结核分枝杆菌毒力基因片段Rv0450c分子克隆及原核表达

目的通过分子克隆的方法对结核分枝杆菌H37Rv中编码MMPL4蛋白的Rv0450c基因以及编码该蛋白一个161氨基酸的膜内区域(I161)和一个371氨基酸的膜外区域(O371)的基因片段在大肠杆菌中的表达和纯化方法进行研究,为进一步探讨MMPL4与结核分枝杆菌耐药相关功能性研究以及抗体制备提供依据。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增Rv0450c基因片段,并克隆到原核表达载体pET28b质粒中,获得的重组质粒转化原核表达宿主大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS中,经IPTG诱导后SDS-PAGE电泳方法检测重组蛋白的表达,并进行纯化。结果从结核分枝杆菌基因组H37RvDNA中成功扩增出Rv0450c基因及编码I161/O371的DNA片段,并构建原核表达质粒pET28b-Rv0450c,pET28b-I161和pET28b-O371重组MMPL4蛋白和I161在大肠杆菌中表达不明显,而膜外区域O371以包涵体形式高表达。结论 Rv0450c基因原核表达质粒可以成功构建并在大肠杆菌内较好表达,为进一步MMPL4功能研究和抗体制备打下良好基础。     

结核分枝杆菌MPT64蛋白多克隆抗体的制备

目的利用原核表达系统获取结核分枝杆菌MPT64蛋白,制备并鉴定MPT64蛋白多克隆抗体。方法提取结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA并以其为模板,PCR扩增获取目的基因MPT64,并插入蛋白表达载体PET-26b(+)。将纯化得到的MPT64蛋白免疫新西兰兔,最终制备得到MPT64多克隆抗体,通过免疫印迹法鉴定该抗体的特异性。结果成功获取结核分枝杆菌MPT64基因及其重组蛋白,分子量约为27 k D左右。免疫印迹实验证实,以该重组蛋白为免疫原制备得到的多克隆抗体可特异性识别来自于结核分枝杆菌MPT64基因重组腺病毒疫苗所表达的MPT64蛋白。结论获得高特异性的结核分枝杆菌MPT64蛋白多克隆抗体,有助于结核分枝杆菌疫苗的研发。     

结核分枝杆菌培养滤液蛋白32的克隆表达及血清学检测

目的 构建结核分枝杆菌培养滤液蛋白32(culture filtrate protein 32,CFP32)的重组质粒,在大肠杆菌中表达并纯化重组蛋白CFP32,探讨其对结核病的诊断价值.方法 通过聚合酶链反应技术从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增出Rv0577基因,将其克隆到pMD18一T载体后,再亚克隆到表达载体pET21a,在大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经纯化及复性后,通过Western blot分析,并以酶联免疫吸附试验检测160例血清抗体,其中肺结核患者97例、非结核肺部疾病患者25例,正常对照38名.结果 构建了CFP32重组质粒,并在大肠杆菌中进行了高效表达,表达蛋白经SDSPAGE分析,在约相对分子质量30 000处有表达条带,镍柱纯化后的重组蛋白占总蛋白的90%以上.Western blot证实重组蛋白可以与结核患者血清特异结合.并以此蛋白进行160份血清结核抗体检测,结果敏感度为63.9%(62/97),特异度为96.8%(2/63).结论 成功构建pET21a-CFP32表达载体,并在大肠杆菌中高效表达CFP32蛋白,对其血清抗体检测证明重组的CFP32蛋白有希望成为结核病血清学诊断的有效候选者之一.     

埃可病毒9型VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的原核表达并纯化埃可病毒9型(ECHO9)VP1蛋白,免疫兔子制备多克隆抗体,鉴定重组蛋白的免疫活性,为ECHO9血清学检测试剂和疫苗研究提供依据。方法 PCR方法扩增VP1基因,构建原核表达质粒p ET28a-VP1并转化到大肠杆菌(E.coli BL21),诱导表达并纯化VP1重组蛋白,免疫兔子制备抗VP1多克隆抗体,ELISA检测抗VP1抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性。病毒中和试验鉴定抗体中和ECHO9病毒的能力。结果 VP1重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VP1抗体效价为1∶105。Western blot检测结果显示,抗VP1多克隆抗体可以识别原核表达的VP1蛋白。中和试验显示抗体对ECHO9病毒有中和作用,其效价为1∶10。结论本研究成功原核表达了ECHO9的VP1蛋白并制备出抗VP1多克隆抗体,有助于ECHO9的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究。     

抗草胺膦bar基因原核表达和纯化及其免疫反应性分析

目的 实现抗草胺膦bar基因在原核表达系统中的高效表达及纯化,并分析其免疫反应性.方法 将携带bar基因的重组质粒pET28a-bar转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,确定最佳诱导表达条件.获得的重组蛋白经镍亲和层析纯化后,免疫BALB/c小鼠,测定抗体效价,以获得的抗BAR的抗血清作为一抗进行Western blot反应,检测蛋白的免疫反应性,分析该原核表达蛋白与转bar基因油菜中蛋白的等同性.结果 利用原核表达系统成功实现了BAR重组蛋白的高效表达,其最适表达条件为:0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、20℃和120 r/min摇床转速诱导过夜.以纯化后的目的蛋白作为抗原免疫小鼠,得到抗BAR的抗血清.以间接ELISA法测定抗血清效价达1∶102 400,将其作为一抗进行Western blot反应,结果显示该抗体与原核表达的重组蛋白及转bar基因油菜中的BAR蛋白均能特异性结合.结论 获得了高纯度的BAR重组蛋白,制备了特异性抗BAR多克隆抗体.原核表达的重组蛋白与转bar基因油菜中的BAR蛋白具有相同的免疫反应性,为进行转bar基因产品的食用安全性评价提供实验依据.     

猪囊尾蚴排泄分泌抗原LRRC15蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的构建猪带绦虫重组质粒pET30a-富含亮氨酸重复序列(LRR)结构域15(LRRC15), 原核表达纯化的LRRC15重组蛋白, 制备兔多克隆抗体。方法采用全基因合成方法, 获得猪带绦虫LRRC15蛋白编码基因;将其克隆至pET30a载体, 构建重组质粒pET30a-LRRC15, 并进行双酶切PCR鉴定;将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞, 用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达LRRC15重组蛋白, 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析鉴定表达产物;用Ni-IDA亲和层析柱纯化LRRC15重组蛋白, SDS-PAGE进行分析鉴定;蛋白质印迹法(Western blot, WB)鉴定纯化重组蛋白特异性;用纯化的LRRC15重组蛋白免疫新西兰兔, 制备LRRC15多克隆抗体, 用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定纯化多克隆抗体的效价。结果经PCR鉴定, 扩增出长度为1 506 bp的条带, 与LRRC15基因相符;经SDS-PAGE和WB鉴定, 获得相对分子质量(Mr)约为55.36 × 103的LRRC15目的蛋白;用LR...     

鹦鹉热嗜衣原体CPSIT-0531融合蛋白原核表达载体的构建、表达及免疫原性检测

目的构建鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci,Cps)CPSIT-0531原核表达载体,表达并纯化该融合蛋白,检测其免疫原性。方法采用PCR技术从Cps 6BC基因组中扩增CPSIT-0531基因,并构建pET30a-CPSIT-0531原核表达载体,然后转化到宿主菌E.coli BL21中,IPTG诱导His-CPSIT-0531融合蛋白表达,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA分析His-CPSIT-0531蛋白的免疫原性。结果成功构建了pET30a-CPSIT-0531原核表达载体,并表达和纯化较稳定的重组蛋白;GST-CPSIT-0531免疫小鼠后,ELISA检测免疫小鼠的血清特异性抗体效价为1:640 000。结论成功克隆表达了His-CPSIT-0531,该蛋白具有较好的免疫原性。     

尿道致病性大肠杆菌fimA基因的克隆与表达

目的 对尿道致病性大肠杆菌(UPEC)132编码Ⅰ型菌毛的结构基因fimA进行克隆与表达,建立免疫学检测方法.方法 采用PCR方法扩增fimA基因,定向克隆pET32a载体,原核表达获得FimA重组蛋白;免疫小鼠制备FimA多克隆抗体;建立全菌ELISA方法,检测UPEC 132的Ⅰ型菌毛表型.结果 PCR扩增imA全基因,构建重组质粒pET32a-fimA,经转化构建重组菌E.coli BL21(DE3)/pET32a-fimA;经IPTG诱导表达及镍亲和层析纯化获得重组蛋白FimA;制备的FimA多克隆抗体效价≥1:51 200,Western blot显示其良好的特异性;全菌ELISA获得满意结果.结论 成功地克隆UPEC Ⅰ型菌毛的结构基因fimA,制备的多克隆抗体为UPEC的检测和致病性的研究奠定了基础.     

乙型脑炎病毒E结构域蛋白表达、纯化与胶体金的制备

目的分离乙脑病毒临床株,制备高纯度E蛋白抗原,制作用于乙脑病毒抗体检测的胶体金快速检测试纸条。方法 PCR扩增乙脑病毒E蛋白基因、使用原核表达系统进行融合表达、Ni-柱亲和纯化,透析复性后多点皮下免疫动物获得兔抗乙脑病毒E蛋白的多克隆抗体,免疫印迹法检测该抗体与重组蛋白结合的特异性。对抗体处理后,制备快速检测乙脑病毒的胶体金试剂。结果成功克隆出乙脑病毒E蛋白基因并表达该蛋白,纯化后免疫印迹显示在蛋白分子量53kDa左右显出1条目的条带(乙脑病毒E蛋白);酶联免疫法检测多克隆抗血清的效价达到1:12 800,与阴性血清不发生特异性反应。结论成功对乙脑病毒E蛋白基因进行了克隆表达,制备的胶体金试剂能检测出乙脑患者血清中的抗体,操作简便快速,具有临床推广意义。     

人巨细胞病毒US31蛋白的特异性抗体的制备及鉴定

目的 制备人巨细胞病毒(HCMV) US31原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法 HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至p ET21a(+)原核表达载体,构建p ET21a(+)/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,Ni-NTA亲和层析法纯化US31蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA、Western blot及免疫荧光方法检测抗体效价和特异性。结果 在大肠杆菌中诱导出高表达的HCMV US31融合蛋白,经镍柱亲和纯化后获得高纯度的目的蛋白;免疫新西兰兔诱导产生特异性的Ig G抗体,效价为1∶49 600;经ELISA、Western blot以及免疫荧光均证实制备的特异性抗体可识别细胞中表达的US31蛋白。结论 成功制备了HCMV US31蛋白及特异性抗体,为进一步研究US31蛋白的生物学功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv3914抗原的克隆表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv3914蛋白的重组质粒,并在大肠埃希菌中表达及纯化,为结核病血清学诊断提供候选抗原。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增Rv3914基因片段,插入到pET-28b(+)载体中,构建pET28b-Rv3914重组质粒,转化大肠埃希菌E.coli BL21plysS(DE3),经IPTG诱导表达后,应用Ni-NTA亲和柱纯化重组蛋白。结果 PCR扩增出Rv3914基因序列,重组质粒经测序并经BLAST分析后发现无点突变。pET28b-Rv3914重组质粒在大肠埃希菌E.coli BL21plysS(DE3)中主要以可溶性形式表达,重组蛋白占细胞蛋白总表达量的30%以上,经Ni-NTA柱纯化后,得到纯度超过90%、相对分子质量约为14.7×103的目的蛋白质。结论高纯度结核分枝杆菌Rv3914重组蛋白的获得为研究结核互补特异性抗原组合在结核病血清诊断中的价值奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达及鉴定

目的构建结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达载体并进行表达,为进一步研究奠定基础。方法PCR扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT获得重组表达质粒pGEX-2994,转化大肠杆菌测序后诱导表达,纯化目的蛋白并免疫新西兰大白兔获取多价抗体。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Rv2994基因,成功构建了融合表达质粒pGEX-Rv2994,转化大肠杆菌JM109后,经IPTG诱导,表达出约73kDa重组融合蛋白,用Western blotting证实其有良好的抗原性,纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的抗体。结论成功构建了原核表达载体pGEX-2994,获得并纯化了GST-Rv2994融合蛋白,制备了高效价的多价血清,为Rv2994基因的功能研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌rESAT-6-CFP-10融合蛋白的构建和表达及其免疫反应性分析

目的 构建结核分枝杆菌H37Rv 株esat-6-cfp-10(简称ec)融合基因及其原核表达载体pET-23b(+).esat-6-cfp-10[以下简称pET-23b(+)-ec],表达、纯化融合蛋白rESAT-6-CFP-10(简称rEC),并分析其免疫反应性.方法 采用基因拼接技术将ESAT-6和CFP-10编...     

贵州地区2017—2020年结核分枝杆菌卷曲霉素耐药与相关基因突变关系

目的 检测结核分枝杆菌(M.tb)对卷曲霉素(CM)耐药相关基因突变情况,探究基因型与表型的关联,为临床使用CM提供指导。方法 收集2017—2020年某院痰抗酸染色阳性的肺结核病患者痰标本,培养获得临床分离M.tb,药物敏感试验(DST)明确菌株耐药表型;提取DNA送全基因组测序(WGS),检测CM耐药相关基因tlyA、rrs、rpsL、eis、Rv0194及Rv1258C的突变情况,探索CM与利福平(RIF)表型耐药相关性。结果 共培养123株M.tb,WGS检出6个CM耐药相关基因共23个非同义突变位点;DST结果显示52例RIF耐药,4例CM、RIF均耐药。CM耐药菌株检出rrs基因A1401G、rpsL基因A128G以及Rv0194基因C3293T和T221C非同义突变位点;CM与RIF耐药相关性分析显示,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 M.tb CM耐药可能与rrs基因A1401G、rpsL基因A128G和Rv0194基因C3293T突变有关,CM存在与RIF交叉耐药可能,在制定抗结核治疗方案时可作参考。     

新型隐球菌Cap10蛋白的重组表达及多克隆抗体制备

目的:重组表达新型隐球菌Cap10蛋白并制备特异抗体,为新型隐球菌的检测和诊断提供特异抗原和抗体。方法:选择CAP10基因开放阅读框架(ORF)抗原表位集中、保守性高的片段,经过大肠杆菌偏嗜的密码子优化后进行基因合成,将目的片段克隆至原核表达载体pQE30中构建重组蛋白表达载体pQE30-CAP10并鉴定,IPTG诱导重组蛋白在M15中表达,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定;镍柱纯化后,免疫家兔制备抗血清。结果:在大肠杆菌中成功表达Cap10,其纯度大于95%;二免后家兔血清抗体效价达到200万以上。结论:获得了高纯度的Cap10蛋白及高效价的多克隆抗体,为新型隐球菌的检测和致病机制研究奠定了基础。     

肠道病毒71型强神经毒分离株VP1蛋白的表达鉴定

目的利用大肠杆菌原核表达系统表达肠道病毒71型强神经毒分离株VP1蛋白,为抗体制备和病毒诊断试剂盒的开发奠定基础。方法利用一步法RT-PCR扩增出病毒VP1基因,构建重组原核表达质粒,IPTG诱导后经SDS-PAGE和Western blot验证蛋白表达的特异性。结果重组质粒在1 mmol/L的IPTG 37℃诱导6 h后可诱导表达得到约33 KD的蛋白,且表达的蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在。VP1蛋白特异性单抗和His蛋白单抗验证了蛋白表达的特异性。结论获得特异性的EV71病毒河南分离株VP1蛋白,可用于开发病毒诊断试剂盒。     

亚洲牛带绦虫WD40基因表达及免疫学分析

目的 对亚洲牛带绦虫WD40基因进行克隆、表达和免疫学研究.方法 将亚洲牛带绦虫成虫WD40基因克隆到原核表达质粒pET-28a( )中,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用免疫印迹试验(Western Blotting)进行免疫学分析.结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明,pET-28a( )-WD40重组质粒构建成功.SDS-PAGE结果表明,目的 基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得高效表达.重组蛋白能识别感染了亚洲牛带绦虫的猪血清和患者血清,表明其具有免疫反应性.结论 亚洲牛带绦虫WD40基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达,为进一步研究该蛋白的功能提供了基础依据.     

人乳头瘤病毒16型晚期基因L1在原核细胞的表达及免疫效果观察

目的:人乳头瘤病毒16型(HPV16)疫苗的研制可望防治宫颈癌的发生、发展,本实验从中国感染人群中克隆L1基因,期望制备中国人群的HPV16的预防性疫苗。方法:从HPV16阳性的尖锐湿疣临床标本中,PCR扩增HPV16 L1基因,克隆、测序,并在原核细胞表达L1蛋白,纯化蛋白经过复性后,电镜观察病毒样颗粒(VLP),VLP免疫动物观察抗体产生情况。结果:克隆的HPV16 L1,测序结果发现有4个特异性突变位点是nt6240的C-G、nt6432A→G、nt6901~03及nt6951~53。将HPV16L1基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),高表达的蛋白应用蛋白转印证实是HPV16L1蛋白,纯化的蛋白复性后可以自组装VLP,免疫动物产生高滴度的抗体。结论:从临床标本克隆表达了HPV16 L1基因,可以在原核细胞高表达及体外组装VLP,并且具有良好的免疫原性。为研制HPV16预防性疫苗探索一条易于推广而经济的制备途径。     

Towards a DNA vaccine against tuberculosis

Expression of the gene for a single mycobacterial antigen (Mycobacterium leprae hsp65) in adult Balb/c mice resulted in substantial cell-mediated protection against challenge with M. tuberculosis. CD4 and CD8 T cells cloned from spleens of such immunized mice passively transferred protection to non-immunized mice, and CD8 cells selectively lysed macrophages infected with M. tuberculosis. Three modes of expressing the gene have been tested: (1) expression from a retroviral vector (pZIPNeoSV) in implanted J774 tumour cells, (2) expression from the same vector via bone marrow cells transfected in vitro and used to reconstitute irradiated mice, and (3) in a preliminary experiment, from CMV immediate—early and hydroxymethylglutaryl Co---A reductase promoters injected as plasmid DNA into muscle.