三氧化二砷诱导MUTZ-1细胞凋亡的端粒酶调控研究

为了研究三氧化二砷（As2O3）诱导人类骨髓增生异常综合征难治性贫血伴原始细胞过多型（MDS—RAEB）细胞株MUTZ-1细胞凋亡的端粒酶调控机制，采用端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附试验（TRAP—ELISA）检测端粒酶活性；RT—PCR法检测端粒酶逆转录酶（hTERT）、TRF1（TTAGGG repeat binding factor 1）、TRF2（TTAGGG repeat binding factor 2）、bcl-2、bax等基因mRNA水平的表达；磷脂酰丝氨酸（PS）转位等方法检测细胞凋亡，结果表明：1—8μmol／L As2O3诱导MUTZ-1细胞凋亡呈时间、浓度依赖关系。在该浓度范围内，As2O3可下调细胞端粒酶活性。且端粒酶活性下调与凋亡细胞阳性率呈明显负相关（r=一0．938，P=0．018）。MUTZ-1细胞经As，01作用后，hTERT基因mRNA表达下调，并与端粒酶活性变化呈正相关（r=0．783，P=0.022），但As2O3对TRF1及TRF2基因mRNA表达没有明显影响.MUTZ-1细胞端粒酶活性受抑制同时，伴有bcl-2 mRNA表达下调及bcl-2／bax比值下降结论：As2O3可能通过抑制细胞端粒酶活性及hTERT表达，诱导MUTZ-1细胞凋亡。As2O3抑制MUTZ-1细胞端粒酶活性可能是诱导该凋亡机制之一。     

白血病HL-60、HL-60A细胞Cyclin D1、hTERT表达和端粒酶活性及意义

本研究旨在观察cyclin D1、hTERT和端粒酶在正常人单个核细胞(MNC)、HL-60和HL-60A中的表达及活性,并探讨它们与白血病发生及耐药的关系。实验用正常人外周血MNC、耐药白血病细胞株HL-60和HL-60A,采用流式细胞仪检测细胞周期,Annex in V-FITC+PI染色法检测细胞凋亡,real-tim e PCR和W estern b lot检测细胞cyclin D1、hTERTmRNA及蛋白表达,TRAP-ELISA法检测细胞端粒酶活性。结果表明:MNC、HL-60、HL-60A的S期细胞比例分别为(10.21±2.11)%、(44.93±3.00)%、(51.38±1.10)%;凋亡细胞比例分别为(16.14±2.13)%、(7.53±0.92)%、(4.15±0.96)%;cyclin D1、hTERT的mRNA和蛋白水平依次增高;HL-60、HL-60A端粒酶活性较正常MNC增强(p=0.000),HL-60与HL-60A之间无明显差别(p=0.232);cyclin D1、hTERT与端粒酶活性呈正相关(p<0.01)。结论:与正常人MNC相比,HL-60、HL-60A的S期细胞增多,凋亡细胞减少,且以HL-60A更为明显,这可能与cyclin D1、hTERT、端粒酶活性上调有关。     

高三尖杉酯碱诱导HL-60细胞人端粒酶逆转录酶mRNA的变化

为了探讨高三尖衫酯碱(homohardngtonine，HHT)抑制HL-60细胞端粒酶活性的机制及意义，采用半定量RT-PCR和PCR-ELISA法检测HHT作用后的HL-60细胞人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达和端粒酶活性的变化，用TUNEL法检测HL-60细胞的凋亡率。结果发现：与空白对照相比，0．005-0．03μg/ml,HHT作用HL-60细胞12小时，hTERTmRNA表达无明显变化，随HHT浓度增加至0．04-0．05μg/ml，hTERTmRNA表达明显下降至检测不出。与0小时相比，0．02μg/ml HHT作用6-18小时后，HL-60细胞hTERT mRNA表达无明显变化，24小时后hTERT mRNA表达明显减少，至30小时未能检出hTERT mRNA表达。HL-60细胞端粒酶活性的抑制与hTERT mRNA的表达下降趋势基本一致。随HL60细胞hTERT mRNA的表达下降和端粒酶活性的抑制，其凋亡率明显增加。结论：HHT能抑制HL-60细胞hTERT mRNA的转录，其与细胞凋亡的关系值得进一步研究。     

TGF-β1和(或)三氧化二砷作用于HL-60细胞后P27~(Kip1)表达及凋亡情况的研究

本研究观察三氧化二砷(As2O3)和/或TGF-β1对HL-60细胞凋亡及细胞周期的影响,以及作用前后P27Kip1、内源性TGF-β1、cyclinE和BCL-2的变化情况。As2O3和/或TGF-β1作用于HL-60细胞,用细胞形态学观察及流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期改变情况,应用免疫组织化学检测药物处理前后P27Kip1、内源性TGF-β1、cyclinE以及BCL-2表达的变化情况。结果表明:As2O3和TGF-β1单用均可以诱导HL-60细胞发生凋亡,联合处理对HL-60细胞生长抑制作用强于单药处理,其中5μmol/LAs2O3作用最强,5ng/mlTGF-β1处理可引起HL-60细胞的细胞周期阻滞于G1期(p0.05)。5ng/mlTGF-β1和联合处理组P27Kip1的表达较对照组增强(p0.05);5μmol/LAs2O3处理组P27Kip1的表达与对照组比较无明显差异(p0.05)。5ng/mlTGF-β1和联合处理组均可见cyclinE蛋白表达下调(p0.05)。5μmol/LAs2O3和联合处理组可见内源性TGF-β1表达上调(p0.05)。结论:As2O3、外源性TGF-β1均可诱导HL-60细胞凋亡,联合处理组诱导凋亡作用强于对照组和单药处理组,TGF-β1处理可引起HL-60细胞周期阻滞于G1期。TGF-β1诱导HL-60细胞凋亡过程中P27Kip1表达增强,拮抗cyclinE和BCL-2的作用,细胞周期阻滞,诱导细胞发生凋亡,这表明P27Kip1是TGF-β引起细胞周期阻滞的关键效应物,外源性TGF-β1又通过上调内源性TGF-β1的表达增强As2O3诱导原代APL细胞凋亡的作用。     

右旋柠烯对HL-60、K562白血病细胞体外作用的研究

本研究观察右旋柠烯（d-limonene，D-L）对HL-60和K562白血病细胞增殖凋亡的影响，并进一步探讨其作用机制。首先采用碘化丙锭染色法观察右旋柠烯对HL-60、K562细胞增殖的影响，再通过细胞形态学观察、流式细胞术分析、免疫细胞化学半定量测定突变型p53、bcl-2、bax基因的表达水平，系统观察D-L对HL-60、K562细胞体外诱导凋亡的情况。结果表明：D-L抑制HL-60和K562细胞的增殖，IC50均为0．75mmol／L，呈剂量时间依赖关系；D-L诱导HL-60、K562细胞凋亡；D-L在诱导HL-60细胞凋亡过程中随作用浓度增加，bcl-2的表达下降；D-L在诱导K562细胞凋亡过程中随作用浓度增加，突变型p53及bcl-2的表达下调，而bax的表达上调。结论：D-L抑制HL-60和K562细胞增值并诱导其凋亡；突变型p53，bcl-2，bax参与了D-L诱导凋亡的基因调控，     

外源笥野生型p53基因对K562细胞的作用

为了研究外源性野生型p53基因（wt-p53）对K562细胞的作用。探索p53基因治疗白血病的可能性,两种p53基因pC53-SN3(wtp53cDNA)和pN53cG(Val135)(32.5℃表现wtp53功能）通过脂质体介导的DNA转染法导入无P53蛋白表达的K562细胞,获得细胞克隆K-SN3及K-pN53cG。通过生长曲线、克隆形成率、细胞周期分析,片段化DNA及TUNEL检测,联苯胺染色等指标观察外源性wtp53基因对K562细胞的影响,结果显示;（1）RT-PCR检测K-SN3及K-pN53cG均获表达p53基因,但前表达明显低于后;（2）K-SN3,K-pN53cG(32.5℃）细胞生长减慢,克隆形成明显受抑,且G0/G1期增加,S期减少,以上现象均以K-pN53cG细胞（32.5℃）更明显;（3）K-pN53cG932.5℃）可检测到明显凋亡改变,而K-SN3则向红系分化,说明wtp53基因表达使K562细胞生长受到明显抑制,并提示p53低表达可能促使K562细胞向红系分化,而p53高表达诱导K562细胞出现凋亡,wtp53对于白血病基因治疗有潜在的应用价值。     

p53基因对HL-60细胞端粒酶活性和人端粒酶逆转录酶基因表达的影响

为了研究野生型p53基因转染的HL-60细胞端粒酶活性和人端粒酶逆转录酶（hTERT)基因表达的变化，采用脂质体法将野生型p53基因转染HL-60细胞，用TUNEL检测细胞凋亡。用端粒重复扩增法（TRAP）-酶联免疫吸附试验（ELISA）检测端粒酶活性变化，以及用RT-PCR方法检测hTERTmRNA表达的变化。结果显示：转染野生型p53基因的HL-60细胞在32.5℃培养24小时和72小时后，凋亡率分别为8.3%和21.0%,hTERTmRNA和端粒酶活性分别下降至对照组的68.4%和55.8%及27.3%和8.9%。结论：p53基因能下调HL-60细胞hTERTmRNA和端粒酶活性。这可能是野生型p53基因诱导细胞凋亡机制之一。     

细胞色素C诱导HL-60细胞凋亡时bcl-2 fas基因的表达

目的观察细胞色素C对急性髓系白血病M2型(AML-M2)(HL-60细胞)bcl-2、fas表达的影响,探讨细胞色素C诱导HL-60细胞凋亡的机制。方法将体外培养的HL-60细胞分成六组,细胞色素C终浓度分别为0(对照组)、9.375mg/L、18.75mg/L、37.5mg/L、75mg/L、150mg/L,用流式细胞仪检测细胞色素C对HL-60细胞的凋亡效应,用RT-PCR、westernblotting检测以凋亡为主的HL-60细胞中bcl-2、fas的表达水平。结果流式细胞仪检测表明细胞色素C终浓度分别为0、9.375mg/L、18.75mg/L、37.5mg/L时HL-60细胞是以凋亡效应为主的,bcl-2基因的mRNA和蛋白的表达随着细胞色素C浓度的增高而降低,fas基因的mRNA和蛋白的表达随着细胞色素C浓度的增高而增高,当细胞色素C浓度为75mg/L、150mg/L时,HL-60细胞是以坏死效应为主的。结论细胞色素C能够下调bcl-2mRNA及其蛋白的表达,上调fasmRNA及其蛋白的表达,从而可以诱导HL-60细胞的凋亡。     

人类端粒酶逆转录酶基因反义核苷酸对白血病细胞端粒酶活性的影响

为了探讨人类端粒酶逆转录酶（hTERT)基因反义寡核苷酸（ASODN）对原代培养的急性髓性白血病（AML）和慢性髓性白血病（CML）细胞端粒酶活性的影响。采用间接免疫荧光标记方法，通过流式细胞术检测hTERT基因ASODN作用于AML和CML细胞后hTERT蛋白表达含量的变化。采用端粒酶聚合酶链反应-酶子弟免疫测定（PCR-ELISA0法检测白血病细胞端粒酶活性的改变。结果显示：hTERT ASODN作用于AML和CML细胞24，48和72小时后，hTERT蛋白表达水平不断降低；同时，AML和CML细胞端粒酶活性均逐渐受到抑制。结论：hTERT基因ASODN可以通过特异性地抑制AML和CML细胞hTERT蛋白的表达，抑制AML和CML细胞端粒酶的活性。     

AZT对白血病细胞株KG-1a细胞增殖和端粒酶活性的影响

本研究探索端粒酶抑制剂3’-叠氮-2’,3’-脱氧胸腺核苷(AZT)对人急性髓系白血病细胞株KG-1a细胞增殖和端粒酶活性的影响。用MTT法检测不同浓度AZT分别作用24、48、72 h时KG-1a细胞增殖水平;流式细胞术检测AZT对KG-1a细胞周期及细胞凋亡的影响;TRAP-PCR-ELISA法检测细胞端粒酶活性;RT-PCR法检测细胞端粒逆转录酶(hTERT)mRNA的表达。结果表明,AZT能抑制KG-1a细胞增殖,抑制作用具有时间和浓度依赖性;随AZT浓度的增加,处于S期的细胞数目减少,G2/M期细胞数目增加,且出现凋亡峰;AZT作用后实验组细胞的端粒酶活性降低,hTERT-mRNA表达下降,下调程度与AZT浓度呈正相关。结论:AZT在体外能明显抑制KG-1a细胞增殖,并诱导其凋亡,其机制与降低端粒酶活性、下调hTERT mRNA表达有关。     

内源性TGF—β1、TNF—α在三氧化二砷诱导HL—60细胞凋亡中作用的研究

目的探讨内源性TGF-β     

端粒酶活性的抑制对顺铂诱导K562细胞凋亡的影响

目的 利用人类端粒酶逆转录酶（hTERT)基因反义寡核苷酸（ASODN）抑制K562细胞端粒酶活性后,探讨顺铂对K562细胞凋亡的影响。方法 采用聚合酶链反应－酶联免疫吸附法（PCR－ELISA）检测端粒酶活性的变化;以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达含量的变化。琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡的DNA断裂;用流式细胞仪对细胞凋亡峰进行定量分析。结果 hTERT基因ASODN作用于K562细胞后,hTERT蛋白的表达水平及端粒酶活性下降;ASODN作用于K562细胞24h再加入顺铂作用72h,经琼脂糖凝胶电泳即可见到DNA梯形条带,而正义寡核苷酸（SODN）与顺铂联合作用组及单独应用顺铂均未见到明显的DNA梯形条带。hTERT基因ASODN作用于K562细胞24h,再加入5μmol/L顺铂作用48,72h的凋亡细胞百分率（17．43％和20．34％）分别与SODN联合顺铂作用组（7．43％和9．23％）、单用顺铂作用组（5．49％和7．34％）进行比较,差异有显著性（P＜0．01）。结论 以hTERT基因mRNA起始密码区为靶点的ASODN能特异性地抑制K562细胞的端粒酶活性;端粒酶活性的下调可促进顺铂诱导K562细胞凋亡。     

5-氮杂脱氧胞苷对白血病细胞生长作用及相关基因表达的影响

目的　探讨甲基化抑制剂 5 氮杂脱氧胞苷 (5 aza 2′ deoxycytidine,5 aza CdR)去甲基化治疗白血病的作用机制。方法　采用MTT实验、硝基四氮唑蓝 (NBT)还原实验和DNA凝胶电泳的方法 ,观察 5 aza CdR对白血病细胞株和原代细胞增殖、分化和凋亡的影响 ;通过RT PCR和甲基化特异性PCR方法检测DNA甲基转移酶 (DNMT)、p15、p5 3、bcl 2基因表达变化和p15基因的甲基化状态。结果　 5 aza CdR对HL 6 0、K5 6 2细胞和白血病原代细胞的生长抑制有明显的剂量依赖性和时间依赖性。 0 .5 μmol/L 5 aza CdR对HL 6 0细胞有较明显的促分化作用。不同浓度 5 aza CdR处理细胞后 ,有不同程度的p15、p5 3mRNA表达上调和bcl 2mRNA表达下调 ,DNMTmRNA表达水平在处理前后无明显变化。在原代白血病细胞中 ,p15基因甲基化程度随着 5 aza CdR浓度的增加逐渐减低。结论　 5 aza CdR对白血病细胞株和原代细胞的增殖均有明显的抑制作用 ,其作用机制可能与p15、p5 3基因的上调以及bcl 2基因的下调有关 ,p15 INK4B基因甲基化程度的降低 ,主要与 5 aza CdR的竞争性抑制有关 ,而不是由DNMT基因的下调所致     

bcl-2基因反义寡核苷酸的设计与白血病细胞对Ara-C敏感性研究

寻找在bcl-2mRNA上除了起始区以外的反义寡核苷酸作用的敏感位点和观察这些核苷酸对白血病细胞的阿糖胞苷敏感性的影响。用RNAstructure软件模拟bcl-2mRNA的二级结构设计合成两端硫代修饰反义寡核苷酸，用MTT法测定抑制HL-60和K562细胞的阿糖胞苷半数抑制浓度（IC50）值；用流式细胞术检测HL-60和K562细胞凋亡率和bcl-2蛋白表达水平。结果发现，10μmol/Lbcl-2基因的反义寡核苷酸同Ara-C结合使用，能明显地抑制HL-60和K562细胞bcl-2基因蛋白的表达，促进细胞凋亡，减低Ara-C的IC50值；同时发现针对蛋白编码区的反义寡核苷酸有更强的作用。结论：除了bcl-2mRNA的起始区外，在bcl-2mRNA的其他部位存在有设计反义寡核苷酸更有效的位点，该项研究将为反义药物的设计提供新的有用途径。     

WT1反义寡核苷酸对白血病细胞增殖和凋亡的影响

目的 了解ＷＴ１反义寡核苷酸对白血病细胞增殖和凋亡的影响。方法 应用ＷＴ１基因的反义寡核苷酸（ＷＴ１ＡＳＯ）处理Ｋ５６２、Ｕ９３７、ＨＬ－６０细胞系,白血病患以及正常人骨髓细胞,然后以台盼蓝拒染法、细胞集落法及流式细胞仪检测法确定白血病细胞的增殖和凋亡。结果 ＷＴ１ ＡＳＯ能够抑制ＷＴ１表达阳性的Ｋ５６２细胞生长,对ＷＴ１表达阴性的Ｕ９３７细胞则无抑制作用;ＷＴ１ ＡＳＯ对８例急性髓系白血病患     

槲皮素对白血病细胞中PML基因及蛋白表达的影响和定位的研究

目的 探讨PML基因及蛋白在白血病细胞中的表达和细胞内分布定位。方法 经全反式维甲酸（ATRA）、槲皮素处理后的NB4、HL-60、K562细胞为研究对象，细胞形态学观察采用Wright染色法及荧光染色法；PML蛋白细胞分内分布定位采用免疫荧光技术；PML mRNA表达的检测采用RT-PCR法。结果 （1）ATRA处理后，NB4和HL-60细胞形态学上出现分化表现，K562细胞无变化；经槲皮素处理后，各组细胞形态学上均出现凋亡特征性改变。（2）ATRA处理后，NB4细胞内融合蛋白降解，PML蛋白恢复定位，HL-60、K562细胞内PML蛋白定位分布无变化；槲皮素处理后NB4细胞内融合蛋白降解，PML蛋白聚积于POD结构，随后降解，在HL-60及K562细胞，PML蛋白发生相似改变。（3）ATRA、槲皮素对各组细胞PMLmRNA表达均无显著影响。结论 在不同诱导剂刺激下，PML在蛋白水平参与细胞终末分化及诱导白血病细胞凋亡机制；PML蛋白在POD中发挥诱导凋亡、控制细胞生长的作用。     

端粒酶活性的抑制对顺铂诱导HL—60细胞凋亡的影响

采用端粒酶聚合酶链反应-酶联免疫吸附测定(PCR ELISA)的方法,检测人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因反义寡脱氧核苷酸(ASODN)处理HL-60细胞前后端粒酶活性的改变,并进一步通过姬姆萨染色及流式细胞术方法,分析HL-60细胞的端粒酶活性受到抑制后顺铂对HL60细胞凋亡的影响.结果显示hTERT基因ASODN作用于HL60细胞后,端粒酶活性表现逐渐下降;hTERT ASODN与顺铂联合可诱导HL-60细胞出现一系列特征性的凋亡细胞的形态学变化;hTERT基因ASODN作用于HL-60细胞24小时再加入顺铂,用流式细胞术测定凋亡细胞的百分率明显高于正义寡核苷酸(S)DN)联合顺铂作用组和单用顺铂作用组(P＜0.01).然而,hTERT基因的ASODN下调HL-60细胞的端粒酶活性以后,再用DNR和Ara-c处理不能加速HL-60细胞的凋亡.以上的结果表明了端粒酶活性的下调可选择性促进顺铂诱导HL-60细胞凋亡.