大鼠精原细胞的分离纯化

目的：探讨大鼠精原细胞的分离纯化。方法：采用酶消化法制备10d Wister大鼠睾丸单细胞悬液；Percoll液不连续密度梯度分离精原细胞；用贴壁速度的差异纯化精原细胞。光电镜观察精原细胞的形态结构特征；应用酪氨酸蛋白激酶(c-kit)免疫化学鉴定精原细胞。结杲；精原细胞主要分布在28％～36％(Ⅱ带)间的Percoil梯度；分离纯化的精原细胞形态结构与组织切片上精原细胞一致，其纯度达55．68％；c-kit在精原细胞呈阳性表达，在睾丸体细胞呈弱阳性或阴性表达。结论：利用酶消化法、Percoll液不连续密度梯度及细胞贴壁速度的差异，分离纯化的精原细胞满足体外实验要求；精原细胞表达特异的c-kit受体。     

人睾丸精原细胞的分离和纯化

目的探讨人睾丸精原细胞的分离纯化.方法用联合二步酶消化法获得人生殖细胞悬液,经Percoll不连续密度梯度离心,再用差异粘附法纯化得到成活率较好、含量较高的人精原细胞.结果所获得睾丸组织细胞悬液内活细胞、死细胞平均所占百分比分别为89.71%、10.29%.Percoll不连续密度梯度中,细胞主要在相邻梯度的界面处形成细胞带,其中精原细胞主要分布于27%～35%Percoll梯度间,根据细胞体外培养时的形态学特征等进行判断和分析,经纯化后精原细胞的纯度达到60.42%.结论应用联合酶消化法、Percoll不连续密度梯度离心和差异粘附等方法可以有效地对人精原细胞进行分离和纯化.     

新生小鼠精原细胞分离和纯化的实验研究

目的：分离和纯化7～8d新生雄性小鼠精原细胞,为深入研究生精机理及其影响因素提供细胞来源和技术支持。方法：采用组合酶消化法制备7～8d雄性小鼠的生精细胞悬液：Percoll密度梯度离心法分离精原细胞,贴壁培养法进一步纯化精原细胞：滴片进行碱性磷酸酶染色：取同时间段雄性小鼠睾丸组织冰冻切片进行碱性磷酸酶染色。结果：精原细胞主要分布于45％～55％梯度间的Percoll中,经贴壁培养后纯度达75．2％。结论：用上述方法成功地分离和纯化了小鼠精原细胞。     

大鼠精原细胞的分离纯化及鉴定

目的精原细胞在精子发生过程中起着重要作用,而精原细胞的分离纯化开展后续研究的基础。实验试图建立大鼠精原细胞的分离纯化方法寻找合适的培养条件。方法用组合酶消化出生9～10 d雄性SD大鼠睾丸组织,利用睾丸体细胞易于和塑料以及胶原介质结合的原理连续贴壁获得精原细胞。结果实验得出每只睾丸提取出的精原细胞数量为5×105个细胞。经碱性磷酸酯酶（BCIP/NBT）显色,阳性率〉90%;选用C-kit做为表面标志对纯化的精原细胞进行流式细胞分析,阳性率为85%,用台盼蓝排斥试验检测出细胞的存活率〉85%。结论运用组合酶消化大鼠睾丸细胞悬液,并结合连续贴壁法获得较高纯度的精原细胞可基本满足雄性生殖医学方面的研究。     

大鼠胰岛分离和纯化

目的观察胶原酶消化法对大鼠胰岛的分离结果.方法用胶原酶法分离、Ficoll400 密度梯度离心法纯化胰岛.用DTZ法判定胰岛的纯度;用AO/PI法判定胰岛存活率;用胰岛素释放试验和移植糖尿病大鼠法判定胰岛功能.结果纯化后的胰岛收获量为(500-700)个/每只胰腺,胰岛纯度大于85%,活度大于95%,胰岛细胞体外培养液中胰岛素含量在基础相和刺激相为(18.32±3.57)mu/L、(32.25±3.74)mu/L,差异有显著性(P＜0.05),胰岛移植后,实验组2天后血糖浓度降至正常,对照组无改变,实验组正常血糖维持时间(5.1±2.4)d.结论胶原酶消化、Ficoll400密度梯度离心法可获得高纯度和活力的大鼠胰岛.     

对大鼠胰岛两种不同分离纯化方法的实验研究

目的 选择最佳鼠胰岛的制备方法。方法 采用不同的胶原酶消化法及不连续密度梯度纯化法。结果 Dextran法和Ficoll法分离纯化出胰岛细胞成活率无明显差异，且价格相差数十倍。结论 可以用Dextran纯化液替代Ficoll纯化液。     

大鼠睾丸Leydig细胞的分离纯化技术方法研究

目的 为了深入研究Leydig细胞及其调控因素，采用本实验以获取较高纯度(60％～85％，甚至90％以上)的Leydig细胞。方法 利用Percoll不连续密度梯度离心法，可以简便迅捷地获取较高纯度(60％～85％，甚至90％以上)的Leydig细胞。结果 得到较高纯度(60％～85％，甚至90％以上)的Leydig细胞。结论 本实验采用简便迅捷的方法，虽然不能得到高纯度(95％以上)的Leydig细胞，但可以用简单的设备，较短的时间，获得满足实验要求的较高纯度(60％～85％，甚至90％以上)的Leydig细胞，并通过体外细胞培养，取得具有生物学活性的Levdig细胞克隆，为进一步研究这种细胞提供了条件。     

成年大鼠胰岛分离纯化的实验研究

为探讨成年大鼠胰岛分离、纯化的方法 ,为成人胰岛细胞的分离纯化奠定基础 ,采用胰管内注射胶原酶水浴孵化以及不连续密度梯度法进行成年Lewis大鼠胰岛分离纯化 ,并对获得的胰岛细胞通过体外葡萄糖刺激胰岛素分泌实验进行功能活性检测。分离后获得 (93 8± 2 1 8)个胰岛细胞 ,染色观察胰岛细胞形态完好。纯化后获得 (80 2±1 81 )个胰岛细胞 ,平均纯度为 (68± 1 1 ) % ,纯化后细胞回收率为 (85 .9± 5 .9) % ,纯化后细胞形态完好。体外葡萄糖刺激胰岛素分泌实验 ,低糖情况下胰岛素分泌量为 (2 .5 3± 0 .1 8)mIU/L ,高糖情况下为 (5 .41± 0 .3 1 )mIU/L ,两者相比有极显著性差异 (P =0 .0 0 1 )。低糖刺激下C肽分泌量为 (7.5 1± 1 .0 9)ng/L ,高糖情况下为 (8.5 6± 1 .0 6)ng/L ,具有极显著性差异 (P =0 .0 0 6)。提示 :采用胰管内胶原酶灌注水浴孵化进行成年大鼠胰岛分离及不连续密度梯度法纯化可获得较多的〔(80 2± 1 81 )个〕形态及功能完好的胰岛细胞 ,为临床进行成人胰岛分离纯化打下了基础     

大鼠胰岛细胞分离纯化的实验研究

目的优化胰岛细胞分离纯化的方法,提高胰岛产量、纯度和功能。方法本实验经胰管注射胶原酶、胰腺静止消化分离成年大鼠胰岛,葡聚糖离心纯化,获得胰岛细胞,进行记数和功能鉴定。结果纯化后胰岛收获量为7021±861IEQ/胰腺(IEQ=胰岛当量,一个胰岛当量为一个150μm直径的胰岛),纯度达86%;胰岛形态结构完整,胰岛素释放试验显示胰岛细胞功能良好。结论细节优化可以显著提高胶原酶消化、葡聚糖不连续梯度离心分离胰岛的效率。     

大鼠A型精原干细胞的分离和纯化

目的摸索完善A型精原干细胞分离、纯化的方法与技术。方法选用9d的SD大鼠,不连续Percoll梯度液分离纯化精原干细胞,应用选择性贴壁法进一步纯化精原干细胞;台盼蓝排斥实验确定精原干细胞的活力;HE染色法观察细胞形态;c-kit细胞免疫组化鉴定细胞类型并进行细胞纯度分析。结果台盼蓝实验显示细胞活力维持于88.73%±0.85%;c-kit细胞免疫组化结果显示分离得到细胞为精原干细胞;细胞纯度为90.48%±1.78%。结论应用梯度离心及选择性贴壁法获得了纯度较高的A型精原干细胞。     

大鼠胰岛分离纯化和功能分析的研究

目的:探讨大鼠胰岛分离纯化的方案.方法:采用胰管内灌注胶原酶V消化、Histopaque-1077密度梯度离心分离纯化20只雄性SD大鼠胰岛.椎虫蓝染色判断胰岛存活率,双硫腙染色后计数胰岛,葡萄糖刺激胰岛素释放实验评估胰岛功能,同种异体胰岛门静脉移植治疗5只链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠,监测血糖变化.结果:分离纯化后平均胰岛得率为(646±67)个/大鼠,存活率达到90%以上.新鲜分离的胰岛呈椭圆或圆形,悬浮于培养液面,胞膜光滑完整,直径大于150μm的细胞团占95%以上.葡萄糖刺激的胰岛素释放试验结果表明:第1、3、5天胰岛的刺激指数分别为2.6倍、1.7倍和1.4倍,两组间低糖和高糖的胰岛分泌量差异均有显著性(P＜0.05).胰岛门静脉移植术后,第2天大鼠血糖降至11.1 mmol/L,8天内血糖可控制在15 mmol/L以下,随后血糖逐步升高.结论:采用胰管内灌注胶原酶V消化联合Histopaque-1077分离纯化是一种较好的大鼠胰岛分离方法,胰岛得率较高且功能良好.     

大鼠树突状细胞的体外分离、纯化、扩增及鉴定

目的 探讨诱导及纯化大鼠树突状细胞（Dendritic cells,DC）的方法，为进一步研究树突状细胞的功能、特性及临床应用提供技术方法。方法 应用重组大鼠rGM-CSF、IL－4在体外培养大鼠骨髓前体细胞获得大量DCs，经标抗大鼠OX62单抗免疫磁株分离纯化后的DCs经形态学观察、表型检测、功能学实验鉴定。结果 大鼠骨髓来源的DC在体外培养12－14d后完全成熟，99．36％培养纯化后DC表达大鼠特异性表面标志OX62；典型的成熟大鼠DC形态上类似于小鼠和人类的DC，表型为MHCⅡ＋＋，OX62＋＋，FcγR（CD32）＋／－，CD80＋／－，CD86＋＋，体外功能分析显示该DC能够强烈刺激MLR并有效递呈可溶性抗原OVA刺激初始型T细胞的增殖。结论 成功地建立了体外大量扩增大鼠骨髓DC的方法，为研究其在异种移植及诱导免疫耐受的作用打下基础。     

大鼠脾脏20S蛋白酶体的分离纯化及电镜观察

目的　分离纯化正常大鼠脾脏 2 0S蛋白酶体 ,并观察其形态特征。方法　采用分级盐析、离子交换层析及凝胶过滤方法 ,分离纯化了正常大鼠脾脏 2 0S蛋白酶体 ,并进行透射电镜观察。结果　所制备的2 0S蛋白酶体纯度较高 ,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)显示 1条带 ,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)显示 8条带 ,分子量为 ( 19.8～ 31.7)× 10 3;电镜观察显示 ,脾脏 2 0S蛋白酶体呈现典型的圆筒状 ,具有同其它细胞 2 0S蛋白酶体一样的形态特征。结论　这为进一研究 2 0S蛋白酶体结构与功能的关系奠定了基础。     

Isolation of Subtype Spermatogonia in Juvenile Rats

The present study was aimed at finding an effective method to isolate and purify the subtype of type A spermatogonial stem cells （SSCs） in juvenile rats. Testes from 9-days-old rats were used to isolate germ cells by using two-step enzymatic digestion. The expression of c-kit in the testes of the rats was immunohistochemically detected. After isolation, cell suspension was enriched further by discontinuous density gradient centrifugation. Then type A1-A4 spermatogonia was isolated from the purified spermatogonia with c-kit as the marker by using fluorescence-activated cell sorting （FACS）. Electron microscopy was used to observe their ultrastructure. Finally, highly purified and viable subtype of SSCs was obtained. Cells separation with discontinuous density gradient centrifugation significantly increased the concentration of c-kit positive cells [（18.65±1.69）% after the centrifugation versus （3.16±0.84）% before the centrifugation, P〈0.01]. Furthermore, the recovery and viability were also high [（65.9±1.24）% and （85.6±1.14）%]. It is concluded that FACS with c-kit as the marker in combination with discontinuous density gradient centrifugation can well enrich type A1-A4 spermatogonia from the testes of 9-days-old rats.