CASK下调表达对人血管内皮细胞ECV-304增殖能力的影响

目的 建立CASK下调表达细胞株,研究钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(calcium,calmodulin-associated serine/threonine kinase,CASK)下调表达对ECV-304细胞增殖能力的影响.方法 将包含针对CASK基因干扰siRNA片段的pGenesil-1-hCASK重组质粒转染人ECV-304细胞株,经G418加压筛选,成功筛选出CASK下调表达的细胞株.用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中CASK基因的表达水平.采用流式细胞技术、MTT法观察CASK下调表达对ECV-304细胞增殖能力的变化.结果 成功筛选出CASK下调表达ECV-304细胞株(siCASK细胞株),这些细胞在传代过程中绿色荧光蛋白能维持表达,细胞株中转染阳性率在90%以上;经蛋白免疫印迹法检测CASK表达明显降低;siCASK细胞株中G0/G1细胞比率下降,G2M期细胞比率明显上升,增殖指数明显提高,生长曲线左移.结论 成功建立了CASK下调表达的ECV-304细胞株,CASK下调表达可导致细胞增殖能力增强.     

CASK在血管内皮细胞缺氧应激增殖反应中的作用

目的 建立钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase, CASK)剔降血管内皮细胞株,初步探讨其对短暂缺氧的反应性.方法 采用RNAi技术和脂质体介导的细胞转染技术,建立CASK表达下调的血管内皮细胞株,并观察缺氧应激条件下培养0(常氧)、1、3、6、12 h细胞增殖指数的变化.结果 血管内皮细胞在短暂缺氧后细胞增殖指数升高(常氧:42.93%,1 h:50.46%, 3 h:52.53%),随着缺氧时间延长增殖指数则低于常氧对照组(6 h:40.71%,12 h:25.18%).而CASK剔降血管内皮细胞株,在1～12 h缺氧应激时限内,其增殖指数无明显变化.结论 CASK剔降内皮细胞株与对照EA.hy926细胞比较,对短暂缺氧应激的增殖反应性减弱.     

缺氧增加小鼠小胶质细胞IRAK-4的表达

目的 观察缺氧后小鼠小胶质细胞株N9对白细胞介素-1受体相关激酶4( interleukin-1 receptor associated kinase-4, IRAK-4)表达的变化,探讨小胶质细胞内炎症反应的相关机制.方法 将培养的N9细胞置于低氧(3%O2,5%CO2,92%N2)条件下培养1、3、6、12、24 h,用Western blot检测蛋白表达的变化,用激光共聚焦技术观察IRAK-4在细胞内表达变化情况,用酶联免疫吸附法检测培养液上清肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量.结果 N9细胞IRAK-4的蛋白表达随缺氧时间延长而逐渐增高,1 h开始增加,3 h增加明显(P<0 01),6 h达高峰,12 h仍维持在较高水平(P<0 01),24 h 下降与常氧无显著性差异(P>0 05).激光共聚焦也显示随着缺氧时间的延长,荧光强度逐渐加强.培养液上清TNF-α含量的变化也符合相似的变化趋势.IRAK-4蛋白表达水平与培养液上清TNF-α含量的变化呈显著的正相关(r=0.863, P<0 05).结论 缺氧可以增加小鼠小胶质细胞内IRAK-4的蛋白表达,提示中枢神经系统内存在对免疫反应起着调控作用的TLR/IL-1R家族信号转导系统,调控下游炎症反应.     

脂质体介导NF-κB decoy ODN低温缺氧对ECV-304的转染及复氧后对其黏附分子mRNA表达的影响

目的:探讨在Euro-Collin's(ECs)中,低温缺氧条件下脂质体(in vivo liposome)介导NF-κB诱捕物寡核苷酸(NF-κB decoy ODN)对人脐静脉内皮细胞株(ECV-304)的转染效率以及复氧后对其NF-κB活性及受其调控的黏附分子mRNA表达的影响. 方法:应用脂质体/decoy ODN、脂质体/scrambled ODN复合物,在低温缺氧的ECs转染ECV-304. 应用荧光显微镜和流式细胞仪,观察在4℃条件下,decoy ODN浓度为1.0 μmol/L的ECs缺氧保存ECV-304 6 h后的平均荧光强度(MFI)和摄取率以及ODN的胞内分布;同时设立裸ODN转染为对照, 观察脂质体介导decoy ODN对ECV-304的转染效率. 应用凝胶电泳迁移改变试验(EMSA)分析ECV-304低温缺氧保存6 h/复氧后不同时间的NF-κB 活性以及decoy ODN对NF-κB活性抑制效果. 利用RT-PCR方法检测各组ECV-304的ICAM-1, VCAM-1以及P-selectin的mRNA表达. 结果:ECV-304在ECs中4℃缺氧保存6 h后,脂质体介导ODN对ECV-304转染的MFI为1072.7±33.1,是裸ODN转染的91.1倍,细胞对ODN的摄取率为(93.1±2.6)%,是裸ODN转染的71.5倍;脂质体介导ODN 转染的ECV-304,荧光显微镜下可见部分荧光颗粒分布于胞质,胞核内呈强荧光颗粒,而裸ODN转染的ECV-304,胞质内偶见少量荧光,胞核内未见荧光颗粒. ESMA显示ECV-304低温缺氧保存6 h/复氧后1 h NF-κB活性开始升高,4 h达到高峰;转染decoy ODN的ECV-304复氧后4 h其NF-κB活性受到抑制,而转染scrambled.ODN的ECV-304复氧后4 h其NF-κB不被抑制. RT-PCR结果显示decoy ODN转染ECV-304后,其ICAM-1, VCAM-1以及P-selectin的mRNA的表达低于未转染组和scrambled.ODN转染组,有显著性差异. 结论:在ECs中以及低温缺氧条件下,脂质体能高效地将decoy ODN转染到ECV-304的胞核中,而裸ODN则不能进入细胞;经decoy ODN转染的ECV-304,在低温缺氧保存/复氧后,其NF-κB活性被抑制,并且其黏附分子的mRNA表达被抑制.     

金黄色葡萄球菌诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的观察

目的观察人脐静脉内皮细胞株ECV．304对金黄色葡萄球菌（S．aureus）感染的反应。方法常规方法制备金黄色葡萄球菌悬液,以1：1、1：10和1：100的感染复数感染ECV．304细胞1、3、6、12h和24h后,估算细胞吞噬细菌数,采用Hoechst33258染色,DNAladder及细胞凋亡相关因子RT．PCR检测细菌感染后细胞凋亡情况。结果金黄色葡萄球菌感染复数越高,细胞内吞噬的活细菌数越多。金黄色葡萄球菌感染导致ECV-304细胞发生凋亡,凋亡具有时间依赖性,随着感染时间的延长,凋亡小体增多,DNA片段也随之增多。抗凋亡细胞因子Bcl2mRNA表达量随着感染时间的延长下降,而促凋亡细胞因子Bax和Caspase．3表达量增多。结论金黄色葡萄球菌感染ECV-304细胞后,通过下调抗凋亡细胞因子Bcl2、上调促凋亡细胞因子Bax和Caspase-3诱导细胞凋亡。金黄色葡萄球菌感染内皮细胞的可能致病机制为临床治疗提供了实验依据。     

Genistein对人卵巢癌细胞系SKOV3诱导内皮细胞迁移的作用及机制探讨

目的:研究Genistein对人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV3诱导人内皮细胞系ECV-304迁移的作用,以探讨Genistein抑制血管生成作用的机理.方法:采用微孔滤膜培养小室及双室联合细胞培养方法,观察在0.5%BS培养条件下,SKOV3细胞或其条件培养基诱导的ECV-304细胞迁移以及Genistein对SKOV3细胞或其条件培养基诱导的ECV-304细胞迁移的影响;用免疫组化方法检测血管生长因子VEGF、bFGF及TGFβ-l蛋白的表达水平.结果:SKOV3细胞或其条件培养基对内皮细胞均有较强的趋化作用,Genistein对SKOV3细胞或其条件培养基诱导的ECV-304细胞迁移有呈剂量依赖性的抑制作用.20μmol/L Genistein处理ECV-304细胞48h后,VEGF、bFGF蛋白的表达水平降低,而TGFβ-1蛋白的表达水平升高.结论:GenIStein可明显抑制人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV3及其条件培养基对人内皮细胞系ECV-304细胞的诱导迁移作用Genistein可能通过抑制促血管生成调节因子VEGF和bFGF的蛋白表达,增强血管生成的负性调节因子TGFβ-1的蛋白表达来抑制这种迁移诱导作用.     

从受体角度探讨黄芩苷对肺炎衣原体感染细胞的干预机理

【目的】观察黄芩苷对肺炎衣原体诱导的TOLL受体(TLRs)的影响。【方法】体外培养人脐静脉内皮细胞(ECV-304细胞)，待长成单层后加入肺炎衣原体(CPN)为模型组，不加任何刺激者为正常组，每组设3个复孔，6孔板培养2d后，用单克隆抗体荧光标记和姬姆萨染色检测肺炎衣原体在ECV-304细胞内的生长情况；用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达。另取长成单层的ECV-304细胞，加入CPN为模型组，加入CPN 黄芩苷0．48g／L为黄芩苷高剂量组，加入CPN 0．24g／L为黄芩苷低剂量组，用流式细胞仪检测ECV-304细胞表面TLR2蛋白表达。【结果】CPN能在ECV-304细胞内生长；该细胞检测不出TLR4 mRNA的表达，存在TLR2 mRNA和TLR2蛋白的高表达。中药黄芩苷高剂量可降低TLR2蛋白的表达。【结论】黄芩苷对CPN所刺激的TLR2高表达具有抑制作用。     

大鼠肺动脉平滑肌细胞缺氧后STAT3活性变化对细胞癌基因c-jun mRNA表达及细胞增殖的影响

目的观察大鼠肺动脉平滑肌细胞缺氧后信号转导和转录活化因子3(STAT3)活性变化对细胞癌基因c-jun mRNA表达及细胞增殖的影响.方法组织块法原代培养肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),用AG490预孵育后进行缺氧处理,Western blot检测缺氧2、4、6、8、12 h组STAT3酪氨酸活性水平变化;半定量RT-PCR检测缺氧2、4、6、8、12 h组细胞中c-jun mRNA表达水平变化;流式细胞仪检测细胞周期变化.结果 Western blot定量分析示缺氧培养6 h组STAT3酪氨酸磷酸化水平升高,12 h组达高峰;缺氧2 h细胞c-jun mRNA表达升高,6 h达高峰,8 h下降;细胞在缺氧6 h出现G0/G1期细胞比例明显减少,S G2/M期细胞比例明显增加,并随缺氧时间延长变化更显著.与对照组细胞相比,AG490处理组细胞在缺氧各时相点STAT3酪氨酸磷酸化水平及c-jun mRNA表达明显降低,同时G0/G1期细胞比例显著增加,S G2/M期细胞比例显著减少.结论①STAT3活化和c-jun mRNA表达增加参与缺氧PASMCs增殖;②AG490可通过抑制STAT3活性下调c-jun mRNA表达,从而抑制缺氧诱导的PASMCs增殖.     

脂质体介导NF-кB decoy ODN低温缺氧对ECV-304的转染及复氧后对下游粘附分子及趋化因子基因表达的影响

目的探讨在Euro-Collin's(ECs)中,低温(4℃)缺氧条件下脂质体(in v1vo Liposome)介导N F-κ B诱捕物寡核苷酸(NF-κ B decoy ODN)对人脐静脉内皮细胞株(ECV-304)的转染效率以及复氧后对其细胞分子表达的影响.方法ECV-304在10?S的RPMI 1640培养液,37℃、5%CO2条件下培养,生长至单层融合后进行试验.使用前配制Liposome/decoy ODN和scrambled ODN复合物,Liposome与ODN的 /-电荷比率为2.应用荧光显微镜和流式细胞仪,观察在4℃条件下,ODN浓度1.0μM的ECs缺氧保存6h后ECV-304的平均荧光强度(MFI)和摄取率以及ODN的胞内分布;同时设立裸ODN转染为对照,观察Liposome介导ODN对ECV-304的转染效率.利用RT-PCR方法检测各组ECV-304的ICAM-1、VCAM-1、IL-8、MCP-1以及P-selectin的mRNA表达.结果在ECs中、4℃缺氧保存ECV-304 6h后,LiPosome介导ODN对ECV-304转染的MFI为10172.71±33.14,是裸ODN转染的91.1倍,细胞对ODN的摄取率为93.06±2.60%,是裸ODN转染的71 5倍.Liposome介导ODN转染的ECV-304,荧光显微镜下可见部分荧光颗粒分布于胞浆,胞核内可见强荧光颗粒;而裸ODN转染的ECV-304,胞浆内偶见少量荧光,胞核内未见荧光颗粒RT-PCR检测显示Liposome/decoy ODN转染ECV-304后,其ICAM-1,VCAM-1,IL-8,MCP-1以及P-selectin的mRNA的表达低于未转染组和Scramb.ODN转染组,有显著性差异.结论低温缺氧条件下和ECs中,Liposome能有效地将ODN转染到ECV-304的胞核中,而裸ODN则不能进入细胞;经Liposome/decoy ODN处理的ECV-3 04,其下游粘附分子及趋化因子的基因表达被抑制.     

缺氧诱导胶质瘤细胞肿瘤干样细胞形成体外初步研究

目的 通过体外研究初步探讨缺氧可以诱导胶质瘤细胞逆分化形成肿瘤干样细胞.方法 ①采用CD133+细胞免疫磁珠分选法分离胶质瘤细胞得到CD133-细胞群.②缺氧处理CD133-细胞48 h后行免疫荧光染色鉴定肿瘤干细胞样标记蛋白(SOX2,OCT-4,KLF-4,Nanog,CD133)表达情况,并分别缺氧处理0、3、6、9、12、24 h及0、12、24、48、72 h行qRT-PCR及Western blot检测.流式细胞术检测胶质瘤细胞缺氧培养后CD133+细胞比例变化,检测时间为缺氧培养1、3、5、7d.③缺氧处理胶质瘤细胞1、3、5、7d后流式分析细胞周期及凋亡改变.结果 ①荧光检测结果表明,肿瘤干细胞样标记蛋白在CD133-胶质瘤细胞缺氧处理48 h后高表达;qRT-PCR及Western blot检测结果表明,缺氧处理胶质瘤细胞可以明显上调肿瘤干细胞样蛋白表达(P＜0.05),其中qRT-PCR显示SOX-2,OCT-4及Nanog最高表达在缺氧后9h,KLF-4及CD133在缺氧后12h表达最高.Westem blot蛋白检测显示OCT-4最高表达在缺氧后12 h,CD133表达最高在缺氧24h后,KLF-4及Nanog最高表达则在缺氧48 h后,SOX-2在缺氧72 h后表达量最高.另外随着缺氧时间的延长,CD133+细胞数比例逐渐升高(P＜0.05).②细胞周期结果提示缺氧处理肿瘤细胞后,Go/G1期延长,G2/M+S缩短(P＜0.05);凋亡结果提示常氧培养组更易凋亡(P＜0.05).结论 缺氧可以诱导CD133-胶质瘤细胞肿瘤干样细胞形成.     

内皮细胞表达血管内皮细胞生长因子的研究

目的 观察体外培养的内皮细胞表达和分泌血管内皮细胞生长因子(VEGF)的情况。方法 以脐静脉内皮细胞系ECV-304为研究对象，采用RT-PCR、流式细胞仪、ELISA法分别观察佛波脂(PMA)对ECV-304合成与分泌VEGF的作用。结果 100ng／ml PMA能明显上调VEGF mRNA的表达、VEGF蛋白的合成及分泌。其对VEGF mRNA表达及细胞内VEGF合成的作用在12h最为明显；而分泌至上清液中的VEGF量则在18h达到高峰。PMA的上述作用能够被放线菌素D所抑制。结论 PMA能够诱导内皮细胞ECV-304表达、合成及分泌VEGF，该作用呈剂量和时间依赖性。其对VEGF mRNA的作用涉及核苷酸的从头合成途径。     

巨噬细胞对血管内皮细胞增殖、Hoxb2、血管内皮生长因子受体和整合素ανβ3表达的影响

目的 建立人巨噬细胞系U937与人脐静脉血管内皮细胞系ECV-304体外共培养模型,以刀豆蛋白A(ConA)作为U937激活剂,研究巨噬细胞调节血管生成的机制。方法 实验分4组:ECV-304、ConA+ECV-304、U937+ECV-304和ConA+U937+ECV-304。将ECV-304细胞接种,待60%融合时按照不同的分组进行共培养48h后,流式细胞仪检测细胞周期的变化;采用3H-TdR掺入试验检测内皮细胞DNA合成变化;RT-PCR技术检测内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR和同源盒(homebox)Hoxb2基因mRNA表达水平的变化;免疫荧光在流式细胞仪上检测整合素受体ανβ3表达的变化。结果 ConA激活的U937细胞可使内皮细胞S期、DNA合成明显增加(P<0.01);ConA刺激的U937细胞使内皮细胞VEGF受体KDR(0.879±0.003)、Hoxb2基因mRNA的表达水平(0.947±0.003)和整合素受体ανβ3的表达水平(10.26±1.73)明显上调(P<0.01)。结论 ConA活化的巨噬细胞可通过影响内皮细胞的细胞周期、DNA合成、VEGF受体KDR、Hoxb2及整合素受体ανβ3的表达来促进内皮细胞的增殖、迁移及与基质的黏附,从而调节血管的生成。     

hSulf-1基因腺病毒表达载体的构建及其对血管内皮细胞增殖、迁移能力的影响

目的 构建携带人硫酸酯酶1基因(hSulf-1)的腺病毒载体,研究其对于人脐静脉内皮细胞ECV-304增殖、迁移能力的影响。方法 通过基因操作技术将hSulf-1基因插入到腺病毒基因组中,构建重组腺病毒Ad5-hSulf1;应用蛋白质免疫印迹法检测hSulf-1蛋白在ECV-304细胞中的表达及细胞内磷酸化Akt、ERK的表达变化;MTT实验检测hSulf-1过表达对于ECV-304细胞增殖的影响;采用划痕实验研究hSulf-1过表达对于ECV-304细胞迁移的影响。结果 成功构建携带目的基因hSulf-1的腺病毒载体;免疫印迹结果表明hSulf1基因过表达会下调ECV-304细胞Akt和ERK信号分子的磷酸化水平;细胞增殖实验结果表明hSulf1基因过表达抑制了ECV-304细胞增殖,感染复数为50、100时细胞存活率下降至(68.49±0.05)%以及(67.78±0.06)%(P<0.05);划痕实验结果表明hSulf1基因过表达能够抑制细胞的迁移,相比于对照组细胞迁移能力减弱(P<0.01)。结论 重组腺病毒Ad5-hSulf1介导的hSulf-1基因在ECV-304细胞中的过表达明显抑制细胞增殖及迁移,为hSulf-1用于肿瘤及血管生长相关疾病的基因治疗奠定了基础。     

低温缺氧条件下脂质体介导的寡核苷酸对人脐静脉内皮细胞-304的转染

目的 研究在Euro-Collins溶液(ECs)中,低温(4 ℃)缺氧条件下体内阳离子脂质体转染剂(In vivo liposome)介导NF-κB诱捕物寡核苷酸(NF-κB decoy ODN)在人脐静脉内皮细胞株ECV-304中的转染效率。方法 (1) 将ECV-304在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中以37 ℃、5% CO₂的条件培养,待生长至单层融合后,进行试验。(2) 使用前配制脂质体-ODN复合物,脂质体与ODN 的+/-电荷比率为2。(3) 应用荧光显微镜和流式细胞仪,观察在ECs中、4 ℃条件下,ODN浓度分别为0.50、0.75、1.00、1.25 μmol/L时,缺氧保存2、4、6、8 h后ECV-304的平均荧光强度(MFI)和ODN的胞内分布;同时设立裸ODN转染为对照组,观察对ECV-304的转染效率。结果 在ECs中、4 ℃缺氧保存条件下,随着保存时间的延长和脂质体-ODN浓度的升高,ECV-304的MFI增强,保存6 h后MFI基本达到了最大强度,并且大部分ODN均位于细胞核内;而ODN的细胞摄取率无差异。但与裸转染相比,MFI和细胞摄取率均有显著差异性。结论 在ECs中和低温缺氧条件下,脂质体可以高效地将NF-κB decoy ODN转染到ECV-304细胞核,为供体器官在基因调控水平的保护研究提供了实验依据。     

泛素在高糖诱导的血管内皮细胞凋亡中的表达

目的检测高浓度葡萄糖对血管内皮细胞凋亡的影响和泛素表达的变化.方法ECV-304细胞在高糖(25 mmol/L)和正常糖浓度(5.5 mmol/L)DMEM培养液中分别培养24、48、72 h,用MTT法检测细胞活力,用琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡特异性的DNA片段,并用Northern blot检测泛素mRNA的变化.结果高糖24、48、72 h组细胞OD值比正常浓度组均显著下降(P＜0.05);1.8%琼脂糖凝胶电泳在高糖48、72 h组检测到细胞凋亡特异性DNA片段;泛素mRNA在高糖24、48、72 h组分别增加25.37%、53.47%和63.93%(P＜0.05).结论高浓度葡萄糖可增加血管内皮细胞凋亡,泛素mRNA在高糖诱导的内皮细胞凋亡中表达上调,且发生在凋亡形态学改变之前,泛素参与调节高血糖诱导的细胞凋亡.     

终末糖基化产物、高脂诱导内皮细胞凋亡的作用途径及葛根素的保护作用*

[目的]探讨葡萄糖和高脂诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的作用途径及葛根素的保护作用。[方法]采用终末糖基化产物、高脂共同诱导内皮细胞凋亡建立模型,并用葛根素进行干预。采用免疫细胞化学法检测Gaspase3阳性细胞数。流式细胞分析仪检测终末糖基化产物及高脂预处理后内皮细胞凋亡百分率。[结果]中浓度终末糖基化产物（AGE50ug／mol）以及氧化低密度脂蛋白（ox—LDL50mg／L）36h作用于人脐静脉内皮细胞与正常水平的内皮细胞相比,凋亡细胞数量显著增加P〈0．05,葛根素预处理12h后显著降低高糖诱导的凋亡率P〈0．05。[结论]葛根素可以抑制高糖高脂诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡,这在防治糖尿病及动脉粥样硬化并发症的过程中起到一定作用。     

巨噬细胞对血管内皮细胞增殖、Hoxb2、血管内皮生长因子受体和整合素αvβ3表达的影响

OBJECTIVE: To explore the mechanism by which macrophages regulate angiogenesis by co-culturing human umbilical vein endothelial cells (ECV-304) with human macrophage cells (U937) stimulated by concanavalin A (ConA). METHODS: Monolayer ECV-304 cells growing to 60% confluence were co-cultured with 1 x 10(5)/ml U937 cells in the presence or absence of ConA (ConA+U937+ECV-304 and U937+ECV-304 groups, respectively), with non-treated and ConA-treated ECV-304 cells serving as the control groups (ECV-304 and ConA+ECV-304 groups, respectively). Forty-eight h later, U937 cells were removed from the cell co-culture for examining changes in DNA synthesis of ECV-304 cells with (3)H-TdR incorporation assay and for cell cycle analysis with flow cytometry. RT-PCR was employed to assess the influence of macrophages stimulated by ConA on the expression of the target genes. With immunofluorescent method, the changes in the expression of integrin receptor alphavbeta3 of ECV-304 were determined. RESULTS: A significant increase in S-phase ECV-304 cells with enhanced DNA synthesis was observed after co-culture of the cells with ConA-stimulated U937 cells (P<0.01), which also resulted in significant up-regulation of the expressions of KDR mRNA (0.879+/-0.003), Hoxb2 mRNA (0.947+/-0.003) and integrin receptor alphavbeta3 (10.26+/-1.73). CONCLUSION: Macrophages can accelerate the proliferation, migration and adhesion of the vascular endothelial cells to the basilar membrane matrix by affecting their cell cycle, DNA synthesis, expression of KDR mRNA, Hoxb2 mRNA and integrin alphavbeta3, so as to modulate the angiogenetic process of the latter cells.     

低温缺氧条件下脂质体介导的寡核苷酸对人脐静脉内皮细胞-304的转染

目的 研究在Euro-Collins溶液(ECs)中，低温(4℃)缺氧条件下体内阳离子脂质体转染剂(In vivo liposome)介导NF-κB诱捕物寡核苷酸(NF-κB decoy ODN)在人脐静脉内皮细胞株ECV-304中的转染效率。方法 (1)将ECV-304在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中以37℃、5％CO2的条件培养，待生长至单层融合后，进行试验。(2)使用前配制脂质体-ODN复合物，脂质体与ODN的 ／-电荷比率为2。(3)应用荧光显微镜和流式细胞仪，观察在ECs中、4℃条件下，ODN浓度分别为0．50、0．75、1．00、1．25μmol/L时，缺氧保存2、4、6、8h后ECV-304的平均荧光强度(MFI)和ODN的胞内分布；同时设立裸ODN转染为对照组，观察对ECV-304的转染效率。结果 在ECs中、4℃缺氧保存条件下．随着保存时间的延长和脂质体-ODN浓度的升高，ECV-304的MFI增强，保存6h后MFI基本达到了最大强度，并且大部分ODN均位于细胞核内；而ODN的细胞摄取率无差异。但与裸转染相比，MFI和细胞摄取率均有显著差异性。结论 在ECs中和低温缺氧条件下，脂质体可以高效地将NF-κB decoy ODN转染到ECV-304细胞核，为供体器官在基因调控水平的保护研究提供了实验依据。