酿酒酵母醛酮还原酶的克隆表达和酶学性质研究

从酿酒酵母(Saccharom yces cerevisiae)CICC 1002基因组中克隆获得醛酮还原酶基因,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中实现过量表达.重组醛酮还原酶经Ni-NTA亲和层析分离纯化获得高纯度目的蛋白,并对其进行酶学性质表征.该重组酶经SDS-PAGE检测为单一条带,分子量为38 kDa.该酶的最适pH和最适温度分别为6.0,60℃,且具有良好的稳定性.1 mmol/L金属离子C02+或Ni2+显著提高酶活力.底物特异性分析表明:该重组酶对邻位二酮具有较高活力,其中对酮基泛解酸内酯的比酶活可达20.53 U/mg.     

重组葡萄糖脱氢酶的酶学性质及其偶联辅酶再生

为解决生物催化氧化还原反应中辅酶循环问题,人工合成密码子优化后的嗜酸热源体Thermoplasma acidophilum葡萄糖脱氢酶基因Sygdh,于E.coli BL21(DE3)中表达,粗酶液经镍柱亲和层析获得纯化的重组葡萄糖脱氢酶SyGDH。SDS-PAGE显示相对分子质量为41.0 kDa。酶学性质分析表明:该酶的最适pH值为7.5,在pH 6.0~8.0稳定;最适反应温度为40℃,在55℃以下稳定;最适条件下其比活性达4.5 U/mg;Zn2+对其有明显激活作用;该酶对NADP+的亲和力大于NAD+且对大多数有机溶剂有良好的耐受性;对D-葡萄糖的Km和Vmax值分别为28.2 mmol/L和6.5 U/mg。在葡萄糖脱氢酶与羰基还原酶偶联构建的NADPH辅酶循环体系中,以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物,羰基还原酶催化产物4-氯-3-羟基丁酸乙酯的产率为99.0%,是未添加葡萄糖脱氢酶时产物产率的3.11倍,表明重组SyGDH具有为生物催化氧化还原反应提供辅酶NADPH再生的能力。     

老黄酶和甲酸脱氢酶催化柠檬醛不对称还原生成香茅醛的条件优化

源自酿酒酵母的老黄酶基因oye2和源自假丝酵母的甲酸脱氢酶基因fdhcb分别成功地在大肠杆菌BL21 (DE3)中过量表达.重组表达的老黄酶OYE2和甲酸脱氢酶FDHCB经Ni-NTA亲和层析获得相应的纯酶.以这两种纯酶构建不对称还原柠檬醛生成香茅醛的催化体系,并优化了其反应条件.优化后的反应体系含有25 mmol/L柠檬醛,100 mmol/L甲酸钠,0.42mg/mL老黄酶OYE2,0.2 U/mL甲酸脱氢酶FDHCB,0.5 mmol/L NAD+以及50 mmol/LPIPES缓冲液(pH 7.0).在pH 7.0和30 ℃下反应10 h,香茅醛得率达92.0％,与没有甲酸脱氢酶辅助辅酶循环时的得率(9.8％)相比,香茅醛得率提高了约9.4倍.     

1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD在肺炎克雷伯氏菌中的表达研究

以大肠杆菌(Escherichia coli)基因组为模板,PCR扩增出1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD,经测序确认,将yqhD基因与四环素抗性基因TetR同时插入表达载体pUC18构建重组质粒pUC18-yqhD-TetR,重组质粒转化Klebsiella pneumoniae ME308;37℃,经1.0mmol/LIPTG诱导8h,重组肺炎克雷伯氏菌中1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶的酶活力达到4.16U/mg,而对照菌株的酶活仅为0.62U/mg;将重组菌在摇瓶中进行微氧发酵培养,经IPTG诱导,可将60g/L甘油转化为33.8g/L1,3-丙二醇。     

化学-酶法不对称氢化柠檬醛合成(R)-香茅醛

烯醇还原酶OYE2催化(E)-或(Z)-柠檬醛不对称氢化时,其氢化产物的手性是互补的.因而,以(E/Z)-柠檬醛为底物时产物e.e.值往往很低.拟将酶法不对称氢化反应与氨基酸催化的底物异构化反应相偶联,从而提高产物(R)-香茅醛的e.e.值.对氨基酸催化的异构化反应进行了条件优化,最优氨基酸为甘氨酸,最优添加浓度为1.0 mol/L,最优pH为7.0.在优化条件下反应11 h,偶联底物异构化反应时的(R)-香茅醛e.e.值和得率分别为75.06％和91.84％,比对照分别提高了27.62％和23.90％.     

裂殖酵母醛酮还原酶基因的克隆与诱导表达条件优化

从裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)基因组中克隆获得编码醛酮还原酶SpoAKR3C2的基因,并成功构建了表达SpoAKR3C2的重组工程菌Escherichia coli BL21 (DE3)/pET 28bSpoAKR3C2.为了提高SpoAKR3C2在E.coli BL21(DE3)中的表达水平,分别考察了种子液接种量、诱导时间、温度、转速以及诱导剂浓度等对产醛酮还原酶SpoAKR3C2的影响.结果表明:该酶的最适诱导温度为19℃,最适转速为140r/min,最适诱导时间为14h,最适接种量为1.5%(体积比).以IPTG为诱导剂,最适诱导剂浓度为0.1 mmol/L.在最佳诱导条件下,粗酶液中SpoAKR3C2对酮基泛解酸内酯的比酶活可达6.762U/mg,与未优化前相比提高了3.4倍.     

木糖还原酶基因整合表达载体构建

木糖还原酶是酵母代谢木糖发酵的关键酶之一。根据已报道的木糖还原酶基因的全序列设计引物,从休哈塔假丝酵母中克隆得到1 110 bp大小的片段。将木糖还原酶基因亚克隆到酿酒酵母的整合表达载体p406ADH1中,醋酸锂转化法将线性化重组质粒p YX-AK-xyl1转化到酿酒酵母W5,对阳性转化子进行酶活测定,结果表明,以辅酶DANH和NADPH为底物诱导,转化子均表现出活性,酶活分别为6.513 U/mg和7.080 U/mg,是受体菌W5酶活的1.4倍(NADH)和1.3倍(NADPH),其酶活比为0.919。     

木糖发酵酵母Pichia stipitis木糖还原酶基因XYL1在酿酒酵母中的表达

通过PCR方法克隆得到树干毕赤氏酵母木糖还原酶 (XR)基因XYL1。将该基因连入酵母表达载体pYX2 12的强启动子磷酸丙糖异构酶 (TPI)启动子下 ,得到融合表达载体pYX XYL1。通过电转化方法将 pYX XYL1转入酿酒酵母SaccharonmycescerevisiaeW 30 3-1A中 ,酶活测定表明 ,在酿酒酵母中树干毕赤氏酵母木糖还原酶 (XR)基因XYL1得到活性表达 ,2酿酒酵母转化子粗酶液中木糖还原酶活分别为 0 .89U/mg(蛋白 )和 0 .83U/mg(蛋白 ) ,为供体菌的 1 5倍多。与基因供体菌不同 ,木糖还原酶基因在酿酒酵母中表达不需木糖诱导 ,为组成型表达。树干毕赤氏酵母木糖还原酶 (XR)基因XYL1的成功表达为后续的利用木糖的酿酒酵母菌株的构建奠定了基础     

近平滑假丝酵母ATCC 7330羰基还原酶CpCR的表达及酶学性质研究

通过构建重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/pACYC Duet-1-cpcr,表达带有His标签的近平滑假丝酵母Candida parapsilosis ATCC 7330羰基还原酶CpCR基因,并采用Ni-Agarose亲和层析对重组酶CpCR进行分离纯化和酶学性质研究。重组酶CpCR的基因序列全长1107 bp,含有368个氨基酸,分子质量在41 kDa左右,比酶活力为20 U/mg;该酶在4~33℃的温度范围稳定性较好,相对酶活力在80%以上,T 50值为37℃;该酶的pH适宜范围在6.2~7.5,在中性条件下稳定性最好;Cu^2+对该酶有强烈的抑制作用,在1 mmol/L条件下,相对酶活力下降30%,在5 mmol/L条件下,相对酶活下降50%;该酶对底物苯甲醛、正丁醛亲和能力强于4-氯-3-酮基-丁酸乙酯(4-chlor-3-keto-butyrate-ethyl ester,COBE),对苯甲醛或正丁醛的催化效率是对COBE的20倍左右;该酶是一种NADPH依赖型的羰基还原酶。本研究为羰基还原酶CpCR分子改造和催化应用提供了重要的基础数据。     

菊粉外切酶的异源表达、纯化及酶学性质

将菊粉降解菌Paenibacillus sp. Lfos16的菊粉外切酶基因克隆至表达载体p ET-28a (+),转入Escherichia. coli BL21(DE3)中实现了异源表达。利用镍柱亲和层析纯化重组菊粉外切酶,并进行SDS-PAGE检测。重组菊粉外切酶的表观分子质量为87 k Da,经纯化后,重组菊粉外切酶的比酶活为348.30 U/mg。重组菊粉外切酶作用菊粉和蔗糖的酶活分别为259.37 U/m L和592.16 U/m L,I/S值为0.438,且重组酶水解菊粉的主要产物为果糖。重组菊粉外切酶最适作用温度为40℃,且当温度低于30℃时酶活较稳定;最适作用pH为6。Ag~+、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)、Hg~(2+)、Fe~(3+)具有显著抑制作用。重组菊粉外切酶对菊粉的K_m为19. 28 mg/m L,Vmax为0.18 mg/(min·m L)。