鸡源性HMGB1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

从鸡胚原代细胞CEF中扩增出鸡HMGB1基因,构建重组原核表达质粒p ET-28a-ch HMGB1,并将p ET-28a-ch HMGB1转入大肠杆菌BL21(DE3)中,于37℃进行诱导表达,经SDS-PAGE分析表明该重组蛋白可以在大肠杆菌中高效表达且以可溶性蛋白的形式存在。蛋白通过Ni-NAT纯化树脂亲和纯化,并作为免疫原制备鼠抗ch HMGB1多克隆抗体血清。该多克隆抗体同时具有ELISA、Western blot和IFA效价,且特异性识别禽源细胞内HMGB1蛋白。     

鸭TLR3基因胞外区的原核表达及抗体制备

采用PCR方法扩增鸭TLR3基因胞外区,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导后,表达重组TLR3蛋白,并从包涵体中纯化重组蛋白。结果显示,PCR扩增得到972 bp的TLR3基因胞外区,用纯化的重组TLR3蛋白免疫实验兔,制备TLR3的多克隆抗体,用Western blot和ELISA检测其特异性及效价。本研究成功表达了TLR3基因胞外区,用该蛋白免疫实验兔后,制备的多抗能与TLR3特异性反应。     

Ⅱ群禽腺病毒五邻体蛋白单因子血清的制备

通过PCR方法扩增得到Ⅱ群禽腺病毒火鸡出血性肠炎病毒(HEV)的五邻体(penton)基因,并构建了原核表达载体pET-32a-penton,将其转化至E.coil BL21中,通过诱导表达,以切胶回收的方式纯化蛋白,获得约70 ku的重组融合蛋白,Western blotting检测纯化后的重组蛋白具有较好的抗原性。将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备了五邻体蛋白单因子血清,间接ELISA检测结果显示所制备的抗血清效价大于1:40000。本试验获得的高效单因子血清,为Ⅱ群禽腺病毒特异性检测方法的研究奠定了基础。     

猪磷酸酪氨酸互作结构域1基因的融合表达及其多克隆抗体的制备和鉴定

本文旨在通过原核表达获得猪磷酸酪氨酸互作结构域1(p PID1)重组蛋白,并制备p PID1多克隆抗体。将p PID1基因插入p ET28a(+),构建重组p ET28a(+)-p PID1大肠杆菌表达质粒,然后将重组质粒p ET28a(+)-p PID1转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,获得的重组子以不同异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)浓度、温度和时间诱导,确定p PID1融合蛋白表达的最适条件。将表达产物经镍离子-亚氨基二乙酸(Ni2+-IDA)亲和层析纯化后进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MSMS)鉴定。同时,将纯化获得的p PID1融合蛋白免疫SD大鼠,制备p PID1多克隆抗体,并检测抗体效价。结果表明:p PID1融合蛋白表达的最佳条件为30℃以0.1 mmol/L IPTG诱导4 h;纯化的融合蛋白经MALDI-TOF-MSMS鉴定为p PID1;特异性的p PID1多克隆抗体成功制备,抗体效价为1∶20 480。本试验成功制备了高纯度的重组p PID1及其多克隆抗体。     

伪狂犬病毒截短VP5蛋白原核表达与鉴定

以全长PRV基因组DNA为模板,PCR法扩增截短的伪狂犬病毒VP5基因,将其克隆至p ET-28a载体中,构建重组原核表达质粒p ET-28a-VP5,转化至大肠杆菌BL21中,并诱导表达;表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果表明,重组表达蛋白可以与PRV阳性血清及标签HIS单克隆抗体发生特异性反应。通过成功构建了PRV截短VP5基因重组原核表达质粒p ET-28a-VP5,原核表达并纯化了重组蛋白,为伪狂犬病毒特异性诊断抗原的开发、疫苗的研制及细胞生物学研究奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒中和表位区S1D的原核表达及免疫原性分析

为了研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1蛋白中和表位区S1D的免疫原性,根据PEDV河南株(Gen Bank:YK649107)S1基因序列,设计1对特异性引物,PCR扩增S1D片段,克隆到p ET-28a(+)中,构建原核表达载体,经优化的IPTG浓度诱导后进行SDS-PAGE分析,利用His标签的特性重组蛋白进行纯化及Western blot分析。结果显示:中和表位S1D片段在p ET-28a(+)中高效表达;Western blot证明重组蛋白可以与PEDV阳性血清产生特异性反应;用纯化的蛋白免疫新西兰白兔,抗体水平升高,表明重组蛋白具有良好的免疫原性。     

犬瘟热病毒N基因原核表达及多克隆抗体的制备

采用PCR方法扩增犬瘟热病毒N基因,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建犬瘟热N基因原核表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组N蛋白。从包涵体中纯化重组蛋白,制备多克隆抗体,采用Western blot检测其特异性。结果显示PCR扩增得到犬瘟热N基因,重组N蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达,制备的多克隆抗体能与N蛋白特异性反应。     

猪肺炎支原体168弱毒株P65基因的原核表达及鉴定

研究猪肺炎支原体168(Mycoplasma hyopneumoniae 168,Mhp168)弱毒株重组蛋白p65的免疫原性。根据GenBank中Mhp168弱毒株P65基因的开放阅读框设计特异性引物,进行PCR扩增,构建原核表达载体pET-28a-P65,经原核表达并纯化获得的重组蛋白与佐剂以体积比1∶1乳化后免疫注射小鼠,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定小鼠血清的抗体效价;选取抗体效价较高的小鼠进行攻毒试验。经间接ELISA证明,重组蛋白p65具有良好的免疫原性,血清效价为1∶12 800。攻毒试验证明,p65重组蛋白疫苗的保护率可达80%,证明重组蛋白p65具有良好的免疫原性。     

鸡传染性贫血病毒VP2基因的原核表达及兔抗血清的制备

为了用大肠杆菌原核表达系统表达鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP2基因片段,并制备其兔抗血清,试验以CIAV M9905株基因组DNA为模板,通过PCR扩增VP2基因,与p ET28a(+)载体连接后转化DH5α获得阳性重组子,将其转化E.coli BL21(DE3)菌,IPTG诱导表达出His-VP2重组蛋白,经Ni-NTA树脂纯化后免疫新西兰白兔制备兔抗血清,采用IFA和Western-blot检测该血清的特异性,ELISA测定其效价。结果表明:重组His-VP2融合蛋白的分子质量约为36 ku,以包涵体形式存在。制备的兔抗VP2血清效价在1∶6 400以上,可特异性结合真核表达的VP2蛋白,表明其反应原性较好。说明试验成功表达VP2蛋白,并制备出兔抗血清,可用于该蛋白与病毒其他蛋白之间的相互作用的进一步研究。     

H3N2亚型犬流感病毒NP蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

将分离的H3N2亚型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2)株的核蛋白(NP)基因克隆至原核表达载体p ET28a(+)中,构建重组表达质粒p ET-NP,然后转化大肠杆菌E.coli Rosetta(DE)感受态细胞,经IPTG诱导后,采用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果显示,大肠杆菌表达的重组NP蛋白的分子量约为61 k Da,与预期相符,并能与犬CIV阳性血清发生特异性反应。将表达的重组NP蛋白进行纯化后,免疫大白兔制备抗NP蛋白多克隆抗体血清,Western blot检测该血清可与CIV的NP蛋白发生特异性反应,间接ELISA检测该多克隆抗体血清的效价达1:30 000,显示了较高的抗体效价。本研究为CIV快速检测方法的建立和流行病学调查奠定了科学依据。