刺葡萄R2R3-MYB转录因子VdMYB14调控类黄酮合成功能解析

【目的】类黄酮作为葡萄果实中一类重要次生代谢物质,进一步研究其合成调控机制对于提高果实品质具有重要意义。【方法】结合前期研究基础,以会同黑果刺葡萄(Vitis davidii‘1338’)为试材,通过qRT-PCR分析VdMYB14在6个果实不同发育阶段果皮中的表达水平变化。利用MEGA软件构建系统发育树,分析VdMYB14蛋白与其他类黄酮相关MYB蛋白的系统发育关系。利用亚细胞定位技术分析VdMYB14在细胞中的位置。在烟草中异源表达VdMYB14基因,验证其对类黄酮合成的调控功能。【结果】VdMYB14蛋白与苹果花色苷合成负调控因子MdMYB111同源度较高,亚细胞定位发现VdMYB14定位在细胞核中。与野生型相比,VdMYB14转基因烟草株系的花中原花色素含量增加,花色苷积累减少。过表达VdMYB14烟草花中,原花色素合成关键基因NtLAR和NtANR的表达量显著上调,而花色苷合成关键基因NtUFGT的表达量显著下调。【结论】VdMYB14基因能够促进原花色素合成途径关键基因的表达,抑制花色苷合成关键基因的表达,导致类黄酮前体物质倾向于原花色素合成途径,从而抑制花色苷合成,促进原花色素积累。     

不同生态条件杧果着色及花色苷合成相关基因表达比较

【目的】比较2个不同生态区杧果果实着色的差异,并探讨着色差异的内在机理。【方法】试验于2012年比较了‘台农1号’杧果在四川攀枝花和广东雷州2个生态区的果皮颜色、花色苷含量和花色苷合成相关基因表达模式差异。【结果】四川攀枝花地区高海拔、昼夜温差大,较低降雨量,该生态区‘台农1号’杧果果皮花色苷含量显著高于雷州地区,着色较好,果皮色度角显著低于雷州地区。花色苷合成基因Mi PAL、Mi C4H、Mi CHS1、Mi F3H1、Mi DFR和Mi UFGT的相对表达量以攀枝花地区显著高于雷州地区,其中Mi C4H、Mi CHS1、Mi F3H1、Mi DFR和Mi UFGT基因的相对表达量分别为雷州地区的130、228、63、2.7和4.3倍。【结论】四川攀枝花地区海拔高、辐射强和昼夜温差大等生态因子有利于诱导果皮中花色苷合成相关基因尤其是Mi PAL、Mi CHS1、Mi DFR和Mi UFGT的表达,促进‘台农1号’果皮着色。     

根域限制对‘巨峰’葡萄花色苷代谢途径关键基因表达的影响

【目的】阐明根域限制调控葡萄果皮花色苷合成的分子机制。【方法】以‘巨峰’葡萄为试材,进行根域限制栽培处理,以传统露地栽培为对照,研究‘巨峰’葡萄果实发育过程中果皮花色苷合成相关酶基因转录水平的变化,以及根域限制对果实成熟过程中果皮花色苷合成相关酶基因转录水平的影响。【结果】PAL、4CL、CHS2、CHS3、CHI、F3H1、F3H2、DFR、LDOX、F3’H、F3’5’H、OMT、3GT、5GT的转录水平自转色期开始升高,接近成熟期下降。根域限制下‘巨峰’葡萄花色苷合成相关基因PAL和F3’H的转录表达在果实成熟的部分时期受到上调,而4CL、CHS2、CHS3、CHI、F3H1、F3H2、DFR、LDOX、F3’5’H、OMT、3GT、5GT的转录表达在转色期至成熟过程中均受到了上调,CHS1在果实发育过程中其转录表达无明显上调变化且根域限制与对照差异不大。【结论】根域限制促进了葡萄果皮花色苷合成途径中14个相关基因的转录表达。     

荔枝多酚氧化酶基因启动子克隆与功能分析

【目的】获得多酚氧化酶(PPO)基因启动子序列并初步分析其功能,为进一步研究PPO基因表达规律及应用PPO基因启动子提供基础。【方法】通过TAIL-PCR和接头PCR方法相结合获得荔枝PPO基因启动子序列并进行生物信息学分析,序列缺失结合瞬时表达法分析核心启动子调控元件。【结果】从‘妃子笑’荔枝基因组中克隆获得了1048bp的荔枝PPO基因启动子序列,含有多种顺式作用元件。不同长度的启动子序列均能驱动GUS基因在‘妃子笑’、‘无核’和‘紫娘喜’荔枝叶片和果皮中表达,但都不能驱动GUS基因在‘妃子笑’和‘紫娘喜’荔枝种子中表达。【结论】获得了荔枝PPO基因启动子序列并获得了其调控基因表达的部分规律。     

RNAi沉默Fa4CL基因对草莓果实花色苷代谢的影响

【目的】探讨Fa4CL与花色苷代谢之间的关系,构建RNA干扰载体转染草莓果实,研究Fa4CL基因在草莓花色苷代谢中的功能。【方法】用RT-PCR方法从‘阿尔比’草莓(Fragaria×ananassa‘Albion’)果实中克隆Fa4CL基因。构建不含内含子的发夹结构干扰载体p BI-4CLi,将其转入农杆菌GV3101,采用无菌注射器注入到授粉后14 d的‘阿尔比’草莓果实中转染,与对照果比较表型变化、物质变化,半定量RT-PCR检测Fa4CL基因的表达量的变化。【结果】克隆的Fa4CL的CDS,长1638 bp,编码545个氨基酸。与森林草莓Fv4CL2基因序列的同源性较高,为98.4%。p BI-4CLi转染果与对照果相比,转染果的果皮红色变浅。进一步利用RT-PCR分析发现,p BI-4CLi转染果Fa4CL基因表达量明显低于对照果。分析果实花色苷含量发现,p BI-4CLi转染果的花青素糖苷和花葵素糖苷分别比对照果降低了93.5%和97.0%,差异均达到显著水平。【结论】RNA干扰载体转染草莓果实的结果证明Fa4CL成功沉默,Fa4CL基因与花色苷的合成关系密切。     

中国山葡萄‘双红’胺氧化酶(amine oxidase)基因的抗霜霉病研究

【目的】探究高抗霜霉病的中国山葡萄‘双红’中胺氧化酶(VaAO)在抗葡萄霜霉病中的作用。【方法】以中国山葡萄‘双红’为试材,采用RT-PCR技术,克隆山葡萄‘双红’的AO基因,命名为VaAO;利用RT-qPCR在转录水平上分别检测了抗病的山葡萄‘双红’和感病的欧亚种葡萄‘赤霞珠’接种霜霉菌后AO的表达模式;通过农杆菌介导的瞬时转化法,使VaAO分别在本氏烟草和葡萄‘赤霞珠’中瞬时过表达;利用DAB染色法,检测H_2O_2的积累。【结果】VaAO基因的开放阅读框(ORF)长2 184 bp,编码727个氨基酸。经BLAST比对发现VaAO氨基酸序列与欧亚种葡萄‘黑比诺’的氨基酸序列同源性高达99%。定量结果表明:抗病的‘双红’和感病的‘赤霞珠’的AO基因均受到霜霉菌诱导,且相对表达量都在接种72 h后达到最高峰。值得注意的是,VaAO在接种后24 h表现出显著上调。VaAO在烟草中瞬时表达后发现其蛋白定位在细胞核和细胞膜中。VaAO在‘赤霞珠’叶片中瞬时过表达能够显著提高叶片中H2O2的积累和抵抗霜霉病的能力。【结论】成功克隆了山葡萄‘双红’的VaAO基因,定量分析和瞬时表达均表明VaAO基因在参与葡萄抗霜霉病的过程中发挥了重要作用。     

黑莓RuMYB10基因的克隆和表达

【目的】从黑莓中克隆RuMYB10的编码区全长序列,并分析其在黑莓果实发育过程中的表达情况与果实花青素苷积累的关系。【方法】以黑莓基因组DNA为模板,通过同源克隆和SON-PCR技术获得了RuMYB10基因全长编码序列(Accession No.:JQ359611);并以黑莓果实mRNA为模板进行验证。采用实时定量PCR技术检测该基因在果实不同发育阶段的表达水平。【结果】结果表明,该基因编码区全长共1 837 bp,编码216个氨基酸,推导蛋白分子质量为24 863 Da。具有MYB转录因子家族特有的R2R3保守序列。含有两个内含子,第2个内含子长度为750 bp,占全长40.8%;在R3重复单元中存在与bHLH因子互作的‘[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R’序列;而促进花青素苷合成的MYB转录因子3个特征氨基酸残基中的丙氨酸(A)被丝氨酸(S)取代。RuMYB10基因在黑莓果实发育后期,即果实变红到最后变黑的过程中大量表达,与花青素苷的积累相一致。【结论】从黑莓中克隆到包含完整ORF的转录因子基因RuMYB10,具有MYB因子家族结构特征和bHLH因子结合域,且在果实花青素苷积累高峰期表达量最高。     

一年两收栽培‘赤霞珠’葡萄冬果与夏果花色苷组分差异解析

【目的】探究一年两收栽培模式下酿酒葡萄品种‘赤霞珠’两季葡萄花色苷的组分差异。【方法】以成熟期‘赤霞珠’冬果和夏果为试验材料,利用高效液相色谱质谱(HPLC-MS)联用技术检测其果皮中花色苷的组成和含量,并监控不同发育期浆果的理化指标变化。【结果】‘赤霞珠’冬果果粒质量小于夏果,但果皮鲜质量和可溶性固形物含量高于夏果;成熟期‘赤霞珠’冬果果皮中共检测到17种花色苷,而夏果中检测到16种;成熟期‘赤霞珠’冬果果皮中的花色苷总量及大多数花色苷含量显著高于夏果;‘赤霞珠’冬果葡萄果皮中3’,5’-羟基取代花色苷、酰化修饰及甲基化花色苷的含量显著高于夏果。【结论】通过对气候条件的分析,与夏季相比,一年两收栽培区南宁下半年较长的光照时间、较少的极端高温(≥35℃)及更为干燥的气候是酿酒葡萄冬果成熟度高、花色苷总量及稳定花色苷含量都显著高于夏果的主要原因。因此,南宁地区下半年的气候条件更有利于酿酒葡萄生产。     

基于RNA-seq的套袋对‘天源红’猕猴桃果实花色苷合成关键结构基因表达的影响

【目的】探讨套袋对红肉猕猴桃果实生长发育过程中不同部位花色苷合成关键结构基因表达的影响,为解析光照对花色苷合成分子机制的影响提供依据。【方法】以全红型软枣猕猴桃‘天源红’为试材并对其进行套袋处理,在RNA-seq的基础上,筛选候选基因,利用实时荧光定量PCR对这些候选基因在‘天源红’盛花后7个时期的果肉样品中的表达量进行相对定量。根据荧光定量结果和聚类分析,最终确定关键候选基因,利用实时荧光定量PCR对关键候选基因在‘天源红’不同处理、不同时期、不同果实部位中的表达量进行相对定量分析,并对关键候选基因的表达量和花色苷含量进行相关性分析。【结果】12个候选基因在盛花后7个时期中的表达具有一定的规律,且各自的表达规律不尽相同。在果肉颜色明显变为红色的盛花后110 d,F3H、LDOX和F3GT的表达量较其他时期高。聚类分析结果显示,LDOX和F3GT分别聚为一类,且与其他的基因明显分开。LDOX在处理1和处理2的果肉以及处理3的果心中的表达量与花色苷含量呈极显著相关,而F3GT在处理1的果肉和处理3的果心中的表达量与花色苷含量呈极显著相关。【结论】LDOX和F3GT可能是‘天源红’果实花色苷生物合成途径中的关键结构基因。套袋抑制LDOX在‘天源红’外果皮、果肉中的表达,而一直套袋促进其在果心中的表达。套袋抑制了F3GT在果肉中的表达,而对果心中F3GT的表达无明显影响。     

外源6-BA对‘美乐’葡萄花色苷合成的影响

【目的】探究6-BA对葡萄花色苷合成的影响。【方法】以酿酒葡萄’美乐’为试材,喷施不同浓度的6-BA,以喷施清水为对照,研究6-BA对花色苷含量、组分及其生物合成途径相关基因表达的影响。【结果】100和200 mg·L^-16-BA处理提高了果实着色百分率和内源激素ABA的含量,其中200 mg·L^-1处理促进了花青素的积累,其含量是对照组的4.82倍,相关性分析表明200 mg·L^-1处理组的蔗糖与花色苷含量呈显著正相关。100和200 mg·L^-16-BA处理组的葡萄果实CHS1、F3’H、F3’5’H和UFGT基因的表达量在花后90 d显著提高,6-BA处理组通过影响F3’H和F3’5’H基因的表达量来影响不同花色苷的含量,从而影响果皮色泽。【结论】在果实着色后期,低质量浓度的6-BA通过提高内源激素ABA、可溶性总糖的含量以及相关基因的表达量,促进了花色苷的积累,其中200 mg·L^-16-BA处理效果更佳。