HIV-1复合多表位基因的原核表达和多克隆抗体制备

为表达HIV-1复合多表位基因并制备其多克隆抗体.设计引物,以HIV-1标准株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得p24基因片段;合成改造后的多个表位基因MEG并且与p24片段相连接,克隆入大肠杆菌.将测序正确的p24MEG基因克隆入原核表达载体pET32a并诱导表达.采用Ni2 -NTA亲和柱纯化目的蛋白,以p24抗体对纯化蛋白进行Western-blot分析.将纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体.通过PCR成功获得长度为651 bp的HIV-1的p24片段,获得了与多表位基因连接后的p24MEG基因,通过诱导表达,显示在相对分子量约45 000处有预计大小的特异性条带,表明成功表达出融合蛋白.经此纯化的融合蛋白免疫的家兔能产生特异性抗体,其滴度达到1:3 200.纯化的融合蛋白和多克隆抗体为研究新型HIV疫苗奠定一定的理论和实践基础.     

GGPPS多克隆抗体的制备与鉴定

构建人香叶基香叶基二磷酸合成酶基因(GGPPS)原核表达载体,制备兔抗人GGPPS多克隆抗体.利用DNA重组技术构建原核表达载体pGEX-4T-GGPPS,诱导表达GGPPS融合蛋白,分离纯化该融合蛋白后,作为免疫原免疫家兔制备多克隆抗体.成功构建了pGEX-4T-1-GGPPS原核表达载体,转化Rosetta菌株后可高效表达GGPPS融合蛋白,成功制备GGPPS多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价为1∶32000,并且抗体具有良好特异性.成功克隆GGPPS基因并制备了特异性的兔抗人GGPPS多克隆抗体,为进一步研究GGPPS的功能奠定了基础.     

PbTIP多克隆抗体对恶性疟原虫生长抑制作用的初步研究

首先构建了伯氏疟原虫TIP样蛋白(以下简称PbTIP)的原核表达载体pET32a/PbTIP,在大肠杆菌中成功诱导表达了带His标签的PbTIP融合蛋白。SDS-PAGE分析显示该融合蛋白主要以包涵体形式表达。Western-Blot鉴定虽然证明该融合蛋白表达正确,但即便在变性条件下该蛋白的亲和层析纯化效果也不佳。以PbTIP融合蛋白经过初次和三次加强免疫获得的小鼠PbTIP多克隆抗体滴度达到1∶105以上。进一步的研究表明,小鼠PbTIP抗血清对体外培养恶性疟原虫的生长具有一定的抑制作用,这显示PbTIP多克隆抗体对恶性疟原虫感染具有一定的交叉保护作用。以上实验结果为后续PbTIP在疟原虫免疫抑制中的功能及其机制研究奠定了一定的基础。     

BIG-3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

原核表达、纯化骨形态发生蛋白诱导基因（BIG-3,BMP-2-induced gene 3kb）所编码的融合蛋白并制备其多克隆抗体。将BIG-3基因插入原核表达载体PGEX-4T-2的多克隆位点获得pGEX-4T-2-BIG-3重组表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达情况及Sepharose4B层析柱亲和层析法纯化的融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备其多克隆抗体,并以Western blot鉴定其特异性。结果在大肠杆菌中获得BIG-3-GST融合蛋白高水平的诱导表达,经Sepharose4B层析柱亲和层析,GST-BIG-3融合蛋白在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,所制备的多克隆抗体具有较高的特异性。说明在大肠杆菌中成功表达且以亲和层析法纯化得到了BIG-3-GST融合蛋白,并制备了特异性较高的多克隆抗体。     

小鼠肥大细胞蛋白酶4的原核表达和多克隆抗体制备

文章构建小鼠肥大细胞蛋白酶4（mMCP-4）原核表达体系,获得原核表达蛋白,并制备兔抗mMCP-4多克隆抗体,提取小鼠脾细胞总 RNA ,运用 RT-PCR技术获得目的基因 mMCP-4,构建重组原核表达载体pET28a-mMCP-4,将其转化到大肠杆菌BL21中诱导表达。mMCP-4融合蛋白经Ni亲和层析法纯化后,作为抗原免疫兔子获得mMCP-4多克隆抗体。采用ELISA法测抗体效价,western blot检测抗体特异性。结果表明,构建重组表达质粒pET28a-mMCP-4,经大规模原核表达获得大量mMCP-4融合蛋白,制备的兔抗血清效价达1∶128000,并表现出较好特异性。研究结果为进一步研究mMCP-4生物学功能奠定了基础。     

盘基网柄菌allC的克隆、表达和多克隆抗体的制备

运用RT-PCR技术从盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)总mRNA中克隆到了尿囊酸酶基因(allC),该基因编码区开放读框长1 100bp,编码的蛋白约42kD.由于是在野生型和突变型细胞中差异表达的片段,表明该基因在盘基网柄菌多细胞发育中起到重要作用,因此将allC克隆入融合表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达带有6个组氨酸标签的尿囊酸酶(ALC)融合蛋白,经镍柱亲和层析,获得了电泳纯蛋白.用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.ELISA测得制备的抗ALC蛋白的多克隆抗体的效价可达1∶64 000,Western Blotting检测证明该抗体有较强的针对ALC蛋白的专一性.这些数据表明重组质粒表达的ALC融合蛋白具有良好的抗原性,制备ALC的多克隆抗体有良好特异性和效价,能够满足针对ALC免疫印迹和细胞内定位检测等实验要求,为深入研究ALC蛋白在盘基网柄菌多细胞发育的功能作用提供了有力工具.     

哈维氏弧菌vgrG基因的原核表达及多克隆抗体的制备

VI型分泌系统(T6SS)是革兰氏阴性菌特有的一种多功能分泌系统,它与致病菌的致病性密切相关;而vgrG则是T6SS系统的结构蛋白之一,它与T6SS的功能直接相关.为了获得哈维氏弧菌vgrG基因的外源重组蛋白及制备其多克隆抗体,本研究以哈维氏弧菌QT520菌株的DNA为模板,在扩增获得vgrG基因后,构建了原核表达载体pET32a-vgrG并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达.结果显示,在16℃和1mmol·L^-1 IPTG诱导20 h的条件下,可诱导重组蛋白rvgrG大量表达,条带大小与预期的分子量(88 kDa)一致;通过Ni²⁺亲和层析柱对融合蛋白rvgrG进行纯化,获得了纯度较高的目的蛋白rvgrG;将rvgrG重组蛋白通过腹腔注入小鼠体内后观察其毒性,结果显示rvgrG对小鼠无毒害作用;进一步用纯化蛋白rvgrG制备多克隆抗体,经ELISA检测,vgrG多克隆抗体的效价高达1∶320 000;蛋白免疫印迹(Western blot)检测表明,本实验所制备的vgrG多克隆抗体特异性强,可为后续进行vgrG蛋白的致病性及致...     

截短型HCV NS5B RNA聚合酶在大肠杆菌中表达纯化及鉴定

为构建HCV截短型ns5bΔ21基因的原核表达质粒;在大肠杆菌中表达NS5B蛋白并纯化,制备其抗体。运用软件设计引物,以BB7复制子为模板PCR扩增ns5bΔ21基因;克隆入原核表达载体pRSETA。将重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21转化BL21大肠杆菌,并诱导表达、可溶性分析及纯化;用纯化的NS5B蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果酶切鉴定和序列测定表明成功的构建了重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21;其经IPTG诱导后行SDS-PAGE可见新生表达条带,Western-blot证实了其特异性和抗原性良好;利用镍离子亲和层析和电洗脱方法获得了纯化NS5B蛋白;用纯化蛋白免疫小鼠制备出了多价抗血清。说明表达和纯化的截短型HCV NS5B RNA聚合酶可用于下一步筛选单链抗体。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的克隆、 表达及多克隆抗体制备

利用原核系统表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白, 制备鼠源多克隆抗体. 通过MDBK细胞增殖病毒, 提取RNA, RT-PCR扩增E2全长基因, 进行生物信息学分析后设计截短引物, 构建优化表达载体pET-30-E2, 转化BL21, 用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达; 用SDS-PAGE电泳分析蛋白表达, 纯化蛋白联合弗氏佐剂免疫小鼠; 用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价水平, 用免疫印迹(WB)和免疫荧光(IFA)法验证抗体特异性. 结果表明: E2基因在大肠杆菌中成功表达, 蛋白大小为32 000, 不可溶形式表达, 表达量为0.4 mg/mL; 多克隆抗体效价为1∶256 000, 可特异性结合重组蛋白及细胞中的病毒.     

Rab39A多克隆抗体的制备与鉴定

制备抗人Rab39A多克隆抗体并进行纯化检测,以用于Rab39A功能的研究.选取免疫原性强且特异性高的羧基端42个氨基酸(176～217aa)作为目的片段.PCR法扩增并构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rab39C42.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化GST-Rab39C42融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体.然后以亲和层析法纯化抗体,利用Western blot和免疫荧光检测抗体的特异性.结果表明,构建的原核表达载体经IPTG诱导后高效表达GST-Rab39C42蛋白,纯化后抗体质量浓度为1μg/μL;Western blot实验显示,抗体可以识别外源Rab39A蛋白和多个细胞系的内源Rab39A蛋白;抗体中和实验和RNA干扰实验证明了该抗体具有特异性.本研究成功构建了pGEX-4T-1-Rab39C42原核表达载体,并制备了特异性的抗人Rab39A兔多克隆抗体,为进一步研究Rab39A的功能提供了有力的支持.     

水稻小GTP蛋白OsRab5A的表达、纯化和GTP结合分析

小GTP结合蛋白是一类在细胞内的运输过程中重要作用的蛋白。它们通过结合子GTP而激活 ,当GTP被水解为GDP后处于非活性状态。哺乳动物中的研究表明 ,Rab5A蛋白是细胞内的形成早期内吞体 (earlyendosome)的限速因子。证实了所克隆的水稻rab5A基因编码的蛋白具有GTP结合功能。将Osrab5A基因的编码序列按正确读码框重组到pGEX4T1载体中 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,电泳判定插入片段大小无误后 ,进一步测序鉴定其读码也无误。将该克隆命名为pG_5AE。以IPTG诱导 pG_5AE所编码的融合蛋白GST_OsRab5A的表达。SDS_PAGE电泳与无外源质粒和表达谷胱甘肽硫转移酶 (GST)的对照相比 ,得到了预计大小的融合蛋白。以GSTrapTM亲和柱纯化融合蛋白。在不同的泳道分离纯化的融合蛋白和作为对照的含GST以及无外源蛋白的细菌总蛋白 ,电转移到硝酸纤维膜上。将该膜与α_3 2 PGTP温育 ,洗膜 ,放射自显影后 ,获得了融合蛋白结合GTP的结果 ,这表明在原核中表达出的水稻Rab5A蛋白能在体外结合GTP。     

人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)穿膜蛋白基因片段克隆表达

以人免疫缺陷病毒２（ Ｈ Ｉ Ｖ２） 的原病毒基因组为模板,通过套式 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增得到了 Ｈ Ｉ Ｖ２ 的一段特异性膜抗原蛋白基因片段;随后将此片段克隆入诱导表达载体ｐ Ｇ Ｅ Ｘ５ Ｘ１ ,获得了重组表达质粒ｐ Ｇ Ｅ Ｘ３６ Ｅ Ｎ Ｖ． Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 对重组表达菌株诱导后, Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 结果显示重组菌株有特异性表达蛋白带产生     

水稻磷酸酯酶2A基因蛋白的原核表达载体构建、表达和纯化

利用PCR技术,从水稻品种日本晴幼穗cDNA中扩增磷酸酯酶2A的基因ORF片段,并将其克隆入原核表达载体pGEX-6p-1中构建重组质粒pGEX-6p-1-PP-2A,经限制性内切酶酶切鉴定以及测序结果表明成功构建了原核表达载体pGEX-6p-1-PP2A。转化E.coli JM109并通过终浓度为0．4mmol／L的IPTG诱导,表达出39kD的CST-PP2A融合蛋白,并用蛋白亲和层析柱GSTrap FF对表达产物进行纯化,为下一步的研究打下了实验基础。     

睾丸特异表达蛋白质RNF138的表达纯化及抗体制备

目的:制备RNF138的多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.方法:通过RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mRNF138的开放阅读框,并克隆至原核表达载体pET-30a中;将测序正确的pET-30a(+)/mRNF138重组质粒转化大肠杆菌Rosseta菌株,经IPTG诱导表达后通过镍离子螯合柱(Ni-NTA)...     

果蝇血液发育基因Nfat的多克隆抗体的制备

Nfat基因在血液发育中具有重要作用.根据已报道的Nfat基因序列,以果蝇胚胎cDNA为模板,通过PCR扩增Nfat部分编码序列,并将其连接到pET-28A原核表达载体上,经过双酶切以及测序鉴定成功后,将重组质粒转化E.coli BL2l.在37℃时,通过IPTG诱导表达融合蛋白,通过尿素洗涤包涵体并切胶回收纯化融合蛋白,然后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blotting检测抗体的效价以及特异性.结果表明,获得的Nfat多克隆抗体特异性较强,为后期Nfat基因的研究工作奠定了基础.     

NF-κB相互作用多肽原核表达载体的构建、表达与纯化

为了获得高纯度的可溶性NF-κB相互作用多肽,首先以酵母双杂交技术筛选获得的NF-κB相互作用多肽的酵母表达质粒pGAD GH/pp10为模板,扩增多肽基因片段,后经BglⅡ,StuⅠ双酶切后连接到pET-42a(+)载体中,构建GST/多肽融合蛋白的原核表达载体,并将GST/多肽融合蛋白的原核表达载体转化入BL-21菌株,用0.4 mmol/L IPTG于30 ℃诱导表达4 h,后经GST亲和纯化GST/多肽融合蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定融合蛋白的表达和纯度.实验结果表明,成功地构建了NF-κB相互作用多肽的GST/多肽融合蛋白原核表达载体,进行了GST/多肽融合蛋白的诱导表达,融合蛋白的表达为可溶性表达,最终纯化获得纯度约为80%的可溶性GST/多肽融合蛋白,这将为后继利用GST pull-down,Bio-sensor,EMSA等实验进一步验证NF-κB相互作用多肽的功能提供可靠的材料来源奠定基础.     

花生AhAO2基因融合表达、纯化与抗体制备

研究构建AhAO2基因片段原核表达重组质粒pPROEX-Hta-AhAO2的实验结果显示,重组pPROEX-Hta-AhAO2表达质粒在E.coli BL21中高表达His-AhAO2融合蛋白,采用亲和层析与电泳纯化His-AhAO2免疫新西兰大白兔,获得抗His-AhAO2抗体,Western blot检测显示其只与His-AhAO2融合蛋白结合.实验成功制备了抗AhAO2特异抗体.     

AhAO2融合蛋白表达、纯化与抗体制备

构建AhAO2基因片段原核表达重组质粒pPROEX-Hta-AhAO2,表达质粒在E.coliBL21中诱导表达,获得His-AhAO2融合蛋白,采用亲和层析与电泳纯化His-AhAO2免疫,新西兰大白兔,获得抗His-AhAO2抗体,West-ern blot检测显示其只与His-AhAO2融合蛋白结合.实验成功制备了抗AhAO2特异抗体.