武汉单极虫巢式聚合酶链反应检测方法的建立与优化

应用巢式聚合酶链反应(nested PCR)建立了一种检测异育银鲫武汉单极虫(Thelohanellus wuhanensis)基因组DNA的方法,提取的DNA作为模板进行两次扩增,第一次扩增用单极虫18S rRNA序列通用引物:5'-CTGCGGACGGCTCAG TAAATCAGT-3'和5'-CCAGGACATCTTAGGGCATCACAGA-3',扩增长度为1 584 bp;第二次依据第一次扩增产物中武汉单极虫特有的高度保守区设计特异性引物:5'-ACCCACTTCTGTGGC CTTTC-3'和5'-AATCCGACCTACAACGCTGG-3',扩增长度为853 bp。结果表明,通过PCR反应体系中退火温度、dNTP、Mg2+、延伸时间、扩增循环数和模板浓度的优化,优化后的巢式PCR最低DNA检测量达10 fg,优化后比常规PCR检测的灵敏度高104倍。因此,本文所建立的巢式PCR检测方法适合于水环境或水生动物中武汉单极虫的微量检测,也为异育银鲫武汉单极虫病的诊断和流行病调查提供了一种高灵敏的检测技术。     

猪弓形虫特异PCR诊断方法的建立

[目的]建立特异PCR方法诊断猪弓形虫病.[方法]以核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列作为弓形虫种特异的遗传标记,优化PCR反应条件,对猪弓形虫分离株和临床病料进行检测.随机取阳性PCR扩增片段进行克隆,测序鉴定.[结果]在猪弓形虫分离株中PCR扩增出目的条带,且在肺门淋巴结和肠系膜淋巴结中扩增出特异性条带;PCR方法能检测到的最低DNA量为7.81 pg/μL;测序结果显示核苷酸序列与Genbank中已登录的猪弓形虫IST1基因序列相应部分序列完全相同.[结论]该PCR方法具有较高的敏感性和特异性,是诊断猪弓形虫病的一种快速检测方法.     

贝氏贝诺孢子虫巢式PCR检测方法的建立

根据Gen Bank上发表的贝氏贝诺孢子虫核糖体内转录间隔区(ITS)序列,在传统PCR方法的基础上设计一对特异性内引物,提取病牛血液中贝氏贝诺孢子虫基因组DNA,建立了贝氏贝诺孢子虫巢氏PCR检测方法并进行临床样品检测。结果表明,建立的巢式PCR检测方法能检测到贝氏贝诺孢子虫DNA的最低浓度为24.3 ag·μL-1,刚地弓形虫、犬新孢子虫、牛巴贝斯虫、环形泰勒虫、边缘无浆体DNA检测均为阴性。196份临床血液样本,检测出3份阳性,阳性率为1.53%。由此可见,研究所建立的巢氏PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性,可用于牛贝诺孢子虫病的早期临床诊断。     

牛环形泰勒虫病PCR诊断方法的建立及其应用研究

[目的]建立快速检测牛环形泰勒病的PCR诊断方法.[方法]根据牛环形泰勒虫裂殖子的表面抗原(Tams1)基因,设计一对特异性引物,以地方阳性病例提取的DNA为模板,用PCR扩增出目的条带,经克隆、测序分析后,通过优化反应体系,建立牛环形泰勒虫病的PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行验证试验.[结果]测序结果表明,扩增的目的片段与已知基因序列相似性为99;;该方法检测与牛的其他血液原虫无交叉反应,其最低检出限量为1.6×102 copies/μL.应用所建立的PCR检测方法对新疆吐鲁番市周边疑似地区419份牛全血进行了检测,结果阳性率为52.3; (219/419),而血液涂片检出率为43.7;(183/419).[结论]建立的牛环形泰勒虫PCR快速诊断方法具有有一定的特异性和敏感性,可用于牛环形泰勒虫病的分子诊断和流行病学调查.     

应用特异PCR方法诊断2例猪弓形虫病

[目的]应用特异PCR方法诊断猪弓形虫病。[方法]分别以弓形虫核糖体DNA第一内部转录间隔区(ITS1)序列和529 bp重复序列为目的片段,扩增2例疑似猪弓形虫病的病料肺门淋巴结DNA,对疑似猪弓形虫病的病料进行PCR诊断。[结果]2对引物均能分别扩增出2例肺门淋巴结中弓形虫DNA的特异条带。[结论]基于2种扩增片段的PCR方法均具有较高的特异性,是诊断猪弓形虫病的一种快速检测方法。     

牛双芽巴贝斯虫病PCR检测试剂盒研制

根据PCR技术原理建立牛双芽巴贝斯虫病PCR检测方法,自主研制出牛双芽巴贝斯虫病PCR检测试剂盒,结果为该方法的敏感性约41.2pg,特异性实验表明,除牛双芽巴贝斯虫的特异扩增带(318bp)外,其他的虫株如:附红体、环形泰勒焦虫、巴贝斯焦虫DNA模板均未出现特异性扩增带。采用PCR检测方法,对35份牛血样的检测,测得牛双芽巴贝斯虫病的阳性率为28.57%(10/35),说明PCR方法敏感性强、特异性高,此方法不失为牛双芽巴贝斯虫病临床诊断的好方法。     

奶牛布鲁氏菌病病原PCR检测方法的建立

为了弥补血清学和细菌学方法检测和诊断奶牛布鲁氏菌病存在的不足,根据编码牛种布鲁氏菌31KDa外膜蛋白基因的核苷酸序列设计了1对PCR引物,通过对影响PCR扩增条件的优化,建立了快速检测奶牛布鲁氏菌病病原的PCR方法。特异性检测表明,在同一反应条件下,该引物对引起奶牛布鲁氏菌病的牛种、羊种、猪种布鲁氏菌制备的模板DNA均能扩增出384bp目的基因片段,而对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、马流产沙门氏杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌制备的模板分别进行扩增均呈阴性。敏感性检测显示,最低可检出1.5pg的模板DNA。结果表明:本试验所建立的奶牛布鲁氏菌病病原PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性。     

布鲁氏菌病病原快速检测方法的建立

根据编码牛种布鲁氏菌外膜蛋白（OMP-2）基因的核苷酸序列设计1对PCR引物,并对PCR扩增条件进行优化,建立了快速检测布鲁氏菌病病原的PCR方法。特异性检测表明,该引物对牛种、羊种、猪种布鲁氏菌制备的模板DNA均能扩增出193bp目的基因片段,但不能扩增大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠结肠炎耶氏菌（0：9型）的目的基因片段;敏感性检测显示,乳样的检测灵敏度达50cfu／mL、纯化的布鲁氏菌DNA检测灵敏度达1．5pg,可重复性和稳定性十分理想。可见,该布鲁氏菌病病原PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性,能为快速诊断布鲁氏菌病提供技术支撑。     

肉牛附红细胞体PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一个能快速准确的检测出肉牛附红细胞体的分子生物学诊断方法,及时监控好人畜共患病。试验根据Genbank中发表的肉牛附红细胞体16SrRNA序列设计一对特异性引物,通过PCR方法,对肉牛附红细胞体基因组DNA进行扩增。结果表明:扩增出了一段412 bp的DNA片段,与Genbank中发表的肉牛附红细胞体序列同源性为98%。将建立的PCR方法对大肠杆菌、弓形体、胸膜肺炎放线杆菌的DNA进行检测为阴性,检测肉牛附红细胞体DNA的最低浓度为1.23 ng/μL。该方法快速、准确、特异性好、灵敏度高,为肉牛附红细胞体病的临床诊断提供了新的方法。     

羊吕氏泰勒虫PCR检测方法的建立与应用

为建立一种准确、敏感的羊吕氏泰勒虫检测方法,根据Gen Bank上发表的羊吕氏泰勒虫18S rRNA基因序列(登录号:KC735166.1),设计1对特异性引物,建立了PCR检测方法。筛选该方法的最佳反应条件及体系,并进行了敏感性、特异性、重复性试验及临床血液样品检测。结果表明,该方法能扩增出大小为962 bp的羊吕氏泰勒虫特异性片段,与GenBank收录的相关参考序列同源性高达99.4%~99.9%;与绵羊泰勒虫、尤氏泰勒虫、环形泰勒虫、莫氏巴贝斯虫和弓形虫基因组DNA均无交叉反应;DNA最低检测量为29.13 fg·μL~(-1);具有良好的重复性;对76份羊临床血液样品检测结果表明,羊吕氏泰勒虫感染率为77.63%,高于已报道的常规PCR检测结果。     

驽巴贝斯虫PCR检测方法的建立及应用

根据驽巴贝斯虫BC-48基因序列,设计并合成1对特异性引物,建立了驽巴贝斯虫PCR检测方法。试验扩增出610 bp的基因片段,其序列与GenBank上驽巴贝斯虫BC-48基因同源性为96.7%。而对新孢子虫、弓形虫、马巴贝斯虫的基因组DNA没有扩增带出现。对驽巴贝斯虫基因组DNA的最小检测量为2.812 fg/μL。通过对35份临床样品的检测,阳性率为20%。同时与血液涂片染色镜检进行了比较,结果表明,PCR检测方法准确、敏感、特异。     

犬细小病毒病的PCR临床诊断研究

建立犬细小病毒聚合酶链式反应(PCR)检测方法,并应用于临床诊断.根据犬细小病毒基因保守序列设计一对特异性引物,扩增目的片段大小为448bp.用此引物扩增疫苗中的犬细小病毒和37份病料中的犬细小病毒,并与胶体金诊断试剂盒相对比.实验结果显示:该方法能从疫苗中和临床病料中扩增出犬细小病毒目的基因片段,与胶体金诊断试剂盒相比能克服免疫血清学诊断中的非特异性反应,具有快速、准确、灵敏度高的优点,完全适用于犬细小病毒病的临床诊断.     

甘蔗黑穗病菌DNA提取及PCR检测

本研究利用尿素混合液直接从甘蔗黑穗病菌孢子提取基因组DNA进行PCR检测鉴定,经过反复试验,建立了一种简便、快速的检测鉴定方法。利用建立的方法对12个甘蔗黑穗病样品进行病菌基因组DNA提取,将甘蔗黑穗病菌特异性引物进行PCR检测,均扩增出大小为420 bp的预期DNA片段条带。PCR扩增产物经克隆测序,与GenBank数据库中的甘蔗黑穗病病原菌序列比对,同源性达99%。     

鸡传染性喉气管炎病毒PCR快速检测方法的建立

根据GenBank发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因序列(EF552578),设计合成了1对特异性引物,通过优化反应条件,成功地从ILTV疫苗株中扩增出329 bp特异性片段,而传染性支气管炎病毒、新城疫病毒及马立克病毒基因组均未扩增为出相应的片段。回收的PCR产物经EcoRⅠ酶切和测序鉴定,证实了该扩增片段的特异性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为30 pg。经临床初步应用表明,该方法的建立使传染性喉气管炎病毒的检测更为快速、简便、经济和实用。     

马巴贝斯虫18S rRNA基因吉林省分离株的序列分析

为分析马巴贝斯虫吉林省分离株的18S rRNA基因序列，根据马巴贝斯虫18S rRNA基因序列设计1对引物，对吉林省的马匹血液基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物进行克隆、测序，扩增出大小为435bp的马巴贝斯虫18S rRNA基因片段．序列分析显示，马巴贝斯虫吉林省分离株与南非株同源性最高，为98．4％．     

应用套式PCR在MDCK细胞系中发现犬细小病毒

本研究自１９９７年至１９９９年从国内部分大学实验室、卫生防疫站和动检局陆续收集１１个犬肾（ＭＤＣＫ）细胞系样品,选取犬细小病毒基因组的ＶＰ２基因上４段核苷酸序列作引物,对样品ＤＮＡ进行套式ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）检测;ＰＣＲ扩增产物经０．０１ｇ／ｍＬ琼脂糖凝胶电泳和克隆到ｐＧＥＭ＾－Ｔ载体并进行核苷酸序列测序鉴定后,发现我国ＭＤＣＫ细胞系中存在犬细小病毒的传代病毒株。该病毒基因组部分序列测定结果显示与犬细小病毒ＣＰＶ－Ｎ株有９１％同源性。     

牛双芽巴贝斯虫巢式PCR诊断方法的建立

[目的与方法]根据Genbank上登陆的双芽巴贝斯虫HSP20基因设计两对引物, SHSP-P1与SHSP-P2和SHSP-P3与 SHSP-P4,以其建立牛双芽巴贝斯虫巢式PCR快速检测方法.[结果]第一次、第二次扩增的退火温度均为57℃,分别扩增出约631和409 bp的条带,与预期的大小相符,而作为对照样本的牛巴贝斯虫、牛环形泰勒虫基因组DNA均无此扩增目的条带出现.将感染双芽巴贝斯虫的全血基因组DNA做10倍递减稀释到106倍扩增时,巢式PCR还能见到目的条带,其灵敏度相当于4.6 pg/mL全血基因组DNA.在对50份疫区牛全血DNA样本检测中,阳性检出率分别为22; (11/50).[结论]所建立的牛双芽巴贝斯虫巢式PCR方法准确、敏感、特异,可以用于牛双芽巴贝斯虫病的快速检测和小范围的流行病学调查,具有重要的临床意义.     

银杏木质部特异定位表达基因启动子克隆

用PCR方法成功地从木本植物银杏基因组总DNA中扩增克隆得到木质部细胞特异性表达的富甘氨酸蛋白质基因 (GRP1.8)的启动子 ,并克隆到pUC18载体中 .与菜豆的序列比较发现 ,碱基同源性高达 98%以上 .除发现启动子特有的TATAbox序列外 ,还发现在菜豆序列中所没有的GATAG碱基序列     

马巴贝斯虫PCR检测方法的建立及应用

根据已发表的马巴贝斯虫18S rRNA基因序列,设计并合成一对特异性引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出一条约936 bp的基因片段,并成功地将该基因克隆于pGEM-Teasy载体,经PCR鉴定后进行序列测定.结果表明,所克隆的目的基因与GenBank中发表的序列同源性达到98.4%.并利用特异性引物初步建立了马巴贝斯虫病PCR检测技术.