结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6的表达、纯化和鉴定

目的:克隆结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出ESAT-6基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白经SDS-PAGE及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。结果:成功克隆了ESAT-6基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western-blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得34kD纯化蛋白,与文献报道相符。结论:成功获得了纯化的ESAT-6蛋白,为进一步研究ESAT-6蛋白的致病机理提供了实验依据。     

结核分枝杆菌4种抗原的基因克隆、表达、纯化和抗原性初步检测

目的:克隆38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64等4种结核分枝杆菌抗原基因,利用大肠杆菌表达系统分别表达重组蛋白,纯化并初步评价其抗原性。方法:通过PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64抗原的基因,连接入pBVIL1表达载体,在大肠杆菌HB101株中进行表达,以间接ELISA方法初步评价其抗原性。结果:获得了结核分枝杆菌抗原38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64的基因,并在大肠杆菌中进行了高效表达,初步验证所纯化获得的抗原具有良好的抗原性。结论:pBVIL1表达载体可以高效表达多种结核分枝杆菌抗原,38kD、ESAT-6和CFP10抗原均可作为结核病血清学诊断的候选抗原。     

结核分枝杆菌Rvl009结构域基因的克隆、表达及亲和层析纯化

目的：克隆结核分枝杆菌Rvl009结构域基因,经序列测定正确后进行融合表达和纯化。方法：采用PCR从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rvl009结构域基因,用限制性内切酶消化后插入pUC-19克隆载体中,经测序正确后亚克隆到融合表达载体pPro-EXHT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了N端带6个连续组氨酸残基的Rvl009结构域多肽,在变性条件下对目的蛋白进行纯化。结果：获得了结核分枝杆菌Rvl009结构域基因,得到融合6个组氨酸残基的Rvl009结构域多肽,纯化获得的蛋白纯度大于87％。结论：构建了结核分枝杆菌Rvl009结构域基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白,为后续深入研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的重组表达及膜定位研究

从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出ESAT-6基因,克隆入pET21a(+)载体.将成功构建的pET21a(+)-ESAT-6重组质粒转化入感受态BL21(DE3)中,经诱导表达后,使用SDS.PAGE和Western blot鉴定.超声破碎后发现目的蛋白以可溶性表达形式存在,经过Ni-NTA柱和DEAE-Seph...     

结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c 的表达、纯化和鉴定

目的:克隆结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c基因,构建其原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1733c基因片段,克隆入pMD18-T载体,序列测定正确后将其亚克隆入原核表达载体pPro-EXHTb,并在大肠杆菌DH5α中进行表达,表达蛋白经SDS-PAGE及Western-blot分析后,以Ni-NTA亲和层析纯化蛋白。结果:成功克隆了Rv1733c基因片段并构建了其原核表达载体pPro-EXHTb-1733c,转化E.ColiDH5α后能表达大小约30 KD的蛋白,Western-blot分析表明表达产物正确。通过亲和层析获得纯化蛋白。结论:成功构建结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c原核表达载体pPro-EXHTb-1733c,并获得纯化蛋白,为研究新型结核疫苗的靶抗原奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv1009结构域基因的克隆、表达及亲和层析纯化

目的:克隆结核分枝杆菌Rv1009结构域基因,经序列测定正确后进行融合表达和纯化。方法:采用PCR从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009结构域基因,用限制性内切酶消化后插入pUC-19克隆载体中,经测序正确后亚克隆到融合表达载体pPro-EXHT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了N端带6个连续组氨酸残基的Rv1009结构域多肽,在变性条件下对目的蛋白进行纯化。结果:获得了结核分枝杆菌Rv1009结构域基因,得到融合6个组氨酸残基的Rv1009结构域多肽,纯化获得的蛋白纯度大于87%。结论:构建了结核分枝杆菌Rv1009结构域基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白,为后续深入研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌esat6-rpfD融合基因的原核表达及产物纯化

目的：构建结核分枝杆菌融合基因esat6-rpfD的原核表达载体,表达和纯化ESAT6-RpfD融合蛋白。方法：从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中经PCR分别扩增esat6和慢周基因,克隆入pMD19-T载体,测序后克隆入原核表达载体pProExHTB,酶切重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白。结果：PCR扩增的esat6、rpfD基因序列与GenBank报道一致;诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blot分析,在相对分子质量约30000处有目的条带,融合蛋白以包涵体形式表达。结论：构建了esat6-rpfD融合基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达并纯化得到ESAT6-RpfD融合蛋白。     

小鼠CSRP2基因的克隆、融合表达及蛋白的分离纯化

目的：获得小鼠CSRP2（cysteine rich protein2）基因片段,高效表达、纯化CSRP2。方法：用RT-PCR技术从小鼠心脏组织中提取总DNA并扩增出相应大小的CSRP2DNA片段,将其与pGEM—T—easy载体连接后测序,将测序正确的CSRP2从BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆入原核表达载体pRSET—A,将连接产物转化大肠杆菌BL21,挑出阳性克隆,IPTG诱导表达重组的6xHis融合蛋白,对重组融合蛋白通过镍柱进行纯化。结果与结论：PCR获得的C职咫序列与GenBank报道的一致（为675bp）;重组载体在大肠杆菌BIJ21中以包涵体形式高效表达;融合蛋白经SDS—PAGE和Western blot分析,在相对分子质量约24×10^3处有特异的蛋白条带,目的蛋白表达量占菌体总蛋白量的25％;重组蛋白经镍柱纯化后,得到了高纯度的CSRP2融合蛋白。     

复苏促进因子结合蛋白A的原核表达及对耻垢分枝杆菌的促生长作用

目的:在大肠埃希氏菌中表达结核分枝杆菌复苏促进因子结合蛋白A(resuscitation-promoting factor-interacting protein A,RipA),观察该蛋白对耻垢分枝杆菌的促生长作用.方法:采用PCR方法,从结核分枝杆菌H37Rv的DNA中扩增出编码RipA蛋白的Rv1477基因,测序正确后克隆入原核表达载体pProEx HTa,构建重组表达质粒pProEx HTa-RipA.以重组质粒转化大肠杆菌DH5a,筛选阳性重组菌株,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside IPTG)诱导RipA表达,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化.将纯化的RipA蛋白加入到耻垢分枝杆菌中,分光光度法测定细菌的A600,观察RipA蛋白的促生长作用.结果:成功扩增了Rv1477基因,并克隆于表达载体pProEx HTa中,经酶切鉴定获得阳性克隆.经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子量为52kDa的目的蛋白,Western-blot结果显示该蛋白与6x His单抗有特异性的反应条带.采用Ni+-NTA柱可获得纯化的目的蛋白.10%M的RipA蛋白可显著促进耻垢分枝杆菌休眠菌的复苏和生长.结论:Papa蛋白在大肠杆菌中成功表达,并能有效促进耻垢分枝杆菌的生长.     

人结合珠蛋白cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的：克隆人结合珠蛋白（haptoglobin,Hp）cDNA,并在大肠杆菌中表达和鉴定。方法：从Hela细胞中分离总RNA,采用RT-PCR方法获得人Hp cDNA,分别克隆至原核表达载体pET-32a和PGEX-4T-1,转化至大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,并进行SDS—PAGE及Western blot鉴定。结果：成功构建了高效原核表达质粒PET-32a-Hp和PGEX-4T1-Hp;Western印迹结果表明,经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了分子量约30kD和37kD的目的蛋白;表达产物经Ni2^＋-NTA离子交换树脂纯化,纯度〉90％。结论：在E．coli成功表达和纯化了人Hp融合蛋白,为进一步开发人Hp诊断试剂打下基础。     

自噬相关基因Atg5的原核表达及多克隆抗体制备

目的：克隆自噬相关基因Atg5,在大肠杆菌中重组表达后制备抗Atg5多克隆抗体。方法：用RT-PCR方法从RAW264．7细胞基因组中克隆Atg5基因,连接至pQE80L原核表达载体后转化大肠杆菌DH50α进行诱导表达,SDS-PAGE及Westernblot鉴定表达蛋白;目的蛋白纯化后,以100μg／kg纯化的蛋白免疫新西兰兔,制备抗Atg5多克隆抗体;提取RAW264．7细胞总蛋白,以制备的抗Atg5多抗进行Westernblot反应,检测多抗的生物学活性。结果：克隆了Atg5基因,在大肠杆菌中表达了重组Atg5,SDS-PAGE分析显示表达产物相对分子质量与预期值一致,Western blot结果证明该产物具有较高的生物学活性,纯化蛋白免疫动物后制备了抗Atg5多克隆抗体。结论：在大肠杆菌中表达了重组Atg5,制备了抗Atg5多克隆抗体,为自噬的检测和研究提供了工具。     

酮古龙酸菌细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ的融合表达及纯化

目的:利用大肠杆菌融合表达酮古龙酸菌细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ(CcoⅡ)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)并纯化。方法:根据酮古龙酸菌Y25基因组序列设计引物,通过PCR扩增CcoⅡ基因,酶切后连接pGEX-KG表达载体,转化至大肠杆菌获得重组菌,经IPTG诱导表达融合蛋白GST-CcoⅡ,用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂亲和纯化融合蛋白,并利用Western印迹及质谱对表达蛋白进行鉴定。结果:扩增得到867 bp的CcoⅡ基因,构建了pGEX-KG-CcoⅡ融合表达载体,重组菌经0.4 mmol/L IPTG于20℃诱导16 h,SDS-PAGE分析显示有可溶性表达条带,相对分子质量约为59×103;Western印迹及质谱分析表明,利用亲和层析方法纯化到了目的蛋白。结论:表达并纯化了GST-CcoⅡ融合蛋白,为酮古龙酸菌电子传递链的研究奠定了基础。     

HPV16 L2肽段偶联AP205 VLP的原核表达及免疫原性分析

目的:将编码HPV16衣壳蛋白L2的65～71、112～120免疫优势表位连接到RNA噬菌体衣壳蛋白AP205氮端,组装形成病毒样颗粒,通过在大肠杆菌中实现表达及纯化,对其免疫原性进行研究。方法:合成编码AP205衣壳蛋白基因和HPV16 L2的65～71、112～120位氨基酸表位的基因序列,PCR连接并克隆至pET30a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒pET30-AP205-HPV16ΔL2,转化大肠杆菌BL21(DH3)感受态细胞,IPTG诱导表达。表达蛋白经凝胶层析纯化及SDS-PAGE、Western blot等理化性质检测,免疫接种ICR小鼠,通过间接ELISA法检测其免疫原性。结果:成功构建重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌中以可溶性表达,透射电镜观察可见典型病毒样颗粒,该VLP在动物实验中表现出较好的免疫原性。结论:成功将HPV16 L2表位偶联AP205以形成VLP,在大肠杆菌中实现可溶性表达。     

突触小体相关蛋白SNAP25的原核表达、纯化及鉴定

目的:克隆突触小体相关蛋白(SNAP25)基因,原核表达、纯化并鉴定SNAP25蛋白。方法:PCR扩增SNAP25基因,克隆至表达质粒pTIG-Trx,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni2+-NTA亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western印迹分析肉毒神经毒素BoNT/A轻链对该蛋白的裂解情况。结果:构建了pTIG-SNAP25表达质粒,经IPTG诱导表达,目的蛋白占全菌蛋白的26.2%,表达形式为可溶性表达,表达量达115.4mg/L,纯化后蛋白纯度达95%以上;经SDS-PAGE及Western印迹分析,SNAP25蛋白可被BoNT/A轻链特异降解。结论:克隆了SNAP25基因,在原核系统中表达、纯化并鉴定了重组SNAP25蛋白。     

人乳头瘤病毒58型E6E7融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒,诱导表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合蛋白。方法:采用PCR方法扩增出HPV58 E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入原核表达载体pET-42a(+)中,构建pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测对重组质粒进行鉴定;将其转入宿主菌大肠杆菌BL21进行诱导以表达HPV58E6E7融合蛋白,并用谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化回收HPV58E6E7融合蛋白,用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达蛋白的相对分子质量及抗原性。结果:PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的目的基因大小、方向正确;HPV58E6E7融合蛋白得到高效原核表达及纯化,表达蛋白的分子大小正确,抗原性良好。结论:pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒构建成功,HPV58E6E7融合蛋白得到高效表达及有效纯化,为检测HPV58型治疗性疫苗的免疫效果提供了抗原。     

具超强富集U(Ⅵ)能力工程菌E.coli的构建

以鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到非特异性酸性磷酸酶基因（phoN）,将其克隆到pMD18T-Vector中。用Spe I、Nde I限制性内切酶对重组转移载体T-VectorphoN与穿梭载体pRADZ3分别进行双酶切,再将phoN片段和穿梭载体pRADZ3中的大片段通过T4DNA连接酶连接。经PCR与双酶切双重鉴定,证实重组穿梭载体pRADZ3phoN构建成功。转化Escherichia coli DH5α感受态细胞,使其在正常情况下表达PhoN蛋白,经Western blot 证实phoN基因在DH5α中成功表达。利用含pRADZ3phoN的工程菌进行富集U(Ⅵ)实验,结果表明该工程菌对U(Ⅵ)的富集量较宿主菌提高约4倍,达46.16mg/g,去除率为92.32%。     

金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药辅助基因femB的克隆和原核表达

金黄色葡萄球菌femB基因与甲氧西林高水平耐药密切相关,可能成为开发抗MRSA药物的新靶位.以金葡菌基因组DNA为模板,PCR扩增femB全长基因,所得片段与pGM-T载体连接并转化感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆以PCR、双酶切及测序鉴定.将鉴定正确的目的片段定向克隆到pGEX-4T-1表达载体中,转化至大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达GST/FemB融合蛋白;采用SDS-PAGE及Western blot对融合蛋白进行鉴定.结果显示,重组质粒在宿主菌中获得了高效表达,融合蛋白相对分子质量为75 kD,该融合蛋白可与抗GST-tag抗体特异结合;表明femB基因的原核表达系统构建成功,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

类泛素家族SUMO-1和UBC9的克隆、融合表达及纯化

目的：克隆类泛素化家族SUMO-1和UBC9基因,表达并纯化二者与谷胱甘肽S-转移酶（GST）的融合蛋白。方法：用PCR方法从乳腺文库中扩增SUMO-1和UBC9的编码序列,分别将其以正确相位与pGEX-KG载体中的GST编码序列融合,得到重组质粒pGST-SUMO-1和pGST-UBC9,分别转化大肠杆菌DH5α,表达融合蛋白GST-SUMO-1和GST-UBC9;用谷胱甘肽-Sepharose4B亲和纯化融合蛋白;用Western印迹检测融合蛋白的表达及纯化。结果：分别构建了SUMO-1和UBC9的融合表达载体;Western印迹检测表明,GST-SUMO-1和GST-UBC9融合蛋白获得表达;纯化得到了融合蛋白。结论：克隆、表达并纯化了SUMO-1和UBC9与GST的融合蛋白。