幽门螺杆菌Lpp20抗原的原核表达及其临床应用

目的 获得原核重组表达的人幽门螺杆菌(helicobacter pylori,Hp)脂蛋白(lipoprotein20,Lpp20),并将其用于Hp感染的血清学检测.方法 应用PCR技术从Hp标准株NCTC11639染色体DNA中扩增出Lpp20的编码基因片段,先进行T-A克隆和测序,并与Genbank公布的其它Hp菌株基因序列比较,再将目的 基因克隆至表达载体pGEX-4T-1上,在E.coli TOP10中进行表达并进行GST-亲和层析纯化,用Western blot方法检测纯化产物Lpp20与Hp感染患者血清的反应,以Lpp20为包被抗原建立ELISA法对143份血样进行检测,并以试剂盒为参照.结果 扩增的Lpp20基因全长528 bp(GenBank登录号为DQ106902),与GebBank上公布的其它Hp菌株的序列相比较,核苷酸序列的同源性为96%～97%,推定氨基酸序列的同源性为98%～100%,表达的Lpp20融合蛋白分子量约为48 kDa,纯化产物可被Hp感染患者血清识别,以重组的Lpp20抗原建立的ELISA法检测Hp感染与试剂盒没有显著性差异.结论 重组Lpp20蛋白具有较好的抗原性,可用Hp感染的临床血清学检测及流行病学研究.     

Cpn0585蛋白的免疫活性及血清学诊断初步评价

目的克隆肺炎嗜衣原体包涵体膜蛋白Cpn0585基因,初步探讨其在血清学诊断中的应用价值。方法构建pGEX-6p-2／Cpn0585重组质粒,诱导表达并纯化重组蛋白,免疫BALB／c小鼠,间接酶联免疫附试验（ELISA）检测小鼠血清抗体滴度,以重组蛋白作为ELBA包被抗原检测血清中CpnIgG抗体和检测36份Cpn-／Ct＋IsG阳性参考血清。结果高效表达和纯化出一相对分子质量约为95kDa的重组蛋白,蛋白质印迹法证明其能与人抗CpnIgG抗体发生反应;在被免疫的BALB／c小鼠体内,特异性IgG抗体的滴度为1：12800;检测104例临床血清标本中的IgG抗体,与以色列SavyonDiagnostics公司SeroCPTMIgGELISA诊断试剂盒的检测结果进行比较,符合率为98．3％。结论表达的Cpn0585重组蛋白具有良好的免疫活性,在Cpn的血清学诊断中具有较高的应用价值。     

免疫印迹法检测血清幽门螺杆菌抗体的应用价值

目的评价免疫印迹法检测幽门螺杆菌（H.pylori）抗体的临床性能,探讨免疫印迹法检测血清幽门螺杆菌抗体和免疫学分型的临床意义。方法应用免疫印迹法检测360例上消化道疾病患者和20名无消化道疾病的健康志愿者血清幽门螺杆菌空泡毒素（VacA）、细胞毒素（CagA）和尿素酶（Urea）等抗体。根据幽门螺杆菌抗体的表达进行幽门螺杆菌Ⅰ型（毒力型）和Ⅱ型（非毒力型）免疫学分型,并结合14C-UBT尿素呼气试验进行分析。结果免疫印迹法诊断幽门螺杆菌感染的敏感性为96.7%,特异性为40.4%。免疫印迹法检出该组幽门螺杆菌抗体阳性率为81.7%。其中幽门螺杆菌Ⅰ型阳性率（53.7%）高于对照组（25.0%）,而Ⅱ型阳性率（28.0%）低于对照组（50.0%）。结论免疫印迹法检测血清幽门螺杆菌抗体在幽门螺杆菌的流行病学调查、血清学诊断和免疫学分型等方面具有独特的应用价值。     

武警总医院戒烟门诊开诊

目的：建立一种快速检测抗H．pylori IgO抗体的幽门螺杆菌尿素酶抗体检测试剂盒（胶体金法）。方法：以柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,组装胶体金免疫层析快速诊断试纸条。结果：用柠檬酸还原法制备的胶体金溶液呈亮红色,以此试纸条检测临床血清标本。受检血清中抗Hp血清抗体IgG胶体金法中出现l条红色（对照）沉淀线,为血清学诊断阴性;出现2条红色（样品和对照）沉淀线,为血清学诊断阳性。     

间日疟原虫MSP1 C重组蛋白的制备及其在血清学诊断中的应用

目的在大肠埃希菌（E，coli）中表达、纯化间日疟原虫裂殖子表面蛋1C端重组蛋白（rGST—PvMSP1C）作为诊断抗原，评价其在间日疟血清学诊断中的应用价值。方法将含有重组质粒pGEX-4T-2／PvMSP1C的工程菌E．coil BL21（DE3）以IPTG进行诱导表达，表达产物以SDS—PAGE与Western—blot免疫印迹进行鉴定；采用GST融合蛋白层析柱进行分离纯化；以纯化重组蛋白包被酶标板，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测间日疟患者血清中的特异性IgG抗体。结果含有重组质粒pGEX-4T-2／PvMSP1C工程菌经IPTG诱导表达的rGST—PvMSP1C重组蛋白大小约63ku，能够被间日疟患者的血清所识别。纯化的重组蛋白SDS—PAGE电泳显示一条预期大小的蛋白条带；以重组蛋白作诊断抗原，67份镜检阳性的间日患者血清标本ELISA均为阳性。55份健康人血清ELISA均为阴性．5份恶性疟患者血清及7份血吸虫患者血清检测结果亦为阴性。结论在大肠埃希菌中表达纯化的间日疟原虫rGST—PvMSP1C蛋白具有免疫反应性，以其作为诊断抗原建立的血清中特异性IgG抗体ELISA检测方法具有良好敏感性和特异性，在间日疟的免疫学诊断中具有一定的推广使用价值。     

人巨细胞病毒重组PP150的原核表达及其酶联免疫吸附试验检测

目的 探讨人巨细胞病毒重组抗原PP150的原核表达及在酶联免疫吸附试验检测（ELISA）中的应用。方法 采用基因工程方法组建含有巨细胞病毒PP150蛋白强抗原决定簇基因的重组抗原克隆，进行诱导表达及纯化，在此基础上，以纯化的重组PP150蛋白作为包被抗原，对各种条件进行优化（如抗原的包被，作用时间及底物的选择），确定了判定标准，建立了检测HCMV IgM抗体的间接ELISA方法．用此方法检测了266份血清样品，并与DSL公司ELISA试剂盒检测结果相比较。结果 重组表达质粒pMAL-P2-PP150可在E.coliDH5a中有效表达，表达产物经SDS—PAGE电泳后，凝胶成像系统分析显示相对分子质量约为Mr64000，约占菌体蛋白的10％。Westem—blot检测，阳性识别率为80．0％（12／15）。用此蛋白包被ELISA板，检测正常孕妇血清，诊断符合率为98．1％，敏感性达88．2％，特异性100％。应用该方法对正常人血清样品检测HCMV-IgM，阳性率为4．1％。结论 该重组蛋白具有良好的抗原性，可望替代HCMV感染检测中的全病毒ELISA试剂盒。     

ASSURE快速血清学检测试剂盒在北京地区诊断幽门螺杆菌现症感染的价值

目的：通常血清学抗体检测被认为不能诊断幽门螺杆菌的现症感染，因此，缺乏一种简便、可靠、价廉的非侵入性的检测方法。本研究评价了一种新的血清学方法（ASSURE Hp IgG体检测试剂盒）在北京地区诊断幽门螺杆菌现症感染的敏感性、特异性及准确性。方法：纳入半年内未进行根除Hp治疗，一月内没有服用质子泵抑制剂，H2-受体阻断剂，铋剂及任何抗生素的门诊患者，以ASSURE Hp IgG抗体检测试剂盒诊断幽门螺杆菌现症感染，并同时与^13C-尿素呼气试验比较。计算该药盒在北京地区诊断幽门螺杆菌现症感染的敏感性、特异性及准确性。结果：98例符合纳入标准的患者．^13C-尿素呼气试验阳性34例．阴性64例；ASSURE Hp IgG抗体检测-CIM带检测阳性45例，阴性53例。该试剂盒检测诊断Hp现症感染的敏感性为88．2％，特异性为75．4％。准确性80．6％。该试剂盒对半年前曾经接受幽门螺杆菌根除治疗者诊断Hp现症感染的敏感性100％．特异性68．4％，准确性76．9％。对从未接受过幽门螺杆菌根除治疗者诊断Hp现症感染的敏感性85．2％，特异性80％，准确性81．9％。结论：ASSURE Hp IgG抗体快速测定检测是一种操作简便、快捷、经济、安全的新型的非侵入性的诊断幽门螺杆菌感染的方法，其敏感性为88．2％，适合于临床上患者的初次筛查．尤其适合于从未接受过幽门螺杆菌根除治疗的患者现症感染的诊断。     

小鼠肝炎病毒N蛋白间接ELISA方法的建立

目的运用重组蛋白作为包被抗原建立检测小鼠肝炎病毒抗体的间接ELISA方法。方法将大肠杆菌表达小鼠肝炎病毒核衣壳蛋白（Nucleocapsid N）的主要抗原域NP（S）纯化后作为诊断抗原,通过条件优化,建立检测小鼠肝炎病毒抗体的间接ELISA方法。结果确定其包被抗原的浓度为300 ng/mL,血清稀释度为1∶200,山羊抗小鼠酶标抗体的稀释浓度为1∶3000。S/P≥0.386则为阳性,S/P〈0.308为阴性,两者之间为可疑。经阻断试验、交叉试验和重复性实验,表明该方法特异性强,重复性好。与国家实验动物检测中心的MHV全病毒ELISA抗体诊断试剂盒比较,特异性、敏感性和符合率分别为94.1%、93.3%和93.9%。用该融合蛋白包被聚苯乙烯板后在-20℃下可保存5个月,应用该方法检测了98份送检的血清样品,有10份检测为阳性。结论本研究建立的间接ELISA特异性强,重复性好,为进一步开发MHV血清抗体诊断试剂盒奠定了基础。     

幽门螺杆菌感染对血脂代谢的影响

目的探讨幽门螺杆菌感染对血脂代谢的影响。方法急性心肌梗死患者30例和32例非冠心病患者,采用酶联免疫吸附法（间接ELISA法）检测血清抗幽门螺杆菌特异性IgG抗体,同时使用全自动生化分析仪测定血脂各项。结果病例组血清抗幽门螺杆菌特异性IgG抗体阳性为14例,而对照组4例阳性。急性心肌梗死组胆固醇及脂蛋白（a）水平明显高于对照纽。结论幽门螺杆菌感染干扰胆固醇及脂蛋白（a）的代谢并促进动脉粥样硬化的发展。     

重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫学性质研究

目的 分析重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫学性质。方法 重组尿素酶B亚单位注射免疫BALB／c小鼠、家兔，双向琼脂扩散、ELISA、免疫印迹分析特异抗体的产生及性质。结果 重组尿素酶B亚单位能有效刺激机体的免疫应答，且产生的抗体能与天然幽门螺杆菌发生抗原抗体反应。结论 重组尿素酶B亚单位表现出天然幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫学性质，提示可作为幽门螺杆菌特异性抗体检测的包被抗原及幽门螺杆菌疫苗的有效成分。     

用免疫印迹技术研究儿童抗幽门螺杆菌循环抗体

用活检粘膜细菌培养、快速尿素酶试验和病理切片HE染色等方法对60例有症状儿童进行了幽门螺杆菌（HP）感染状况的检测，在此基础上建立了检测抗HPIgG抗体的免疫印迹方法。引入半定量积分法表示结果，IgG积分≥2分为阳性，则免疫印迹方法检测抗HgIgG抗体的敏感性为91．1％，特异性为80．0％。用免疫印迹技术对儿童血清中抗HgIgG、IgA、IgM抗体进行分析并与成人相比较，结果发现：与成人相比，儿童IgG识别条带与成人相似，IgA识别条带少而浅，IgM识别条带多而深，在活检粘膜HP为阳性、免疫印迹IgG为阴性的4个病例中，3例lgM为阳性；在HP阳性患者中，儿童抗HPIPM抗体的阳性率（88·9％）远高于成人16·3％（P＜0·001），说明抗HPIPM抗体可指示HP早期感染。     

幽门螺杆菌双基因多表位重组原核表达工程菌的构建及其表达特性的研究

目的构建含幽门螺杆菌尿素酶保守基因序列ureI和ureB的双基因（简称IB）多表位原核表达质粒以及原核表达T程菌,并研究其微生物学特性。方法通过生物信息学方法从ureI和ureB基凶中筛选T细胞和B细胞优势表位基因序列,人工合成所选择的表位基因序列并构建原核重组表达质粒pET28a（＋）／IB。经限制性内切酶（EcoR I,XhoI）鉴定及DNA测序鉴定后,将重组质粒导人大肠杆菌BL21（DE3）。该工程菌经IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测重组蛋白（riB）的表达情况,用Westernblot检测riB的免疫反应性。结果构建的双基因多表位基因序列与所设计的一致;工程菌经IPTG诱导后做SDS-PAGE电泳显示,在28kD左右有一条明显蛋白条带,Westernblot结果显示在28kD左右出现特异反应条带。结论成功构建含ureI和ureB双基因序列的原核表达质粒pET28a（＋）／IB及工程菌,该工程菌表达的重组蛋白riB能被抗幽门螺杆菌悉尼株（H．pylori SSl）的特异抗体所识别,表明该新重组蛋白与幽门螺杆菌有高度相关性。     

幽门螺杆菌BIB原核表达工程菌的构建及微生物学特性分析

目的构建融合了幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白（Ure I）、尿素酶B亚单位（UreB）的表位基因及霍乱毒素B亚单位（CTB）的原核表达质粒pET28a（＋）／ct B／ure I-B（简称BIB）及其原核表达工程菌,并研究其生物学特性。方法参考基因库中ure l、ure B、ct B的基因序列,合成不舍信号肽的ct B基因及ure I、ure B优势表位基因,串联融合,形成多靶点重组ct B／ure I-B基因（简称BIB基因）,并构建pET28a（＋）／BIB原核表达质粒,经限制性内切酶Nco I、Xho I酶切以及DNA测序鉴定正确后,将重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）中,构建含BIB基因的原核表达工程菌。经乳糖诱导后,SDS-PAOE电泳检测重组蛋白（rBIB）,Western blot及肌注BALB／c小鼠实验检测rBIB的免疫反应性和免疫原型。结果构建的原核表达质粒pET28a（＋）／BIB,经双酶切和测序分析显示,构建的BIB基因与设计序列100％一致。乳糖诱导后,SDS-PAGE电泳显示在33kD左右出现一条明显蛋白条带,Western blot检测在33kD左右出现特异反应条带,肌注免疫BALB／c小鼠产生了较高的抗体水平。结论成功构建了pET28a（＋）／BIB原核表达质粒及BIB原核表达工程菌,该工程菌可表达重组蛋白rBIB,且该重组蛋白具有良好的免疫反应性及免疫原性。     

HP感染及根除对十二指肠球部溃疡患者IL-18水平的影响

目的探讨幽门螺杆菌(H.pylori,HP)感染及根除对十二指肠球部溃疡患者IL-18水平的影响,同时检测抗HP治疗前后抗体水平的变化.方法40例HP阳性的十二指肠球部溃疡患者,作为实验组随机分成治疗组和对照组各20例,并以20例健康体检者为体检组,观察近期疗效及HP根除情况,同时ELISA法检测HP-IgG及IL-18水平。结果HP阳性十二指肠球部溃疡患者外周血清IL-18及HP-IgG水平显著高于体检组,抗HP治疗后十二指肠球部溃疡患者的IL-18、HP-IgG抗体水平均有明显下降。结论抗HP治疗后IL-18水平的下降在十二指肠球部溃疡的治疗过程中发挥重要作用。     

幽门螺旋杆菌感染者尿液中特异性IgG及亚类的检测

目的 研究幽门螺旋杆菌感染者尿液中特异性循环抗体在幽门螺旋杆菌诊断上的应用。方法采集经C^14尿素呼气实验确诊的幽门螺旋杆菌患者尿液，ELISA法测定尿液中抗幽门螺旋杆菌特异性IgG及亚类（IgG1，IgG2，IgG3）抗体；同时用健康人群尿液作为阴性对照。结果C^14尿素呼气实验幽门螺旋杆菌患者尿液中抗幽门螺旋杆菌IgG抗体的检出率为96％（47／49），其中IgG1为96％（47／49），IgG2为20％（9／49），IgG3为32％（16／49），健康人群尿液中有4％的假阳性，但在健康人群中无幽门螺旋杆菌IgG2和IgG3特异性抗体检出。结论幽门螺旋杆菌患者尿液中存在抗幽门螺旋杆菌的特异性循环抗体，提示尿液中的抗体可以作为幽门螺旋杆菌感染的诊断标志，特别是尿液中的IgGl抗体可以作为幽门螺旋杆菌病的诊断的依据。     

Oral immunization of mice with vaccine of attenuated Salmonella typhimurium expressing Helicobacter pylori urease B subunit

Objective To prepare the live recombinant vaccine of attenuated Salmonella typhimurium SL3261 expressing Helicobacterpylori （H. pylori） B subunit （UreB） and to determine whether it could be used as an oral vaccine against H. pylori infection. Methods Using genomic DNA of H. pylori Sydney strain （SS1） as template, the H. pylori UreB gene fragment was amplified by PCR and subcloned into the expression vector pTC01. The recombinant plasmid pTC01-UreB was then transferred into LBS000 to obtain modified forms, and further conversed into the attenuated Salmonella typhimurium SL3261 to obtain recombinant SL3261/pCT01-UreB as an oral immunization reagent, which was then used to orally immunize Balb/c mice twice at a three-week interval. Twelve weeks later, anti-UreB IgA antibodies in intestinal fluid and IgG antibodies in sera were determined by ELISA. The relating data in control groups （including body weight, gastric inflammation, etc.） were also collected. Results The sequencing analysis showed that the UreB gene fragment amplified by PCR was consistent with the sequence of the H. pylori UreB gene. The restriction enzyme digestion revealed that the correct pTC01-UreB was obtained. SDS-PAGE and Western blot showed that a 61KD protein was expressed in SL3261/pTC01-UreB, which could be recognized by anti-H, pylori UreB antiserum and was absent in the control containing only Salmonella typhimurium SL3261 strain. The multiple oral immunization with SL3261/pTC01-UreB could significantly induce H. pylori specific mucosal IgA response as well as serum IgG responses. IFN-T and IL-10 levels were significantly increased in SL3261/pTC01-UreB group, and no obvious side effect and change in gastric inflammation were observed. Conclusion The attenuated vaccine of Salmonella typhimurium expressing H. pylori UreB can be used as an oral vaccine against H. pylori infection.     

幽门螺杆菌临床菌株flaB基因的克隆和表达及鉴定

目的：克隆幽门螺杆菌（Hp）鞭毛素B基因（flaB），构建其原核表达系统，鉴定融合蛋白免疫性。方法：采用高保真PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株Y06中扩增flaB基因，T-A克隆后测定核苷酸序列，构建pET32a的flaB表达载体，在E.coli BL21DE3宿主中用不同浓度的IPTG诱导表达，采用Hp全菌抗体的Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。ELISA检测125例胃、十二指肠粘膜活检标本尿素酶阳性患者血清中FlaB抗体和41株Hp临床菌株FlaB表达。结果：所克隆的flaB基因与报道的相应核苷酸序列同源性为96.31％-97.73％，氨基酸序列同源性高达99.41％-100.00％。pET32a-flaB-BL21DE3系统的FlaB融合蛋白表达量为细菌总蛋白的40％左右。FlaB融合蛋白能与Hp全菌抗体发生结合反应，免疫家兔能获得高效价抗体。结论：本研究成功地构建了Hp flaB高效原核表达系统，所表达的FlaB融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性；Hp临床菌株FlaB表达率高，且能刺激机体产生抗体。FlaB可作为Hp疫苗及诊断试剂盒的抗原。     

宁波地区体检人群幽门螺杆菌现症感染及血清胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ水平调查分析

目的 研究宁波地区体检人群幽门螺杆菌（Hp）现症感染情况以及血清胃蛋白酶原（PG）水平,分析Hp现症感染与PG水平间存在的关系.方法 分别用幽门螺杆菌IgG抗体检测试剂盒（ASSURE H.Pylori Rapid Test）和化学发光微粒子免疫检测法测定宁波市医疗中李惠利医院体检中心852例体检人员的Hp现症感染率与血清PG Ⅰ/Ⅱ水平,用SPSS软件对该人群不同性别和年龄段间血清PG Ⅰ、PGⅡ、PG Ⅰ/PGⅡ比值以及Hp现症感染的情况进行分析.结果 男女间以及同性别不同年龄段间Hp现症感染率并无差异;男性PG Ⅰ较女性高;血清PG Ⅰ含量随年龄段的升高基本呈上升趋势,血清PGⅡ含量随年龄段的变化相对较小;无论男女、不同年龄组Hp现症感染阳性组的PG Ⅰ、PGⅡ的值都明显高于Hp现症感染阴性组人群,而PG Ⅰ/PGⅡ比值则明显降低.结论 宁波地区体检人群中,血清PG水平与年龄、性别、Hp现症感染相关,定期进行Hp现症感染的检测及血清PG Ⅰ/Ⅱ水平的检测对早期胃部疾病的评估与筛查可能有重要意义.     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的表达及免疫原性

目的克隆幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(NAP)基因并制备其原核表达系统,研究其表达蛋白的免疫原性,为Hp疫苗研制提供理论依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增Hp-NAP基因,测序并作同源性分析后,亚克隆入原核表达载体pET-22b,转化表达菌BL21-CodonPlus(r)(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,Western blot鉴定其免疫原性。结果PCR扩增一408 bp产物,与基因库中相关序列具有高度同源性(>98%)。重组质粒pET-22b-nap转化BL21-CodonPlus(r)(DE3)后表达一相对分子质量约19 000的融合蛋白,能与Hp全菌抗体产生结合反应,Western blot显示特异的单一条带。结论成功构建Hp-NAP原核表达系统,所表达NAP融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Hp疫苗的候选抗原。