汉坦病毒核衣壳蛋白T细胞表位研究进展

汉坦病毒核衣壳蛋白是主要结构蛋白,具有很强的抗原性和免疫原性,可诱导细胞免疫,尤其是特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应,在抗病毒免疫中起着关键作用。本文就近年来汉坦病毒核衣壳蛋白T细胞表位方面的研究作一简要综述。     

汉坦病毒核衣壳蛋白抗原表位的研究进展

汉坦病毒核衣壳蛋白具有很强的抗原性和免疫原性，其氨基端约１００个氨基酸大多具有亲水性，且能被患者和免疫动物的血清及许多抗汉坦病毒的单克隆抗体所识别，是汉坦病毒核衣壳蛋白的主要抗原表位区。本文就近年来 一方面的研究作一简要综述。     

汉坦病毒核衣壳蛋白抗原表位的研究进展

汉坦病毒核衣壳蛋白具有很强的抗原性和免疫原性,其氨基端约100个氨基酸大多具有亲水性,且能被患者和免疫动物的血清及许多抗汉坦病毒的单克隆抗体所识别,是汉坦病毒核衣壳蛋白的主要抗原表位区。本文就近年来这一方面的研究作一简要综述。     

汉坦病毒核蛋白核心区域高效表达及产物鉴定

汉坦病毒是引起肾综合征出血热（HFRS）的主要病毒，汉坦病毒的基因由L、M、S三个片段构成，分别编码病毒RNA聚合酶，囊膜核蛋白G1和G2及核衣壳蛋白（简称核蛋白，Nucleocapsid Protein，NP）。血清学研究表明，汉坦病毒核蛋白具有很强的抗原性和免疫原性，同时NP抗原可以与汉坦病毒内的多种血清型病毒的免疫血清产生交叉反应，表明汉坦病毒的NP具有共同的抗原决定族。有鉴于此，我们对核蛋白的核心区域进行表达和纯化，并用SDS-PAGE和Western-Blotting对重组核蛋白进行鉴定，为其应用于诊断抗原提供技术依据。[第一段]     

汉坦病毒的进化及与宿主动物的关系

汉坦病毒（Hantavirus）是布尼亚病毒科的一个属，是有包膜、单股、负链、分节段的RNA病毒。病毒基因包括3个独立的片段：L、M、S，分别编码病毒的多聚酶L蛋白，囊膜糖蛋白（G1、G2），核衣壳N蛋白。与该科的其它属病毒不同，汉坦病毒不经节肢动物传播。宿主动物以啮齿类为主，可使其终生携带病毒，呈无症状的持续性感染。感染主要包括吸入排泄物（如粪、尿、唾液等）形成的气溶胶、食入被污染的食物和伤口接触感染等方式，同时也是人类被感染的主要途径。多年研究认为汉坦病毒不存在人与人之间的传播，但有报道发现南美洲的AND病毒的sout分支能存在人-人之间的感染。     

汉坦病毒感染的血清学分型研究进展

汉坦病毒(HV)属布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属(Hantavirus),为分节段的单股负链RNA病毒,病毒基因组有3个片段组成,大(L)片段(6.5kb)编码病毒RNA依赖的RNA多聚酶,中(M)片段(3.6kb)编码病毒糖蛋白G1和G2的前体糖蛋白,小(S)(1.7～2.0kb)编码病毒的核衣壳蛋白(NP)[1].     

汉坦病毒的分子生物学,抗原和毒力研究进展

汉坦病毒属的基因组为负极性单链ＲＮＡ，含Ｌ，Ｍ和Ｓ三段，其ｍＲＮＡ分别编码Ｌ蛋白，包膜糖蛋白（Ｇ１和Ｇ２）和核壳蛋白。病毒的毒力主要与Ｇ１的抗原表位有关，而交叉反应主要发生在核壳蛋白。汉坦病毒属可能从一个共同的祖先，在适应宿主的过程中，进化为两支四个血清型：一支是引起较重病情的野鼠型和家鼠型病毒，另一支是引起轻症的Ｐｉｎｇ型病毒和不致病的田鼠型病毒。     

汉坦病毒S基因在原核细胞中高效表达的研究

目的通过基因工程的方法从鼠肺中扩增出汉坦病毒的S基因，并实现其蛋白的体外表达。方法应用RT—PCR方法扩增汉坦病毒汉城型（SEO）的YZG-Changchun株S基因，然后克隆到pMD18-T载体中，经序列分析后，定向克隆入原核表达载体pET-28a中，转化大肠埃希菌Rosetta用IPTG诱导表达后，将全菌裂解，用SDS-PAGE和Westem—blot检测重组菌中外源蛋白的表达情况和免疫反应性的分析。结果S基因在原核细胞中得到了高效表达，表达的蛋白占菌体蛋白总量的37％，且具有良好的免疫反应性。结论汉坦病毒S基因蛋白可通过基因工程手段获得体外高效表达，这将对其功能的研究及为汉坦病毒疫苗的研究提供基础。     

汉坦病毒S片段标准品构建及在荧光定量PCR检测中的应用

[目的]构建汉坦病毒S片段标准品,并建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量PCR方法检测汉坦病毒核酸.[方法]对76-118株的S片段基因进行序列分析,利用引物设计软件设计出一对引物和一条荧光探针,逆转录为cDNA,经PCR扩增,产物纯化后与PMD 18-TVector连接,转化到大肠杆菌DH5α,筛选得到标准品的质粒,提取质粒并进行定量.在S片段的保守区设计引物和TaqMan探针,对real-time PCR条件进行优化,并提取急性期发病病人总RNA,逆转录为cDNA,与标准品同时检测.[结果]该方法制备的质粒标准品应用于汉坦病毒早期检测,能对检测样品进行质量控制;应用荧光定量PCR检测急性期病人病毒含量,具有高特异性和灵敏度,从病毒核酸提取至检测完成仅需3 h左右,重复性好,并能对病毒准确定量.[结论]汉坦病毒荧光定量标准品和TaqMan荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,适用于汉坦病毒的早期检测;汉坦病毒S片段编码的核衣壳蛋白(NP)是流行性出血热早期诊断的理想抗原.     

乙型肝炎病毒核衣壳组装调节剂最新进展

核衣壳组装调节剂作为新型抗HBV药物,能影响HBV复制,使共价闭合环状DNA（cccDNA）暴露而便于其被降解酶降解,从而同时减少cccDNA库。本文对主要的核衣壳组装调节剂及其与HBV核心蛋白之间相互作用方面的研究进展作一综述。     

汉坦病毒的分子生物学、抗原和毒力研究进展

汉坦病毒属的基因组为负极性单链RNA,含L、M和S三段,其mRNA分别编码L蛋白、包膜糖蛋白(G1和G2)和核壳蛋白。病毒的毒力主要与G1的抗原表位有关,而交叉反应主要发生在核壳蛋白。汉坦病毒属可能从一个共同的祖先,在适应宿主的过程中,进化为两支四个血清型:一支是引起较重病情的野鼠型和家鼠型病毒,另一支是引起轻症的(鼠平)型病毒和不致病的田鼠型病毒。     

基于单表达质粒的T7噬菌体病毒样颗粒制备、纯化及形态鉴定

目的 提供一种基于单表达质粒制备T7噬菌体病毒样颗粒（Virus-like particles, VLPs）的新策略,为后续构建基于T7噬菌体病毒样颗粒的载体疫苗或靶向药物奠定基础。方法 将T7噬菌体衣壳蛋白基因gp10A及支架蛋白基因gp9分别克隆至质粒pRSFDuet-1的MCS1及MCS2位点,转入大肠杆菌BL21(DE3)后进行诱导、表达及自主装,采用超高速离心及尺寸排除色谱对T7 VLPs进行纯化,利用 SDS-PAGE、透射电镜和动态光散射技术,对纯化后的T7 VLPs进行形态、结构、表型及粒径分析。结果 琼脂糖凝胶电泳和测序结果表明成功构建pRSFDuet-1-gp9-gp10A质粒,SDS-PAGE电泳表明该质粒能在大肠杆菌BL21(DE3)中大量表达T7噬菌体衣壳蛋白Gp10A及支架蛋白Gp9,经尺寸排除色谱纯化后的纯度较高;通过透射电镜观察其自主装形成大小均一的VLPs结构,该VLPs平均粒径为70 nm,形态似T7噬菌体原衣壳结构。结论 利用pRSFDuet-1质粒同时表达T7噬菌体衣壳蛋白Gp10A和支架蛋白Gp9,能在大肠杆菌BL21(DE3)中自主装形成VLPs。     

T7噬菌体衣壳蛋白IOA的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的表达纯化T7噬菌体衣壳蛋白10A,并免疫家兔得到抗10．4多克隆抗体．为研究噬菌体展示抗体技术,进而筛选致病微生物蛋白抗体奠定基础。方法37℃培养含有17噬菌体10A蛋白质粒的大肠杆菌BLT5615,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷直接诱导表达该蛋白;SDS．PAGE鉴定表达状态,盐酸胍变性一尿素复性纯化以包涵体形式存在的蛋白并免疫家兔：辛酸一硫酸铵沉淀法纯化多克隆抗体,间接ELISA测定效价,WesternBlot鉴定特异性。结果成功表达了T7噬菌体衣壳蛋白10A。SDS—PAGE显示所表达的蛋白相对分子质量约为37kDa。主要以包涵体形式存在：复性后SDS—PAGE分析获得单一条带蛋白。利用该蛋白免疫家兔,6次免疫后抗血清的效价均达到1：160003。纯化后的多克隆抗体可以和17噬菌体衣壳蛋白10A特异结合。结论成功表达、纯化了17噬菌体衣壳蛋白10A,并制备了其多克隆抗体。     

深圳市啮齿动物感染汉坦病毒的基因特征研究

目的 研究深圳市啮齿动物所携带的汉坦病毒分子流行病学特征,分析汉坦病毒基因型别。方法 采用笼日法布点捕鼠,收集鼠肺标本后研磨提取RNA。运用实时荧光PCR方法进行分型检测,进一步采用反转录-巢式PCR扩增部分M片段G2区和S片段核苷酸序列,并进行同源性和系统进化树分析。结果 共捕获200只鼠类动物,包含褐家鼠189只、黄胸鼠9只和小家鼠2只。汉坦病毒检出率为21.0%（42/200）,均为汉城病毒,其中宝安区鼠肺检出率最高,达45.7%（χ²=25.60,P<0.05）。从阳性鼠肺标本中分别扩增出25条汉坦病毒M片段G2区和S片段序列,核苷酸同源性分别为95.3%~100.0%和97.6%~100.0%,与来自广州市的参考序列核苷酸相似性较高。系统进化树显示此次研究深圳市鼠类动物所携带的汉坦病毒均为汉城病毒的S2亚型。氨基酸突变位点分析发现,在S基因编码的核衣壳蛋白中存在1个位点突变,为BA-111第973位由丙氨酸（Ala）变为苏氨酸（Thr）。结论 深圳市鼠类动物所携带的汉坦病毒为汉城病毒的S2亚型,与深圳市历年以及周边省市汉坦病毒代表病毒毒株相比变异不大。     

应用逆转录聚合酶链反应和序列分析对褐家鼠肺汉坦病毒进行分型研究

对来自北京西客站附近一集装箱仓库的2份汉坦病毒免疫荧光抗原阳性褐家鼠肺组织进行分型研究。方法；采用逆转录聚合酶链反应（RT．PCR）和序列分析。结果：这两份褐家鼠肺标本均携带汉城型（SEO）汉坦病毒（HV）。RT－PCR扩增其中1份标本所携带病毒的M基因330bp片段，通过pGEM－T载体克隆进入大肠杆菌JM109，并进行核着酸序列测定，经与其它HV核着酸序列的同源性比较，其与SEO型毒株相应片段核着酸序列的同源性在93.9％～96.4％之间，而与其它血清型毒株的同源性在61.5％～75.8％之间。结论：首次证实北京地区宿主动物携带SEO型HV.     

广州市新发4例SARS患者SARS-CoV核衣壳蛋白和抗体变化规律

研究证明严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(CoV)的核衣壳蛋白(N)比较保守，具较强的免疫原性，在感染细胞中可大量的表达。作为病毒感染的靶标志物，检测N蛋白可能成为早期诊断的一种有用的方法。我们通过研究2003年12月至2004年1月在广州市新发4例SARS患者血液中的N蛋白和抗体的变化规律，探讨循环N蛋白在SARS早期诊断中的价值。     

中国狂犬病毒疫苗株（3aG株）N,NS,和M蛋白基因的核苷酸序列测定

本文报告了中国狂犬病毒疫苗株（３ａＧ株）核衣壳蛋白（Ｎ蛋白），核蛋白壳磷酸蛋白（ＮＳ蛋白，又称Ｍ＿１蛋白）和基质蛋白（Ｍ蛋白，又称Ｍ２蛋白）的蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸推导序列，各基因编码区的全长分别是Ｎ基因１３５２，ＮＳ基因８９４和Ｍ基因６０９个核苷酸，３ａＧ和ＣＶＳ株的Ｎ，ＮＳ和Ｍ基因的核苷酸序列都具有高的同源性，它们分别为９１．９５％，９０．２７和９０．８０％。     

汉坦病毒感染人胚肾细胞诱导凋亡的研究

目的探讨汉坦病毒在人胚肾细胞(HEK-293)内的增殖及诱导凋亡的机制。方法采用间接免疫荧光法检测HEK-293内汉坦病毒抗原,用westen blot方法测定汉坦病毒作用后bcl-2、bax、Cyt-c及caspase-3的表达。结果汉坦病毒感染细胞后用间接免疫荧光法可在感染的HEK-293胞浆内检测出汉坦病毒抗原;Western blot-ting结果显示,随着汉坦病毒浓度增加,Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达上调,Cyt-c蛋白及caspase-3酶原活化片段表达升高。结论汉坦病毒可感染HEK-293细胞并在其体内增殖,可能通过线粒体途径诱导HEK-293细胞发生凋亡。     

重组诺如病毒GII 4型衣壳蛋白的表达、纯化及鉴定

目的通过基因重组方式获取高浓度重组诺如病毒GⅡ4型衣壳蛋白。方法将诺如病毒GII 4型衣壳蛋白基因片段插入pHT A载体中,测序鉴定正确后,将重组质粒转化到MAX Efficiency~ DH10Bac~(TM)感受态细胞,表达目的蛋白。重组蛋白用Ni-NTA His蛋白亲和柱纯化,用诺如病毒检测试剂盒进行鉴定。结果 SDSPAGE结果表明成功表达了分子量约为60 kD的重组蛋白,经诺如病毒检测试剂盒鉴定,表达产物为重组诺如病毒衣壳蛋白,并且具有较好的免疫原性。结论构建了诺如病毒GII 4型衣壳蛋白表达载体,并获得重组诺如病毒GII 4型衣壳蛋白。     

诺如病毒衣壳蛋白在酵母细胞中的表达研究

目的研究诺如病毒衣壳蛋白在酵母细胞中的表达。方法 2013年3—11月收集病毒性腹泻患者粪便标本。将GII-4型诺如病毒的衣壳蛋白序列克隆到pPICZ A载体中。然后将重组的pPICZ A-NV4质粒转化到毕氏酵母中进行蛋白表达。并采用western blot和电镜方法鉴定表达产物。结果除未诱导(0 h)外,其他诱导的时间下均检测到预期的衣壳蛋白(58kDa),并且蛋白表达量随诱导时间有递增趋势,在72 h达到高峰,96 h表达量略有下降。空白对照(未含有衣壳蛋白序列的Pichia pastoris)的Pichia pastoris(诱导72 h)未检测到相应的杂交信号。在Pichia pastoris中表达出诺如病毒的衣壳蛋白,呈病毒颗粒状,直径为30 nm左右。结论成功表达出颗粒状的衣壳蛋白,为进一步开发诺如病毒的快速检测试剂盒和疫苗的研究奠定了基础。