微RNA调控间充质干细胞软骨分化的机制研究进展

间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是软骨组织工程的一种理想种子细胞,体外条件下诱导MSCs软骨分化,将直接影响组织工程修复软骨的成败。微RNA（microRNA, miRNA）是一类由内源基因编码、长度为22个核苷酸左右的单链RNA,在细胞增殖、分化、凋亡以及疾病发生过程中发挥重要的调控功能,其在转录后水平调控与软骨分化相关转录因子及信号通路靶基因的表达,以此调控MSCs软骨分化。本文就miRNA调控MSCs软骨分化的机制研究进展作一综述。     

MicroRNAs在骨髓间充质干细胞成软骨分化中的作用

软骨组织由细胞外基质与分散其间的软骨细胞共同构成，由于缺乏血管?神经和淋巴系统，损伤后自身修复能力差。目前各种促进软骨损伤修复的方法效果都不理想，诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化修复软骨损伤已成为当下研究的热点。多种MicroRNA参与并调控骨髓间充质干细胞成软骨分化过程，本文就MicroRNA调控骨髓间充质干细胞成软骨分化及其机制的研究进展做一综述。     

Wnt3a对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响

[目的]探讨Wnt3a基因对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成软骨分化的影响。[方法]分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),携带Wnt3a及阴性对照基因(Mock)的慢病毒感染骨髓间充质干细胞,构建过表达Wnt3a骨髓间充质干细胞;采用甲苯胺蓝染色及QPCR观察Wnt3a对骨髓间充质干细胞成软骨分化能力的影响;使用MTT法观察Wnt3a对骨髓间充质干细胞增殖能力的影响。[结果]在0~72 h内,实验组MTT法检测吸光值明显大于对照组(P0.05);BMSCs体外成软骨诱导后,实验组细胞团明显小于对照组,且甲苯胺蓝染色较浅;实验组与对照组比较,成软骨指标Col2A1、Aggrecan和SOX9的m RNA表达降低(P0.05)。[结论]Wnt3a可促进骨髓间充质干细胞增殖,但抑制了骨髓间充质干细胞的成软骨分化。     

Ad-TGFβ1重组腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的研究

利用软骨组织工程修复人体关节面的软骨面缺损是自20世纪末以来人们探讨的研究方向，其中骨髓间充质干细胞作为种子细胞向软骨细胞分化的研究是具有优势的一个热点。我们利用重组腺病毒作为载体，将TGFβ1基因转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs），为其向软骨细胞表型的分化提供实验基础。     

肿瘤相关间充质干细胞的研究进展

间充质干细胞普遍存在于组织间质中，对组织损伤修复、机体免疫调控等均发挥重要作用。近年研究发现，肿瘤组织中普遍存在间充质干细胞，称为肿瘤相关间充质干细胞，且与正常组织内的间充质干细胞在调控功能、基因表型等方面有所区别。可以说，肿瘤相关间充质干细胞是独立于正常间充质干细胞的特殊亚型。本文对肿瘤相关间充质干细胞的来源、转化、功能及其临床价值进行综述。     

骨髓间充质干细胞修复软骨缺损研究进展

间充质干细胞是一类多能干细胞,在胚胎形成过程中分化为骨、软骨、肌腱、肌肉、脂肪和骨髓基质等多种间充质组织.近年研究者成功地分离到人和多种动物骨髓间充质干细胞并发现其在体外仍保持干细胞特性,能够诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞和脂肪细胞等细胞系.动物实验表明,骨髓间充质干细胞能够修复具有临床意义的软骨缺损.此外,由于具有多能性,骨髓间充质干细胞还是很好的基因载体,在创伤修复的基因治疗中有广阔的应用前景.     

人间充质干细胞成软骨分化中DNA甲基化调控Ⅹ型胶原表达

目的在人间充质干细胞(hMSCs)诱导成软骨分化过程中，探讨Ⅹ型胶原与其启动子甲基化状态之间的关系，为揭示表观遗传学调控参与成软骨分化的可能机制提供理论基础。 方法收集6例来源于深圳市第二人民医院脊柱外科患者的腰椎椎体骨髓间充质干细胞为研究对象，运用离心沉淀法进行细胞微球培养，用含有转化生长因子β3(TGF-β3)及2%胎牛血清(FBS)的高糖细胞培养基(DMEM)进行成软骨诱导并作为实验组(3例)；在该诱导液中加入5’-氮杂胞苷(5’-AZA)作为诱导组(3例)；不含TGF-β3的2%胎牛血清的高糖细胞培养基的为对照组(3例)。在分化3 d后进行定量PCR，检测成软骨分化相关基因表达以及Ⅹ型胶原启动子区域甲基化改变情况，采用方差分析及多样本间的均数比较(q检验)分析基因水平表达差异；组间DNA甲基化水平差异采用Kruskal-Wallis检验统计学差异。 结果通过生物信息学预测Ⅹ型胶原的启动子区域可能存在CpG富集区域，在含有5’-氮杂胞苷的成软骨诱导分化过程中，Ⅹ型胶原表达逐渐上升，与对照组相比差异具有统计学意义(F＝37.526, P<0.001)，而Ⅹ型胶原启动子区域的甲基化水平与对照组相比逐渐下降，差异也具有统计学意义(F＝11.066，P<0.01)。 结论在体外诱导人间充质干细胞成软骨分化过程中，参与维持Ⅹ型胶原启动子甲基化状态降低，分化能力得到增强；提示表观遗传学调控方式是影响干细胞分化方式之一。     

基因转染脂肪间充质干细胞作为软骨组织工程种子细胞的研究

目的 观察人转化生长因子(hTGF)β2基因转染诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞的定向分化能力,探讨脂肪间充质干细胞作为种子细胞和在基因增强的软骨组织工程中应用的可行性.方法 取3周龄Lewis大鼠的脂肪组织,消化法获得脂肪间充质干细胞,pcDNA 3.1(+)/hTGFD2通过脂质体介导转染脂肪间充质干细胞,用免疫化学染色、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测筛选的阳性克隆细胞中hTGFB2基因与软骨特异性蛋白-Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的情况;然后将基因转染的脂肪间充质干细胞与PLGA支架体外构建细胞-载体复合物,再将其植入裸鼠体内,12周后观察基因增强的组织工程软骨的形成情况.结果 从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪问充质干细胞,能大量稳定增殖传代.hTGFB2基因在脂肪间充质干细胞内能瞬时及稳定表达,并促使Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成;细胞.载体复合物在裸鼠体内经12周的培养,可以形成形态、结构接近正常软骨的组织工程软骨.结论 PODNA 3.1(+)/hTGFl32成功转染脂肪间充质干细胞,诱导其向软骨细胞分化,脂肪间充质干细胞可作为基因增强的软骨组织工程较理想的种子细胞.     

hBMP-2基因改良修饰骨髓间充质干细胞和人脐血间充质干细胞研究

目的研究hBMP-2基因改良修饰骨髓和人脐血间充质干细胞的方法,并比较修饰结果。 方法联合应用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、培养骨髓和人脐血间充质干细胞,通过高效非脂质体试剂X-treme GENE介导重组hBMP-2质粒转染骨髓和人脐血间充质干细胞,倒置荧光显微镜检测荧光强度并计算转染效率,qPCR检测hBMP-2及软骨连接蛋白在两种细胞中的表达,免疫组化检测细胞中Ⅱ型胶原的变化。 结果成功分离、培养出骨髓和人脐血间充质干细胞,两种细胞具有不同的生长特性。高效非脂质体试剂介导的重组hBMP-2质粒成功转染骨髓和人脐血间充质干细胞,转染骨髓间充质干细胞效率[（18.44±5.94）%]低于人脐血间充质干细胞[（27.74±7.59）%],且差异有统计学意义（t=3.027,P<0.05）。转染后的两种细胞均检测到hBMP-2、软骨连接蛋白及Ⅱ型胶原的表达。 结论hBMP-2基因可以有效改良修饰骨髓和人脐血间充质干细胞,且能促进其向软骨细胞方向分化。     

不同来源的间充质干细胞治疗骨与软骨组织疾病的研究进展

近年来,随着细胞和组织工程技术的发展,间充质干细胞广泛受到关注和研究,具有易分离获取、培养过程相对简单等优点,并且能够自我更新并分化成多种细胞类型,包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等,是较为理想的种子细胞。在骨髓间充质干细胞大量的研究基础上,脂肪、骨骼肌、滑膜等多种不同来源的间充质干细胞也广泛应用在骨及软骨组织的体内研究和体外研究中。虽然间充质干细胞在基础性研究方面取得了飞跃进展,但在临床推广应用干细胞治疗上还面临着诸多问题,如对间充质干细胞的分化机理尚不明确,对其定向分化无法进行精确调控,且存在诸多限制骨和软骨再生的几个因素,很大程度上影响治疗的效果,故仍需进一步深入研究。     

人间充质干细胞成软骨分化中DNA甲基化调控X型胶原表达

目的在人间充质干细胞(hMSCs)诱导成软骨分化过程中,探讨X型胶原与其启动子甲基化状态之间的关系,为揭示表观遗传学调控参与成软骨分化的可能机制提供理论基础。方法收集6例来源于深圳市第二人民医院脊柱外科患者的腰椎椎体骨髓间充质干细胞为研究对象,运用离心沉淀法进行细胞微球培养,用含有转化生长因子β3(TGF-β3)及2%胎牛血清(FBS)的高糖细胞培养基(DMEM)进行成软骨诱导并作为实验组(3例);在该诱导液中加入5’-氮杂胞苷(5’-AZA)作为诱导组(3例);不含TGF-β3的2%胎牛血清的高糖细胞培养基的为对照组(3例)。在分化3 d后进行定量PCR,检测成软骨分化相关基因表达以及X型胶原启动子区域甲基化改变情况,采用方差分析及多样本间的均数比较(q检验)分析基因水平表达差异;组间DNA甲基化水平差异采用Kruskal-Wallis检验统计学差异。结果通过生物信息学预测X型胶原的启动子区域可能存在CpG富集区域,在含有5’-氮杂胞苷的成软骨诱导分化过程中,X型胶原表达逐渐上升,与对照组相比差异具有统计学意义(F=37.526,P 0.001),而X型胶原启动子区域的甲基化水平与对照组相比逐渐下降,差异也具有统计学意义(F=11.066,P0.01)。结论在体外诱导人间充质干细胞成软骨分化过程中,参与维持X型胶原启动子甲基化状态降低,分化能力得到增强;提示表观遗传学调控方式是影响干细胞分化方式之一。     

诱导小鼠骨髓间充质干细胞向雄性生殖细胞的定向分化

目的探讨小鼠骨髓间充质干细胞是否能够在体外被诱导发生向雄性生殖细胞方向的分化。方法从雄性小鼠骨髓中分离能够长期贴壁生长的细胞,并鉴定其是否为间充质干细胞。对分离的细胞进行生殖细胞特异性报告基因标记(stra-8-GFP)。采用视黄酸诱导标记的细胞发生向生殖细胞方向的分化。通过观察报告基因表达和生殖细胞相关基因mRNA表达情况确定是否发生了分化。结果从小鼠骨髓中分离到的贴壁生长的细胞表达间充质干细胞的表面标志CD90、CD44、CD105和Sca-1;细胞在体外可以被诱导分化为成骨、成软骨及成脂肪细胞。报告基因标记的间充质干细胞在被视黄酸诱导2d后开始表达绿色荧光蛋白和生殖细胞相关基因Mvh、Fragilis和Stella的mRNA。未经视黄酸诱导的细胞不表达绿色荧光蛋白和生殖细胞相关基因。结论小鼠骨髓间充质干细胞在体外可以被视黄酸诱导发生向雄性生殖细胞方向的分化。     

外泌体来源miRNAs对骨质疏松症的作用与机制的研究进展

骨质疏松症是与年龄相关的全身代谢性骨疾病,该疾病不仅发病率高,还极大地增加了患者跌倒、骨折、截瘫、死亡等风险。骨质疏松的发病与骨髓间充质干细胞成骨-成脂分化的失平衡密切相关,而大量证据表明,不同外泌体来源的miRNAs(微小RNA)在调控骨髓间充质干细胞谱系分化命运中发挥重要功能。笔者从调控骨髓间充质干细胞成骨分化与成脂分化的角度,对外泌体来源miRNAs在骨质疏松疾病中的作用与机制进行综述,为骨质疏松症的诊治提供潜在靶点和新的思路。     

间充质干细胞成软骨分化相关研究进展

软骨细胞移植疗法已成功应用于软骨损伤修复和软骨组织工程研究,但软骨细胞取材有限,因此探索软骨细胞替代物成为研究热点。间充质干细胞具有分化为骨、软骨等组织的潜能,在软骨损伤、骨关节炎修复及软骨组织工程等方面起着重要作用。该文就间充质干细胞成软骨分化相关研究进展作一综述。     

LncRNA与miRNA的相互作用调控BMSCs谱系分化的研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨与成脂分化失衡是导致骨质疏松症(OP)的主要原因之一,在治疗骨质疏松症方面,调控BMSCs的谱系分化已成为当前主要手段。随着生物学研究的不断深入,长链非编码蛋白RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)均广泛参与调控BMSCs谱系分化的过程。大多数miRNA可作为内源性竞争性RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)调控lncRNA的表达进程,许多lncRNA还充当miRNA的ceRNA以调节影响不同途径的miRNA靶向基因的表达。二者之间的相互作用对于调控BMSCs谱系分化有着更为明显的优势,故本文围绕其进行综述,为临床治疗骨质疏松症寻找新的理论和实验依据。     

婴幼儿血管瘤来源的间充质干细胞的体外多向分化实验

目的 观察婴幼儿血管瘤来源的间充质干细胞是否具有多向分化潜能.方法 应用贴壁筛选法从增生期血管瘤中分离间充质干细胞.将人骨髓中分离的间充质干细胞与切除的儿童包皮中分离的成纤维细胞作为对照.采用特异的诱导培养基,在体外诱导这3种细胞向脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞分化.结果 在合适的诱导条件下,血管瘤来源的间充质干细胞和骨髓来源的间充质干细胞均可发生成脂肪、成骨和成软骨分化,而成纤维细胞没有表现出任何分化现象.结论 应用贴壁筛选法从血管瘤分离的间充质干细胞具有多向分化潜能.     

THSD4基因在小鼠间充质干细胞及MC3T3-E1细胞成骨分化中的作用

目的 探讨THSD4基因对小鼠间充质干细胞和MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法 提取绝经后骨质疏松症患者的骨髓间充质干细胞进行基因测序分析,与骨关节炎患者的骨髓间充质干细胞进行比较,分析基因表达差异。通过提取不同分化阶段的小鼠骨髓间充质干细胞（M-BMSC）及MC3T3-E1细胞的mRNA来检测THSD4 基因以及成骨分化的标志性基因（ALP、Runx2、Osx）的表达水平。通过构建慢病毒表达载体来实现对M-BMSC及MC3T3-E1细胞中THSD4的敲减及过表达,并观察其对M-BMSC及MC3T3-E1细胞成骨分化能力的影响。结果 THSD4基因在绝经后骨质疏松症患者骨髓间充质干细胞中明显下调,且通过KEGG以及GO富集分析发现THSD4基因可能与PI3K-AKT信号通路及Wnt信号通路相关。随着成骨诱导分化时间的延长,THSD4 mRNA和成骨分化标志性基因（ALP、Runx2、Osx）mRNA在MC3T3-E1以及M-BMSC中表达量均逐渐增加。过表达THSD4可以增强MC3T3-E1细胞和M-BMSC的成骨分化能力,而敲减THSD4则减弱了MC3T3-E1细胞和M-BMSC的成骨分化能力。结论 THSD4基因在绝经后骨质疏松症患者骨髓间充质干细胞中明显下调,且THSD4基因可以增强MC3T3-E1细胞以及M-BMSC的成骨分化能力。     

miRNA在间充质干细胞成骨分化过程中的作用

间充质干细胞作为种子细胞在组织工程和再生医学领域有极大的应用前景,尤其是在骨组织工程中的应用受到了广泛关注。间充质干细胞的成骨分化机制复杂,受到多方面因素的影响,不同种类的mi RNA可分别参与抑制或促进间充质干细胞的成骨分化,在其分化过程中具有核心作用。本文对不同作用的mi RNA进行归类和总结,期待为未来的研究提供思路。     

损伤胰腺组织提取液诱导大鼠骨髓间充质干细胞向胰岛样细胞分化的实验研究

目的：探讨胰岛损伤的胰腺组织提取液诱导大鼠骨髓间充质干细胞向胰岛素样细胞分化的作用.方法：通过大鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ）建立1型糖尿病模型,6 d后剥离胰腺提取胰腺组织提取液,与SD大鼠骨髓间充质干细胞共同培养18 d,体外诱导骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化,RT-PCR法检测诱导分化后细胞的胰岛细胞相关基因的表达,葡萄糖刺激胰岛素释放实验检测诱导后细胞在高糖作用下分泌胰岛素的功能.结果：经损伤胰腺组织提取液诱导后,间充质干细胞在形态上由梭形变成多边、不规则形,且逐渐聚集成岛状.免疫荧光检测诱导细胞的胰岛素表达呈阳性,RT-PCR检测诱导细胞表达胰岛素1（Ins1）、胰岛素2（Ins2）、葡萄糖转运子2（Glut-2）、神经源素3（Ngn3）、胰腺十二指肠同源盒1（Pdx1）、同源框蛋白（Isl-1）及脑神经源性分化因子（NeuroD）等胰岛相关基因,且具备高糖诱导促进胰岛素分泌的功能.结论：在损伤胰腺组织提取液诱导下,骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞,并且具有表达胰岛相关基因和胰岛素分泌功能.     

重组人骨形态发生蛋白-2质粒转染诱导人脐血间充质干细胞软骨分化研究

目的探究从人脐血中提取间充质干细胞，重组质粒pIRES2-EGFP-hBMP-2转染干细胞并诱导其成软骨化的可能性。 方法采用密度梯度离心方法获取脐带血中细胞，依据贴壁时间不同获得间充质干细胞，流式细胞仪检测表面抗原表达鉴定细胞；然后把重组有pIRES2-EGFP-hBMP-2的质粒导入间充质干细胞，观察EGFP的表达；ELISA方法检测在不同时间收集的培养基上清中hBMP-2蛋白含量，采用免疫荧光和RT-PCR方法检测目的蛋白和基因表达。转染成功后继续培养细胞2 w，免疫组化检测细胞Ⅱ型胶原的表达和RT-PCR检测软骨特异性标志物软骨连接蛋白（CRLT1）的表达。 结果两种方法可以获取人脐血间充质干细胞，流式细胞术鉴定发现CD90、CD105、CD146高表达，CD34、CD45、Anti-HLA-DR不表达。非脂质载体包裹重组质粒pIRES2-EGFP-hBMP-2可成功导入脐血间充质干细胞，转染率为（27.7±7.6）%。ELISA检测实验组和对照组hBMP-2的表达结果有统计学差异（t=3.355，P<0.01）。RT-PCR结果表明hBMP-2基因稳定转录，免疫荧光标记hBMP-2蛋白呈红色荧光。Ⅱ型胶原免疫组化染色示部分细胞被染成棕黄色，RT-PCR结果表明加入转染后的干细胞组CRLT1的表达量比未转染的干细胞组高（t=59.700，P<0.05）。 结论重组hBMP-2基因可以成功转染人脐血间充质干细胞并在胞内稳定表达，且有hBMP-2分泌，并可促进其表达Ⅱ型胶原蛋白及软骨连接蛋白，可向软骨细胞化诱导。