的编码基因,在两端添加酶切位点和连接肽后获得的Giα1和Giβ1-γ2基因,成功构建了pEYFP-N-Giα1和pECFP-C-Giβ1-γ2真核表达载体,并在肝癌细胞中实现其真核细胞表达.结论:成功构建Gi蛋白的真核表达载体,并鉴定其在活细胞中具有表达活性.     

CD59基因的亚克隆

目的"构建pUC18-α珠蛋白DNA-CD59cDNA重组分子. 方法"采用人心肌组织作为RNA的来源,经RT-PCR扩增得到CD59基因的cDNA片段.以pUC18质粒为载体;人α-珠蛋白DNA为启动子,并提供polyA+尾巴;以编码全部CD59蛋白质的核苷酸序列的cDNA作为目标基因,三者拼接成重组分子. 结果"经酶切鉴定,重组分子拼接成功. 结论"该重组分子可作为转基因构件,经微注射输入供体动物受精卵细胞内,建立人CD59转基因动物模型.     

K562细胞7种珠蛋白基因mRNA水平的研究

目的：研究K562细胞α、β、Gγ、Aγ、ζ、ε、δ珠蛋白基因mRNA水平。方法：采用RT-PCR在相同条件下同时扩增成功7种珠蛋白mRNA，比较K562细胞内各珠蛋白mRNA水平。结果：α基因簇中α-mRNA水平明显高于ζ-mRNA,β基因簇mRNA表达水平依次为Gγ、Aγ、ε、δ，K562细胞不表达β-珠蛋白mRNA。结论：转录后水平的调控可能在K562细胞α基因簇的表达中起重要作用，β-基因簇各珠蛋白mRNA水平和蛋白质水平基本相符。     

体内合成人血红蛋白转移基因鼠

将人α-珠蛋白及β-珠蛋白基因分别融合于两个红细胞系特异性的Ⅰ型脱氧核糖核酸酶(DNAase)超高敏感的游区位点。此位点正常位于人β-珠蛋白基因的上游50千对碱基。将这两个构造物同时注入鼠的受精卵内,并在发育的转移基因动物中分析其表达情况。具有完整的转移基因拷贝的小鼠在红细胞组织中特异表达了高水平的正确启动的人α-珠蛋白及β-珠蛋白信使RNA。在成年人的红细胞中形成了     

东南亚型遗传性胎儿血红蛋白持续增多症或东南亚型β°-地中海贫血

目的:弄清过去所发现遗传性胎儿血红蛋白持续增多症(HPFH)的类型和分子机制.方法:用血红蛋白淀粉-琼脂混合凝胶电泳检出胎儿血红蛋白(HbF)增多、醋酸纤维膜电泳洗脱定量、酸洗脱法观察HbF在红细胞中分布、β珠蛋白基因族中基因缺失情况的分析、Southern Blot、Gγ启动子-158附近情况的分析(酶切,测序)、单体型分析、α珠蛋白基因数目的研究等.结果:与一般HPFH不同,此例是β珠蛋白基因缺失、δ珠蛋白基因存在.缺失的全长约为27kb,包括整个β珠蛋白基因和它的3'HS1区.先证者的α珠蛋白基因型为:ααα/αα、其父亲为αα/αα.结论:此例HPFH为东南亚型,属于β.地中海贫血范畴.特殊之处是多出一个α珠蛋白基因,患者HbF显著增高的原因可能与此有关.     

人过氧化物酶体增殖体激活受体γ2基因克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆人过氧化物酶体增殖体激活受体γ2 ( hPPARγ2)基因及构建其真核表达重组体,为进一步研究该基因打下基础.方法采用RT-PCR方法从中国人网膜脂肪垫总RNA中扩增出hPPARγ2 cDNA全长基因,将全长hPPARγ2cDRA定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )中,筛选出阳性克隆.通过限制性内切酶酶切和核苷酸序列测定进行鉴定.结果克隆出全长hPPARγ2cDNA序列与GeneBanK序列相同,真核表达质粒经限制性内切酶酶切后获得的片段大小与理论值一致.结论成功地克隆了hPPARγ2 cDNA,并构建了真核表达重组体.