PCR反应程序对土壤微生物PCR-DGGE分析的影响

利用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)探讨不同PCR反应程序(降落式PCR、巢式-降落式PCR、普通PCR、巢式PCR)对土壤微生物PCR-DGGE群落结构和种群多样性分析的影响。利用Quantity One4. 6. 2软件对DGGE指纹图谱进行数字化处理,并计算相应PCR程序下DGGE图谱的多样性指数、丰富度指数、均匀度指数和不同反应程序下图谱的戴斯系数,应用SPSS 16. 0软件对相关指数进行方差分析,检测不同反应程序间各指数的差异显著性。不同PCR反应程序在土壤微生物PCR-DGGE分析时,其群落结构和种群多样性指数间存在明显差异。单纯应用降落式PCR虽然提高了扩增的特异性,却降低了扩增效率,其DGGE图谱丰富度较低,多样性较差,与其他反应程序的DGGE图谱相似度较低;普通PCR反应的DGGE图谱多样性和丰富度较高,与2种巢式PCR相似,然而由于普通PCR在复杂模板情况下容易发生错配,难以保证扩增特异性,因而夸大样品中微生物种群多样性,与2种巢式PCR的DGGE图谱相似度较低。2种巢式PCR反应程序下的DGGE图谱条带丰富,多样性高,群落结构相似度高,能比较全面和科学地反映样品中微生物群落结构和种群多样性。因此,在利用PCR-DGGE分析土壤微生物群落结构和种群多样性时,采用巢式PCR(包括巢式PCR和巢式-降落式PCR)比较合适。研究PCR反应程序对土壤微生物PCR-DGGE分析的影响,可为PCR-DGGE技术在土壤微生物群落结构和多样性分析中的应用和完善提供理论依据。     

连续施用沼液水稻油菜轮作耕层土壤的细菌多样性PCR-DGGE分析

采用PCR-DGGE克隆测序技术,分析沼液连续施用水稻油菜轮作耕层土壤细菌群落结构、丰富度指数和多样性指数等。通过DGGE图谱分析得出,沼液连年施用不利于丰富土壤细菌群落多样性,当连续3 a沼液施用总量控制为339.31～396.81 t/hm2时,细菌群落多样性增加,种群功能丰富、信息复杂、种群稳定,过高或过低施用沼液都会显著降低细菌群落多样性;通过UPGMA分析表明,长期连续施用沼液后土壤细菌遗传相似性降低,细菌种群结构变化越来越大。     

不同耕作处理结合施肥、秸秆还田对土壤微生物多样性的影响

为了探索不同耕作处理对土壤耕层和犁底层微生物数量及其多态性的影响,对吉林省公主岭周边和长春农安等地进行田间试验并采集土壤,通过室内实验对土壤进行PCR扩增以及DGGE图谱分析等研究。结果表明：不同耕作处理下,耕作层和犁底层土壤微生物均较农民常规耕作下土壤微生物种群结构多样性有所增加。通过DGGE图谱条带分析计算得出土壤香浓威尔多样性指数（香浓指数）,显示在耕作层土壤中同一层面不同样地的微生物种群结构具有较高的相似性;不同样地同一深度的犁底层土壤微生物种群结构同样具有较高的相似性。通过该试验的研究最终得出结论：旋耕一体机配合作物根茬还田是增加土壤微生物种群结构多样性的最佳组合方式。     

多菌灵对土壤细菌遗传多样性的影响

[目的]初步分析多菌灵对土壤细菌群落结构的影响,以期为农药污染的生物监测和土壤环境质量综合评价提供土壤微生物监测指标.[方法]采用PCR- DGGE方法研究多菌灵对土壤中细菌群落结构的影响.[结果]多菌灵处理土壤的细菌群落种类和结构组成发生了明显变化,细菌群落Shannon - Wiener指数、丰富度和均匀度均有所降低,5.0、10.0和20 mg/kg多菌灵处理的Shannon - Wiener指数均显著低于对照,分别降低了11.47;、19.11;和26.75;.2.5 mg/kg多菌灵处理土壤DGGE图谱上出现了一新增条带,经序列分析为Uncultured Pectobacterium,初步确定为不可培养的菌.[结论]施用多菌灵影响了土壤细菌群落的种类和结构组成,改变了土壤细菌的种群数量和结构多样性,导致其多样性降低.     

基于变性梯度凝胶电泳的青县苹果再植障碍园与丰产园土壤细菌多样性研究

为了分析比较青县苹果再植障碍园与丰产园的土壤细菌多样性,利用Quantity One软件对变性梯度凝胶电泳(DGGE)图谱进行多样性分析,并对DGGE图谱上的条带切胶测序,以分析群落结构。结果表明,图谱各泳带中的条带数目相差不大,但其亮度有一定差异;DGGE图谱的峰图中,代表丰产园土壤样品的峰具有较大的峰面积;再植障碍园与丰产园土壤中的主要菌群都属于γ变形菌亚门(γ-Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、α变形菌亚门(α-Proteobacteria);仅存在于再植障碍园样品中的细菌属于厚壁菌门(Firmicutes)、γ变形菌亚门(γ-Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)。可见,环渤海湾苹果产区丰产园土壤中的细菌群落与再植障碍园相比拥有较高的丰富度,两种果园有着相似的细菌群落多样性,造成两种果园细菌群落结构差异的细菌具有多样性。     

不同碳氮有机物料对有机菜田土壤细菌多样性的影响

通过模拟试验,利用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳法(PCR-DGGE),研究了施入不同碳氮有机物料(秸秆、苜蓿、有机肥、尿素)56d后,有机生产系统菜田土壤细菌群落结构的特征。结果表明,常规和有机生产系统土壤的细菌群落结构有明显差异。由DGGE图谱ShannonWiener多样性指数分析得知,有机背景处理的细菌多样性整体高于常规背景处理,且有机生产系统土壤加秸秆处理(OS)多样性最高,加入尿素后细菌多样性降低,相反,加入苜蓿后细菌多样性升高。非加权组平均法(UPGMA)聚类分析将常规和有机背景土壤分为两大族群。DGGE条带测序和系统进化树表明,30个条带归属为Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria、Firmicutes、Verrucomicrobia。常规土壤加苜蓿(CA)处理出现的特征性条带B13与有机背景处理的共有条带B28分别与Bacillus属和Pseudomonas假单胞菌属同源性最高。     

种植年限对牡丹根际土壤微生物群落结构的影响

为了探究牡丹连作对土壤微生物种群结构的影响,从菏泽牡丹园采集种植年限分别为3、5、8、12、20年的牡丹根际土壤样品,采用末端限制性片段长度多态性(T - RFLP)技术与变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法研究了样品中细菌和真菌的种群结构变化.结果表明,牡丹根际土壤细菌多样性变化不显著,而真菌多样性水平随种植年限的增加而降低,菌群结构趋于简单,种类大量减少.通过戴斯系数法对牡丹根际土壤的细菌与真菌DGGE图谱分析表明,各样品间细菌种群结构相似度均在76.9％以上,而牡丹根际土壤样品真菌种群结构相似度最低仅为58.3％,说明随着种植年限增加牡丹根际细菌种群结构未发生显著变化,而根际真菌种群结构变化显著.牡丹连作后真菌种群结构的变化可能是引发牡丹连作障碍的主要原因.     

基于PCR-DGGE技术的剑湖湿地湖滨带土壤微生物群落结构多样性分析

为了解剑湖湿地湖滨带植物根际土壤中细菌的群落结构特征多样性,应用PCR-DGGE 技术对剑湖湿地湖滨带4种植物根际土壤细菌的群落结构进行了研究,根据 DGGE 指纹图谱,对它们的遗传多样性进行了分析。结果表明,不同植物群落根际和非根际土壤细菌多样性指数（H′）、丰度（S） 和均匀度（J）均有所不同,根际土壤细菌多样性指数、均匀度、丰富度均高于非根际,其中茭草根际土壤细菌多样性指数、均匀度、丰富度均最高,说明植物群落类型与土壤微生物多样性的关系十分密切;不同植物群落根际土壤细菌群落结构相似性较高,非根际土壤细菌群落结构相似性较低,在82%的相似水平上聚为4大类群,根际土壤细菌和茭草非根际土壤细菌聚为一类,其余非根际土壤细菌各聚为一类,说明植物群落对微生物群落结构具有一定的影响。对 DGGE 的优势条带序列分析,同源性最高的微生物分别属于变形菌门（Proteobacteria）、草酸杆菌科（Oxalobacteraceae）、紫色杆菌属（Janthinobacterium）、杜擀氏菌属（Duganella）、埃希氏菌属（Escherichia）和链球菌属（Streptococcus）,它们均为未培养微生物。不同植物群落根际土壤氮磷含量均有所差异,其中茭草根际土壤氮磷含量最高,湿地土壤细菌多样性与土壤有机质、总N、总P的含量呈正相关关系,土壤细菌多样性与土壤pH值呈负相关关系。     

丛枝菌根真菌和有机土基质栽培对甜椒根际微生物分子多态性的影响(英文)

通过采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对普通土、普通土+G.M、有机土和有机土+G.M 四个不同栽培处理下甜椒根际土壤微生物的多样性进行研究,结果表明:接菌处理使细菌的种类在数量上有所增加,其中有新的细菌类型的出现,也有一些细菌类型的减少和消失,一些共有细菌种类的数量也得到了丰富;应用有机土栽培有利于一些菌群的生长繁殖,有助于促成优势菌群的建立;对电泳图谱的相似性系数分析表明,有机土对细菌菌群多样性的影响强于接种菌根真菌处理;普通土接种菌根真菌对土壤微生物种群的影响强于有机土;接种菌根真菌使土壤的细菌种群结构发生了变化,并增加其菌群种类的相似性。     

碳氮有机物料对有机菜田土壤真菌多样性影响的模拟试验

利用变性梯度凝胶电泳法(PCR-DGGE),研究了施入不同碳氮有机物料56d后,有机生产系统菜田土壤真菌群落结构的特征。结果表明,常规生产系统土壤和有机生产系统土壤的真菌群落结构有明显差异。有机生产系统土壤加秸秆处理(OS)的微生物氮含量显著高于其他处理。由DGGE图谱Shannon-Wiener多样性指数分析得知,有机生产系统土壤(O)以及加入苜蓿处理后(OA)的真菌多样性指数大于常规生产系统土壤,但是加入苜蓿后两者之间多样性指数的差距有缩小趋势,有机生产系统土壤加秸秆处理(OS)多样性指数最高。非加权组平均法(UPGMA)聚类分析将常规和有机背景土壤分为2大族群。DGGE条带测序和系统进化树表明,35个条带的近缘种大部分为非培养真菌,主要优势菌群归属为Pyronemataceae、Pleosporaceae和Ascobolaceae。致病真菌Pleosporaceae的F9和F24条带仅存在于常规土壤,经过添加苜蓿改善后(CA),这些致病菌群条带减弱。具有分解纤维素功能的Ascobolaceae真菌为有机土壤的特征性条带。     

土壤氮循环微生物过程的分子生态学研究进展

固氮作用、硝化作用和反硝化作用是土壤微生物参与氮素循环的三个重要方面。自分子生态学方法应用于土壤学后,土壤微生物作用于氮素循环过程的机理研究取得了若干重要进展。包括:1)利用固氮菌的nifH基因作为分子标记研究有机质、氮素与固氮微生物之间的关系,发现固氮微生物的丰度和群落结构与土壤有机质含量呈正相关。然而,固氮微生物的丰度和群落结构与土壤速效N含量呈负相关,施用氮肥会抑制固氮微生物的生长,施氮土壤固氮微生物数量减少,多样性降低。2)以氨氧化微生物功能基因为探针,揭示了土壤pH与氨氧化微生物分布关系密切,碱性土壤中氨氧化细菌是硝化作用主要参与者,而酸性土壤中氨氧化古菌是硝化作用的主导者。土壤中N素的含量也影响氨氧化微生物的数量和群落结构,施入氮肥后氨氧化微生物的数量和活性增加。3)利用反硝化功能基因为分子标记研究土壤因子对反硝化细菌群落的影响,阐明了土壤可溶性有机碳、pH和土壤水分是影响反硝化细菌数量和群落结构的重要因子,并且发现土壤反硝化细菌与土壤反硝化能力和氧化亚氮释放之间存在着一定的联系,但这种联系在不同研究对象中存在差异,需要进一步确认。目前,利用分子生物学技术解析土壤氮素循环微生物生态功能取得了重要的进展,但还需进一步深入。今后,将采用包括同位素在内的示踪技术与分子生物学方法相结合共同分析氮循环不同代谢过程微生物种群间的相互关系以及氧化亚氮产生与硝化和反硝化微生物之间的关系。     

改良剂对酸性植烟土壤固氮菌群落结构和丰度的影响

【目的】研究不同改良剂对酸性植烟土壤固氮菌群落和丰度的影响,从固氮微生物角度为改良剂的筛选及其推广应用提供科学依据。【方法】采用田间单因素随机试验,设4个改良剂处理,分别为硅钙钾镁(T1)、白云石粉(T2)、硅钙钾镁+生物炭(T3)和白云石粉+生物炭(T4),以不施用改良剂为对照(CK)。烟叶旺长期进行烟株农艺性状调查并采集根际土壤样品,以nifH基因作为分子标记,应用荧光定量PCR和高通量测序技术,研究不同处理的土壤固氮菌丰度和群落结构变化特征,并分析土壤固氮菌群落结构变化的主要驱动因素。【结果】施用不同改良剂普遍提高了烟株农艺性状及土壤p H、有机碳含量和C/N。施用改良剂可显著提高土壤固氮菌nifH基因丰度(P<0.05,下同),T1、T2、T3和T4处理分别较CK提高2.97、3.32、4.68和3.81倍。施用改良剂也提高了土壤固氮菌群落α多样性,且Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数均以T3处理最高。相关分析结果表明,固氮菌丰度、Chao1和ACE指数与土壤pH呈显著正相关。在门水平上,共获得5个类群,其中放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)为优势类群。改良剂施用对固氮菌群落结构有显著影响,优势门和属发生变化,硅钙钾镁+生物炭处理显著增加放线菌门、蓝藻门、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)和固氮螺菌属(Azospirillum)相对丰度。冗余分析结果表明,土壤pH、有机碳、硝态氮和C/N是驱动固氮菌群落结构变化的主要因素。【结论】硅钙钾镁+生物炭混施处理对缓解土壤酸化、改善烟田环境、促进烟株生长及提高固氮菌nifH基因丰度、群落α多样性和优势类群相对丰度效果显著,适合在酸性植烟土壤中推广应用。     

固氮类芽孢杆菌的分离鉴定及其促生、抑菌活性的测定

固氮类芽孢杆菌是一类能产生芽孢、具有固氮能力的革兰氏阳性细菌。这类菌除固氮活性和抗逆力强外,有些菌株还具有促进植物生长、对植物病原菌有抑制作用、耐贮藏等特点,被认为是制备微生物肥料的优良菌种之一,但目前经过鉴定的菌种资源十分有限。从全国20个省不同地理环境、不同种类植物根际采集分离筛选获得500个菌株,从中鉴定出60个具有固氮结构基因(nif H)的分离株,通过对其中17个分离株的nif H和16S rRNA基因序列的比对分析,初步确定了它们的系统发育地位,17个分离株均属于固氮类芽孢杆菌,而且这17个菌株全部具有固氮酶活性,最高达到2 109.9±131.1 nmol/mg·h。进一步分析,其中5株具有IAA分泌能力,最高为49.908±3.6μg/m L,11株对4种常见植物病原菌表现出抑制作用。在17个分离株中,共发现了5株兼具固氮、分泌IAA以及抑制植物病原菌的特点,其中IAA分泌能力最低的BJ-18对番茄幼苗仍具有显著的促生作用。分离和鉴定的固氮类芽孢杆菌丰富了固氮微生物菌种资源,发现的兼具固氮、分泌IAA以及抑制植物病原菌的固氮类芽孢杆菌在农业生产中具有潜在的广泛应用前景。     

灌溉模式对保护地土壤可溶性有机碳与微生物量碳的影响#br#

 【目的】研究沟灌、渗灌、滴灌3种灌溉模式下,保护地土壤可溶性有机碳和微生物量碳在剖面中的分布特征。【方法】灌溉模式设沟灌、渗灌、滴灌3种,进行长达10年的长期定位灌溉试验。对长期定位灌溉试验保护地分层采集土壤样品,测定土壤总有机碳、可溶性有机碳、微生物量碳含量,分析其剖面分布特征。【结果】土壤总有机碳、可溶性有机碳和微生物碳含量均呈表层土壤最高、随土层深度增加而降低的分布趋势;但灌溉模式间差异明显,土壤总有机碳含量在0—10 cm、80—100 cm土层为沟灌＞渗灌＞滴灌,10—80 cm土层为渗灌＞沟灌＞滴灌;在0—100 cm剖面各层,可溶性有机碳含量均为沟灌＞滴灌＞渗灌,微生物量碳为滴灌＞沟灌＞渗灌。可溶性有机碳、微生物量碳占总有机碳的比率分别在4.98%—12.87%和1.48%—2.82%之间,其占总有机碳的比率均为滴灌＞沟灌＞渗灌。土壤可溶性有机碳、微生物量碳与土壤总有机碳含量呈显著的正相关关系。【结论】沟灌有利于土壤总有机碳、水溶性有机碳的积累,滴灌有利于微生物生物量碳的增加;渗灌相比较而言最不利于土壤有机质积累,不仅总有机碳含量低且水溶性含量占总有机碳的比例小。     

污灌土壤-植物体系中污染物迁移积累的研究

研究了污灌时,挥发酚、氰化物和有机氯农药在土壤和山桃、榆树及苹果树等植物中的迁移富集状况。结果表明,污水、植物和土壤样品中含有挥发酚、氰化物和α-666、γ-666、δ-666 3种有机氯农药。各污染物主要来自污水灌溉,富集程度与污水中的各污染物含量相一致。在土壤中,挥发酚有一定的积累,氰化物几乎没有积累。有机氯农药在土壤表层中积累最多。在植物中,挥发酚和氰化物有一定的积累,且山桃中的富集倍数最高。有机氯农药无论是清灌还是污灌,山桃中δ-666>γ-666>α-666,榆树和苹果树中则γ-666>δ-666>α-666。除了少数情况外,无论是清灌和污灌的土壤中,还是山桃、榆树、苹果树等树木中,有机氯残留量和挥发酚、氰化物残留量基本上显示显著性差异,表明污染物存在一定的积累。     

不同种植年限有机茶园土壤微生物群落组成及活性比较

对湖南湘阴县兰岭茶厂古桐岭不同种植年限的4年生、10年生、16年生有机茶园,分别进行了土壤养分含量、微生物类群数量及活性测定.结果表明,16年生有机茶园土壤在有机质、全氮、全磷、速效氮、速效钾等各项指标上均高于10年生和4年生有机茶园土壤.霉菌、细菌、可培养微生物总量、好气性自生固氮菌、嫌气性自生固氮菌、好气性纤维分解菌、嫌气性纤维分解菌均以16年生茶园最多,土壤微生物生物量碳和硝化作用也以16年生茶园最强.说明按照有机农业生产规程管理,随着种植年限延长,能够促进有机茶园土壤的良性循环,有利于活性土壤的形成.     

啤酒废水灌溉对土壤微生物区系的影响

为合理利用啤酒废水进行农田灌溉提供依据。采用泰安市啤酒厂经简单处理的啤酒废水,以清污水比10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶21、∶5和1∶10分别灌溉盆栽小麦和玉米,对土壤中各种菌类微生物数量的变化情况进行研究。啤酒废水灌溉盆栽小麦和玉米对土壤微生物数量影响明显。随着污水浓度的不断增大,细菌、放线菌、好气性纤维素分解菌、硝酸菌、亚硝酸菌、自生固氮菌等的数量均呈现先增加后减少的变化规律。污水浓度过大,会刺激土壤中真菌、氨化细菌、反硝化细菌及一些厌气性菌的繁殖。当废水浓度适当时,污水中的营养成分可以为微生物所用,刺激其活性。综合考虑各种微生物对作物的不同影响,啤酒废水灌溉浓度清污水比以控制在2∶1~1∶2为最佳,污水浓度过高反而不利于植物生长。     

免耕与覆盖对土壤微生物生理类群的影响

通过设置在甘肃省定西市李家堡镇的长期田间定位试验,采用微生物常规分析法测定土壤中固氮菌、氨化细菌和纤维素分解菌的数量,研究不同轮作次序、不同耕作方式与覆盖条件对土壤微生物生理类群的影响.试验结果表明:轮作次序对土壤微生物生理类群影响不大;免耕耕作方式下,微生物量增加主要表现在土壤表层中.免耕配合秸秆覆盖与传统耕作相比,耕层固氮菌、氨化细菌、纤维素分解菌分别增加了24.8%1、0.1%、65.4%,说明免耕与覆盖对土壤生理类群数量的影响显著.     

固氮酶的结构和催化机制及在农业生产实践中影响其活性的因素

介绍了固氮酶的结构和催化机制,并综述了近几年在农业生产中对固氮酶活性有影响的几个因素的研究进展。这些因素包括固氮菌的品种、作物的品种、土壤类型、氮肥的类型、耕作方式和氮肥的施用时期。     

一株拮抗病原真菌的固氮菌Paenibacillus spGD812

 【目的】筛选具有拮抗病原真菌功能的固氮菌,研究菌株的固氮酶活性、nifH、生理生化特征、菌株抗逆性与接种效果等,并对该菌株进行鉴定,为微生物肥料生产筛选菌种资源。【方法】采用无氮培养基富集、筛选固氮菌,用对峙法筛选拮抗菌;乙炔还原法测定固氮酶活性,PCR扩增16S rDNA和nifH;通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定菌种;采用温室盆栽小白菜试验接种效果。【结果】筛选到1株固氮菌GD812,该菌株固氮酶活性达到30.661 nmol C2H4/h•mg蛋白,同时具有拮抗麦类赤霉病菌（Gibberella zeae）和棉花黄萎病菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）功能,抑菌率分别达到59.5%和49.3%;根据形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果,GD812被鉴定为类芽孢杆菌Paenibacillus sp.;该菌株的nifH基因长度300 bp,与Paenibacillus sp. Bs57 nifH基因序列相似性98%;GD812可以利用35种供试碳源中的20种,耐酸碱pH4—11,在4—50℃均可生长,盆栽试验接种比对照小白菜鲜重增加52%。【结论】固氮菌GD812被鉴定为类芽孢杆菌,该菌株利用碳源广泛,抗逆性强,具有较高的固氮酶活性和拮抗病原真菌能力,盆栽试验显示较好的接种效果,可望进一步研发成为优良的固氮微生物肥料生产菌种。