篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗

目的建立篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的工艺。方法利用7.5L篮式生物反应器和片状载体培养Vero细胞,接种乙型脑炎病毒P3V2株毒种,根据葡萄糖的消耗量,分析细胞的生长情况及调节病毒培养时的灌流速度,每24h取样,检测病毒滴度。收获的病毒液经纯化后,制备乙脑灭活疫苗,检测各项指标。结果Vero细胞培养至96h,葡萄糖消耗量达高峰,细胞密度达峰值;接种病毒后72h,葡萄糖消耗量达高峰,灌流量为7L/d,连续收获7～9d,共可收获(40±5)L病毒液;96h病毒滴度达高峰,为10.0LgLD50/ml;制备的乙型脑炎灭活疫苗各项指标均达到《中国药典》三部(2005版)要求。结论已建立了篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的工艺。     

应用篮式生物反应器制备森林脑炎灭活疫苗(Vero细胞)

目的探讨篮式生物反应器制备森林脑炎灭活疫苗(Vero细胞)。方法应用14 L篮式生物反应器,以Vero细胞作为森林脑炎病毒增殖的细胞基质,采用片状载体对Vero细胞进行高密度培养,探讨不同细胞接种浓度对生物反应器内细胞密度及病毒产量的影响。连续收获的森林脑炎病毒液经超滤浓缩、1∶4 000(v/v)β-丙内酯灭活、柱层析纯化后,获得疫苗原液,按照《中国药典》三部(2010版)进行相关检测。结果用(5~7.5)×105个/ml细胞浓度接种Vero细胞培养森林脑炎病毒可连续收获30 d以上,平均病毒滴度为8.4 lg LD50/ml;1∶4 000(v/v)β-丙内酯灭活24 h可完全灭活病毒,3批病毒浓缩液灭活验证试验均未检出残余活病毒;柱层析纯化后杂蛋白去除率可达89.56%;疫苗原液经无菌检查合格,其他各项质量指标均符合《中国药典》三部(2010版)规定。结论应用篮式生物反应器培养Vero细胞制备了合格的森林脑炎灭活疫苗,该工艺适用于森林脑炎灭活疫苗的规模化生产。     

乙型脑炎病毒的生物反应器培养及其灭活和纯化

目的利用NBS 14 L篮式生物反应器大规模培养乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),并对病毒收获液进行灭活和纯化,为乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)的大批量生产提供参考。方法用NBS 14 L篮式生物反应器,以片状载体FibralCel DISKⅠ为载体,进行Vero细胞高密度培养,分别按0.01、0.1和0.3 MOI接种JEV(P3V2)毒种,灌流培养,收获3批病毒液,检测病毒滴度;分别使用不同浓度的甲醛(100、200、400 ng/ml)于4、25℃和不同浓度的β-丙内酯(β-丙内酯︰病毒液分别为1︰2 000、1︰4 000、1︰8 000)于4℃对病毒收获液进行灭活,取灭活后的病毒液,接种昆明小鼠,验证病毒灭活效果;用截留相对分子质量为10万的超滤器对病毒收获液进行超滤浓缩,用Sepharose 4FF层析柱对病毒浓缩液进行层析纯化。结果共培养3批Vero细胞,平台期密度约为1.6×107个/ml。3批病毒收获液的滴度分别为8.4、8.1和7.9 lgLD50/ml。以甲醛为灭活剂,作用浓度为200 ng/ml,温度为4℃时,作用7 d可完全灭活病毒,且免疫原性合格;以β-丙内酯为灭活剂,作用浓度为1︰4 000,温度为4℃时,作用12 h可完全灭活病毒,且免疫原性合格。3批病毒浓缩液病毒液经Sepharose 4FF层析柱层析纯化后,蛋白去除率达99%以上,抗原回收率在95%以上,Vero细胞蛋白质残留量和DNA残留量均符合《中国药典》三部(2010版)的相关规定。结论成功实现了JEV的大规模生物反应器培养,层析纯化后病毒的抗原回收率较高,为乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)的大批量生产提供了参考。     

生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗

目的建立利用生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗的新工艺。方法以Vero细胞作为乙型脑炎病毒增殖的细胞基质,使用微载体Cytodex-Ⅰ在15L生物反应器中进行高密度培养,采用2.5～4.5g/L的载体浓度培养乙型脑炎病毒,制备3批纯化乙型脑炎疫苗并进行检定。结果随着微载体浓度的增加,细胞密度升高。采用2.5～4.5g/L微载体培养的病毒收获液的平均滴度为7.38～7.56lgPFU/ml,收获量最高可达到12～15个有效罐体积。制备的3批疫苗各项质量指标均符合《中国药典》三部(2005版)相关要求。结论已建立了15L生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗的新工艺,为进一步放大生产规模奠定了基础。     

不同病毒培养方式制备森林脑炎灭活疫苗的比较

目的比较3 L转瓶及14 L篮式生物反应器培养病毒制备的森林脑炎灭活疫苗的产量及质量。方法分别采用3 L转瓶及14 L篮式生物反应器培养Vero细胞,3 L转瓶培养细胞96 h后感染SZV株森林脑炎病毒(MOI=0.01、0.04、0.1及0.4),培养至80~96 h收获第1次,每隔48 h收获1次(500 m L/次);14 L生物反应器培养Vero细胞7 d后感染SZV株森林脑炎病毒(MOI=0.01、0.04、0.1及0.4),感染后96 h开始流加病毒维持液,并收获病毒液,每24 h收获10~15 L。两种培养方式收获的森林脑炎病毒液经超滤浓缩、β-丙内酯灭活、柱层析纯化后获得疫苗原液,并进行相关检定。结果 4种MOI感染Vero细胞,采用3 L转瓶方式培养可连续收获6~7次,病毒液产量为3~3.5 L,收获液平均滴度为7.4 lgLD_(50)/m L;采用14 L篮式生物反应器培养可连续收获14 d,病毒产量140~160 L,收获液平均滴度高达8.4 lgLD_(50)/m L。两种方法制备森林脑炎灭活疫苗原液各项质量指标均合格,且14 L篮式生物反应器制备原液的效力及蛋白含量优于3 L转瓶。结论应用生物反应器培养工艺制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的产量及质量高于转瓶培养工艺,本实验为生物反应器制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的大规模生产及工艺改进奠定了基础。     

生物反应器培养Vero细胞制备Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗

目的在生物反应器中用微载体连续灌流培养Vero细胞,制备Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗。方法在50 L体积的生物反应器中,加入含10 g/L微载体的DMEM培养基,接种Vero细胞,当细胞密度约达5×10~6个/ml时,感染肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)毒种,接毒后72 h开始收获,连续收获17 d,收获的病毒原液经浓缩、灭活、Sepharose 4FF凝胶层析纯化后制备疫苗,检测病毒滴度、抗原含量及残余牛血清白蛋白、DNA、宿主蛋白含量,并接种新西兰家兔,检测疫苗效力。结果确定最佳Vero细胞接种浓度为1×10~5个/ml,病毒最佳MOI为0.015。利用优化后的培养条件收获的病毒滴度在6.5~8.0 log CCID_(50)/ml,且各项检测指标均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定。结论用生物反应器微载体灌流培养制备Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗的小试工艺可行。     

生物反应器细胞培养制备人用狂犬病疫苗

目的应用生物反应器培养细胞和病毒,大规模生产人用狂犬病疫苗。方法以巴斯德PV2061为毒种,以143代以内Vero细胞为培养基质,应用生物反应器,每升投放25g微载体,灌流式细胞培养,连续收获病毒液,经浓缩、灭活、纯化,制成Vero细胞狂犬病疫苗。结果细胞培养密度达1.2×107～1.5×107个/ml,病毒感染后可连续收获18～22d,病毒最高滴度8.5LogLD50/ml,平均滴度7.6LogLD50/ml。经柱层析纯化,杂蛋白去除率达99.95%以上,总蛋白含量≤80μg/g,DNA含量≤10pg/0.5ml,GP含量3.5～4.5IU/0.5ml,效力≥4.5IU/0.5ml。结论应用生物反应器细胞培养,可以大规模生产优质Vero细胞人用狂犬病疫苗。     

微载体系统Vero细胞及乙型脑炎病毒培养的研究

采用国产20L反应器(Cellcul-20A)及国产微载体(GT-2)进行Vero细胞及乙型脑炎病毒培养,细胞浓度可达到1.0×10~7cells/ml,形态良好;病毒滴度LogLD_(50)/0.04ml在4.67～7.5之间,并确立了细胞及乙型脑炎病毒培养工艺。     

应用40L生物反应器制备人用狂犬病疫苗

目的应用40 L生物反应器大规模生产人用狂犬病疫苗。方法以PV2061株狂犬病病毒为毒种,Vero细胞为基质,应用CelliGen 510生物反应器(40 L),灌流式细胞培养,连续收获病毒液,经浓缩、灭活、纯化,制备人用狂犬病疫苗,并对生产过程中各步骤工艺进行取样检测。结果细胞培养密度达1. 2×10~7个/m L,病毒感染后可连续收获约16 d,病毒收获液最高滴度为7. 4 LgLD50/m L。经纯化,杂蛋白去除率达98%以上,成品宿主细胞DNA含量≤50 pg/剂,效价≥4. 5 IU/剂,每罐产量可达13万剂疫苗。结论 CelliGen 510生物反应器可应用于大规模生产人用狂犬病疫苗,疫苗成品检定符合《中国药典》三部(2015版)相关标准。     

兽用灭活纯化狂犬病疫苗生产工艺的优化

目的优化兽用灭活纯化狂犬病疫苗的生产工艺。方法建立BHK21C13细胞主细胞库、工作细胞库,狂犬病病毒疫苗株LEP-Flury主种子批、工作种子批,并进行鉴定。优化悬浮培养工艺参数,并分析病毒原液浓缩、纯化和灭活过程中抗原及成品的稳定性。结果主细胞库、工作细胞库无外源因子污染,细胞形态、生长良好;狂犬病病毒主种子批和工作种子批无外源因子污染,病毒滴度最高可达107.8logLD50/ml。采用15L生物反应器,在优化的培养工艺条件下,细胞密度可达4.5×106个/ml,病毒按0.3MOI接种,灌流培养5次,病毒滴度平均可达106.8logLD50/ml。病毒原液合并后,经750KD中空纤维柱30倍浓缩,Sepharose Fast Flow6层析柱纯化,1/4000β-丙内酯灭活,期间加入稳定剂,纯化疫苗效价平均达(5.03±1.84)IU/头份,纯化的抗原量达(11.75±0.70)μg/头份,在4℃可保存24个月,在37℃可保存30d,在45℃可保存12h。结论优化的兽用灭活狂犬病疫苗的生产工艺可提高疫苗的安全性、有效性及稳定性。     

生物反应器培养Vero细胞生产肠道病毒71型

目的研究利用微载体技术规模化制备肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的方法。方法利用NBSCelliGen 310 5 L生物反应器进行Vero细胞微载体培养,考察了不同微载体Cytodex-1浓度(3、10、15、20 g/L)对Vero细胞生长代谢及细胞密度的影响,并且与细胞工厂(Cell factory,CF)中Vero细胞染毒后的病毒繁殖进行比较。分别采用上清液、洗涤液、洗脱液模式收毒,比较不同收毒方式中EV71的抗原含量及病毒滴度(CCID50)。结果采用10 g/L微载体浓度,批次培养方式培养Vero细胞120 h后,细胞密度可达5.47×106个/ml;当微载体浓度大于15 g/L时,由于葡萄糖消耗速度快,需采用灌注模式培养。按MOI 0.2染毒后,微载体培养的收毒时间比CF慢48 h,但其病毒滴度可达8.8 Log10CCID50/ml,约为CF的5倍。EV71与微载体存在离子交换吸附作用,按上清液加洗脱液方式收毒,抗原总量可达12 61 U/ml,约为CF的3倍。结论已成功建立了生物反应器微载体5 L发酵培养Vero细胞生产EV71的方法,为进一步EV71大规模培养以及疫苗研发奠定了基础。     

蔗糖垫超速离心法提纯乙型脑炎疫苗

经Vero细胞培养的P3株乙脑灭活病毒，以超滤浓缩和硫酸色精蛋白处理后，40％蔗糖垫层在27500r／min离心6小时，收集沉淀制成提纯乙脑疫苗。其蛋白含量在0．012～0.035mg／ml，稀释8倍后其疫苗效价仍能超过日本提纯鼠脑乙脑疫苗参考标准和我国乙脑疫苗参考标准。Vero细胞残余DNA＜100pg／0．5ml，残余牛血清＜1μg／ml。     

用微载体系统培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液

目的　采用生物反应器微载体培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液。方法　用 5L生物反应器培养Vero细胞 ,培养至 4d时接种CTN株狂犬病毒 ,在培养全程对细胞生长所消耗的营养物质及代谢产物进行监测及分析。结果　培养 4d后细胞浓度可达 1 2× 10 7cells ml,培养 3周后的病毒液经ELISA检测A值可达 0 2 1～1 0 6。病毒滴度达 10 - 6 0 ～ 10 - 8 0 LogLD50 ml。病毒液可连续收获 5次。结论　用微载体系统培养Vero细胞可生产高滴度的狂犬病毒液。     

SARS病毒NS-1株三级毒种库的建立

目的建立SARS病毒NS1株三级毒种库。方法SARS病毒NS1株在Vero细胞上传代扩增,并经各项检定合格后,建立SARS病毒NS1株三级毒种库。结果工作种子批病毒滴度均在8.2LgCCID50ml以上;无菌试验、支原体检查均合格;鉴别试验中,经与SARS病人恢复期高效价血清中和,中和指数均在955以上;外源因子检查中,小鼠和乳鼠存活率均在86%以上;血吸附和非血吸附检查均为阴性;免疫原性检查中,病毒原液和1∶5倍稀释病毒液免疫小鼠,其血清中和效价分别达1∶54和1∶15。结论SARS病毒NS1株各项指标均符合《SARS病毒灭活疫苗临床前研究技术要点》和《中国生物制品规程》2000年版要求,可作为SARS灭活疫苗生产用毒种。     

生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒

目的应用生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒。方法用7L、75L和550L生物反应器逐级放大培养Vero细胞,每天取样进行细胞计数。在550L生物反应器中培养脊髓灰质炎病毒,观察细胞病变,并检测病毒感染性滴度。结果一级细胞培养(灌流培养法)、二级细胞培养(循环培养法)和三级细胞培养(批培养法)的平均细胞密度分别为2.79×106、2.38×106和1.04×106个/ml,一级培养的细胞倍增数最高;病毒培养体积达350L,病毒收获液滴度大于7.625lgCCID50∕ml。结论通过三级放大工艺,可大规模培养脊髓灰质炎病毒。     

无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒条件的优化

目的优化无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒的条件,为Vero细胞流感疫苗的开发奠定基础。方法在搅拌瓶中采用不同的细胞接种量和不同的微载体浓度培养Vero细胞,制备流感病毒,并检测不同的pH值、TPCK-胰酶含量、病毒接种量及病毒收获时间对流感病毒血凝滴度的影响。结果以(1.0～5.0)×105个/ml的Vero细胞接种至浓度为3mg/ml的无血清微载体中,病毒培养液pH值为7.2～7.4,TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml,病毒接种量为1.0MOI,并在感染48h后补加TPCK-胰酶,培养72h后收获上清与细胞内病毒,血凝滴度可达1:512。结论已获得了无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒的适宜条件,为应用生物反应器大规模制备流感病毒奠定了基础。