维生素C促进胚胎干细胞与P(3HB-co-4HB)共培养分化生成心肌补片的研究

目的探讨胚胎干细胞是否适合在聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)[P(3HB-co-4HB)]上分化生成心肌补片,添加维生素C能否提高诱导率。方法从3只平均体重为37.5 g的清洁级雌性昆明小白鼠胎鼠中提取胚胎纤维状(MEF)细胞,复苏并传代培养小鼠胚胎干细胞(ESC)。小鼠胚胎干细胞来自于上海生命科学院。用悬滴法形成拟胚体后与细胞补片共培养,实验组使用含维生素C的培养基进行培养,对照组使用不含维生素C的培养基进行培养。使用免疫荧光染色和扫描电镜观察心肌细胞,计算诱导分化效率,绘制分化效率随诱导时间的分布图。结果分布图结果显示分化效率随时间逐渐增高,不加维生素C组最高诱导率为17.8%,加维生素C组最高诱导率为71.1%,差异有统计学意义(P0.05)。结论在P(3HB-co-4HB)生物补片上,ESC可生长、增殖、分化为心肌细胞,添加维生素C可提高诱导率。     

多能干细胞向雄性生殖细胞分化的研究进展

多能干细胞(PSCs)包括胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs),具有分化为成体所有类型细胞的潜能。目前体外已能获得小鼠PSCs来源的成熟精子、人类ESCs(hESCs)/iPSCs(hiPSCs)来源的原始生殖细胞(PGCs)以及减数分裂前期精子细胞。若能诱导人类PSCs(hPSCs)体外分化为功能完整的成熟精子,可望治愈临床上非遗传因素无精子症;对于遗传因素导致少弱精子/无精子症,则可进一步结合基因编辑技术获得健康功能精子。iPSC分化的功能精子可避免精子细胞来源及医学伦理问题,具有更高临床价值。本文综述体外诱导PSCs向雄性生殖细胞分化的研究进展,为应用PSCs治疗男性不育提供参考。     

非接触状态下小鼠胚胎干细胞在小鼠肝癌细胞H22诱导下分化的动态观察

目的 观察小鼠源性肿瘤细胞分泌的细胞因子对小鼠胚胎干细胞(ES cells)的诱导分化.方法 将 ES细胞形成的拟胚体分为诱导组和对照组.诱导组在加入小鼠肝癌细胞H22上清液制成的条件培养基中生长,对照组在去除白血病抑制因子(LIF)的ES细胞培养液中生长.于诱导分化的第7、9、12、15天在倒置显微镜下动态观察两组分化情况,并分别测量上清液中AFP的含量.结果 诱导分化的第7天观察到诱导组拟胚体细胞群落的中心和周边有较为典型的小鼠肝癌样细胞形成,第9、12、15天肝癌样细胞数量逐渐增加.对照组拟胚体向三胚层细胞分化,未见肝癌细胞形成.第9,12,15天诱导组和对照组AFP含量经方差分析,差异有统计学意义(P<0.05).结论 小鼠胚胎干细胞在小鼠肝癌细胞H22分泌的细胞因子的诱导下可以分化为肝癌细胞.     

力学加载对胚胎神经干细胞分化的影响

目的 观察机械力学加载对胚胎神经干细胞(NSC)体外培养和分化的影响.方法 取妊娠13.5d昆明小鼠分离胚胎大脑中的神经干细胞,用添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清培养基进行体外培养,在培养过程中对细胞进行力学加载,免疫细胞化学检测细胞及细胞分化表面抗原.结果 力学加载培养细胞和非加载细胞均呈100％巢蛋白阳性,分化良好,对照组非力学加载分化细胞中(10.9±4.7)％细胞呈Tubulin阳性,力学加载4h后的胚胎神经于细胞的阳性率为(20.5±3.4)％,力学加载后的培养细胞和非加载培养细胞的分化率差异有统计学意义(P＜0.05).结论 力学加载对体外培养的胚胎神经干细胞的分化有促进作用.     

大鼠骨髓间充质干细胞作为滋养层培养小鼠胚胎干细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)作为滋养层体外培养小鼠胚胎干细胞(embryonic stemcells ESCs)的可能。方法:收集BALB/C小鼠3·5d胎龄的囊胚,接种于大鼠骨髓间充质干细胞的滋养层上,培养5~6d后挑取胚胎干细胞集落,胰酶消化传代。观察细胞集落生长情况,通过碱性磷酸酶染色、细胞核型分析对细胞生物学特性进行检测。结果:ES细胞呈集落性生长,碱性磷酸酶组织化学染色阳性,具有正常核型及多向分化潜能。结论:大鼠MSCs可以作为滋养层体外培养小鼠胚胎干细胞,并能保持未分化状态。     

直接贴壁法诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞

摘要：目的利用直接贴壁法体外诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞,并检测其分化效率。方法人胚胎干细胞以1×10’个／cm2的细胞密度传代到铺备有基质胶的培养皿中培养,用带8ng／ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的条件培养基培养6d后,更换为RPMI1640．B27培养基,同时加入100ng／ml的人重组activinA处理24h,接着再加入10ng／ml的人重组骨形态发生蛋白4（BMP4）处理4d,之后更换为不带诱导因子的RPMI1640．B27培养基,每隔2～3d换1次培养基,持续2～3周。在光学显微镜下观察记录出现跳动心肌细胞的时间和跳动频率,并计算跳动克隆百分比,24孔板一组,共记录4组96孔;用免疫荧光染色法检测心肌细胞特异标志物心肌肌钙蛋白T（cTnT）;膜片钳实验检测心肌细胞自发性动作电位;跳动心肌细胞经过24h缺氧刺激后,用凋亡试剂盒检测心肌细胞凋亡比例。结果大量的自发跳动心肌细胞在诱导分化13d左右开始出现。分化出现自发跳动心肌细胞的时间为（13．0±1．1）d,百分比为66．7％,跳动频率为（63．0±7．0）次／分;跳动心肌细胞cTnT染色阳性;跳动心肌细胞检测到自发性动作电位;跳动心肌细胞缺氧24h后检测到凋亡比率为8．0％±0．5％。结论国内首次利用直接贴壁法在体外诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞,分化效率达到66．7％,分化时间13d左右。     

人诱导性多潜能干细胞向表皮样干细胞分化的实验研究

目的 探讨人诱导性多潜能干细胞( iPSC)向表皮样干细胞分化的可能性.方法 (1)以经过灭活处理的小鼠胚胎Fb株作为滋养层,将人iPSC株接种于其上,加入胚胎干细胞完全培养液培养,Ⅳ型胶原酶消化法传代,倒置相差显微镜下观察人iPSC形态及生长状况并行碱性磷酸酶(AKP)染色.以胚胎干细胞不完全培养液悬浮培养iPSC,观察拟胚体形成能力.(2)将人iPSC接种于铺有人羊膜的6孔培养板培养,设为诱导组;另于未铺羊膜的6孔培养板上培养iPSC,作为对照组.观察2组iPSC形态,免疫细胞化学染色法检测整合素β1和细胞角蛋白19( CK19)表达.结果 (1)人iPSC在胚胎干细胞完全培养液中呈典型的干细胞克隆状生长,边界清楚,增殖旺盛;AKP染色阳性.iPSC在无滋养层条件下悬浮培养可形成拟胚体.(2)诱导组iPSC经培养4d后形成干细胞克隆,部分细胞整合素β1和CK19表达阳性.对照组细胞大量死亡,未见整合素β1和CK19表达.结论 人iPSC在羊膜诱导下可定向分化为表皮样干细胞,有望成为皮肤组织工程新的种子细胞.     

大鼠脊髓源神经干细胞胶质细胞源性神经营养因子基因转染实验研究

目的　构建表达外源性胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的脊髓源基因工程神经干细胞。方法　体外分离纯化,扩增大鼠脊髓源神经干细胞,培养、诱导分化结果采用Nestin、NF 2 0 0、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学鉴定;用自行构建的大鼠胶质细胞源性神经营养因子真核表达质粒转染神经干细胞,用荧光检测及GDNF免疫组织化学染色予以证实,转基因GDNF表达采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法定量分析。结果　体外纯化获得大量脊髓源神经干细胞,在血清诱导下能分化为神经元和神经胶质细胞;转基因神经干细胞能稳定表达GDNF ,在随后3周内,转基因神经球能持续表达外源性GDNF蛋白,表达量稳定在(93 .0±6.5 )ng/L左右。结论　胚胎脊髓源神经干细胞体外培养能保持干细胞生物学特点,转染GDNF后神经干细胞能稳定表达外源GDNF蛋白,为后续转基因治疗中枢神经系统疾病研究奠定了基础     

骨髓间充质干细胞及其诱导成骨的研究进展

间充质干细胞(MSCs)是一种多潜能成体干细胞,主要存在于骨髓,还存在于胚胎时期间充质来源的骨外组织[1],如皮肤成纤维细胞、脂肪干细胞、骨骼肌的卫星细胞和血管内皮细胞等。骨髓MSCs(BMSCs)是骨髓基质的组成成分,体外分离培养后,在一定的诱导条件下,BMSCs具有向成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞等多向分化的能力[2-3],这些细胞经过20～30个培养周期,仍能保持多向分化潜能。无论是自体的还是同种异源的BMSCs,一般都不会引起宿主的免疫反应。BMSCs以其来源充足、取材简便、对供体损伤小、易于分离培养、体外增殖能…     

孤雌生殖的胚胎干细胞研究进展

人类胚胎干细胞可以在体外诱导分化成为人体的各种细胞 ,用于医学临床和科学研究。由于胚胎干细胞来源于胚胎 ,在某些国家和地区受到宗教、道德和伦理的制约。孤雌生殖的胚胎干细胞具有与胚胎干细胞相同的全能性和增殖性 ,可以在体外诱导分化成为体内的各种细胞。本文就孤雌生殖的胚胎干细胞的体外建系、定向分化的研究进展作一综述     

胚胎干细胞定向血管化的研究进展

胚胎干细胞具有无限增生及分化为各种体细胞的能力,体外诱导干细胞定向血管化成为组织工程研究的热点;本文综述了胚胎干细胞的培养条件、分子特征、鉴定方法,以及组蛋白乙酰化诱导胚胎干细胞定向血管化.     

重组人血清白蛋白体外诱导干细胞向心肌细胞的分化

目的探讨植物源重组人血清白蛋白能否替代传统B27细胞培养添加剂作为基础培养基分化人多潜能干细胞为心肌细胞。方法人多潜能干细胞以1.2×10~4个/cm~2的细胞密度接种,汇合度达至75%后采用含有0、50、100、200 g/L不同浓度植物源重组人血清白蛋白的分化培养基对其进行诱导分化,在光学显微镜和荧光显微镜下记录干细胞向心肌分化的全过程。用流式细胞仪检测不同浓度植物源人血清重组白蛋白心肌细胞的分化效率。用免疫荧光染色检测心肌细胞特异性标志物α-辅肌动蛋白(α-actinin)和心肌肌钙蛋白T(cTnT);用电镜观察人多潜能干细胞来源心肌细胞的超显微结构以及心肌细胞对药物的反应。结果大量的自发跳动心肌细胞在诱导分化第9 d左右出现,浓度为200 g/L的重组人血清白蛋白配成的心肌分化液的分化效率达60.4%;跳动心肌细胞α-actinin和cTnT染色阳性,超显微结构有肌丝的存在,且对异丙肾上腺素和维拉帕米呈剂量依赖性。结论利用成分明确的、无动物源性的方法在体外诱导人多潜能干细胞分化为心肌细胞,分化效率达60.4%,分化方法简单且低成本,可作为临床级别使用。     

胚胎干细胞定向血管化的研究进展

胚胎干细胞具有无限增生及分化为各种体细胞的能力,体外诱导干细胞定向血管化成为组织工程研究的热点;本文综述了胚胎干细胞的培养条件、分子特征、鉴定方法,以及组蛋白乙酰化诱导胚胎干细胞定向血管化.     

梗死心肌组织裂解液对鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞的诱导分化作用

我们通过向骨髓间充质干细胞(MSCs)培养体系中加入梗死心肌组织裂解液的方法体外模拟梗死心肌细胞微环境,观察梗死心肌微环境对MSCs向心肌细胞诱导分化的作用.     

新型神经营养因子TAT-13DNF对胚胎干细胞分化的影响

目的 探讨合成的新型神经营养因子TAT-BDNF对胚胎干细胞(ESCs)分化的影响,为进一步TAT-BD-NF联合干细胞移植治疗脊髓损伤提供实验依据.方法 取ESCs E14进行体外培养,在全反视黄酸诱导分化的基础上加入20μg/L TAT-BDNF,通过免疫细胞化学染色观察此融合蛋白对ESC分化的影响.结果 TAT-BDNF能促使E14胚胎干细胞分化为多巴胺能神经元和γ氨基丁酸能神经元.随着作用时间的延长,表达成熟神经元NF-200的细胞比例逐步提高(7 d时约37.4%±2.7%、21 d时82.3%±7.6%);TH阳性的细胞比例也逐渐增多(7 d时约7.9%±1.6%,21 d时44%±3.5%),而且神经元的轴突也更加细长.结论 新型神经营养因子TAT-BDNF能促进ESCs细胞向神经元分化并促进神经元成熟.     

干细胞治疗甲状腺功能低下的研究进展

不可逆性甲状腺功能低下(简称甲减)患者的治疗,一直以服用甲状腺激素药物为主,而长期服药可能造成心脏衰竭等,已经成为困扰甲减患者的难题。随着近年对干细胞的研究,在体外诱导下胚胎干细胞成功分化为甲状腺细胞,然而胚胎干细胞应用的伦理问题限制了其进一步发展;而体外诱导骨髓间充质干细胞分化为甲状腺干细胞获得成功。成体干细胞诱导移植技术的应用将为甲低患者治疗提供更好的前景。     

Caspase-3在间质干细胞分化过程中的基因芯片分析及体外作用

目的 观察Caspase-3在小鼠胚胎肢芽间质干细胞分化过程中的作用,并将其运用于体外间质干细胞模型中进行验证.方法 用基因芯片技术检测Caspase-3在小鼠胚胎肢芽间质干细胞分化过程中的基因表达,分析其表达规律和可能作用;Yg用Caspase-3活性检测试剂盒,荧光比色法和Western blot法检测体外培养的骨髓间质干细胞诱导失巢凋亡中Caspme-3活性的改变;借助流式细胞仪分析骨髓间质干细胞凋亡的变化.结果 Caspase-3在小鼠胚胎肢芽间质干细胞向软骨分化的关键期(E12)出现显著的表达下调;Caspase-3的活性以及蛋白表达水平随诱导凋亡时间的延长而明显升高,且与细胞凋亡率相关.结论 Caspase-3蛋白在体内和体外诱导间质干细胞凋亡的过程中均发挥着重要作用;胚胎发育过程中,通过下调Caspase-3的表达以促进软骨形成,而抑制Caspase-3的活性可以有效降低细胞凋亡率.     

不同代次小鼠脂肪干细胞增殖能力及体外成脂能力的实验研究

目的观察不同代次小鼠脂肪干细胞(mASCs)增殖能力及体外成脂能力,为组织工程种子细胞的合理选用提供实验依据。方法采用胶原酶消化小鼠腹股沟皮下脂肪组织,贴壁培养,体外传代扩增。实验采用原代(P0)、第2代(P2)和第5代(P5)细胞。观察不同代次mASCs的细胞形态及增殖能力;经高密度接种培养4周及成脂诱导2周,通过油红染色、RT-PCR检测,探讨其诱导成脂分化潜能及自发成脂能力。结果小鼠脂肪干细胞经传代后,外观主要呈长梭形及不规则形,不同代次的mASCs均具有很强的体外增殖能力;P0细胞具有极强的体外自发成脂能力,P2细胞自发成脂能力明显降低,至P5时基本没有体外自发成脂能力;P0、P2、P5细胞具有相似的诱导成脂分化潜能。结论随着培养代次的增加,mASCs自发成脂能力降低而诱导成脂分化潜能基本不变,扩增至第5代时仍维持了较强的增殖能力及良好的干细胞特性。在一定范围内mASCs体外传代扩增能明显减少其脂肪前体细胞的含量,有助于间充质干细胞纯化。     

成年山羊皮肤干细胞体外克隆与诱导分化

目的 探索山羊皮肤干细胞的分离方法与培养体系，为进一步研究皮肤干细胞增殖分化的分子机制订下基础。方法 从成年关中奶山羊耳尖获取皮肤，用组织块培养法分离皮肤干细胞，碱性磷酸酶(ALP)染色及体外分化实验鉴定，用条件培养基与细胞因子相结合行皮肤干细胞的体外诱导分化。结果 山羊耳尖皮肤分离得到类干细胞集落并传5代，细胞集落具有典型鸟巢状结构，ALP染色阳性，体外分化能形成类胚体。在细胞因子(IGF—1)及条件培养基的诱导下，所分离获取的皮肤干细胞能分化形成类毛囊，类星形胶质细胞及类成骨细胞。结论 用组织块培养法可以获得多能性皮肤干细胞；在体外培养条件下不仅能进行定向分化，还能进行横向分化。     

麻黄碱及阿托品对人诱导多能干细胞来源心肌细胞动作电位的影响

目的探讨麻黄碱及阿托品对人诱导多能干细胞来源心肌细胞动作电位的影响,为人诱导多能干细胞来源心肌细胞的临床应用提供依据。方法利用免疫荧光鉴定人诱导多能干细胞多能性,并利用CHIR99021及IWP-2小分子在体外将其分化为心肌细胞。利用免疫荧光及膜片钳对获得的心肌细胞进行形态学及电生理鉴定。随后通过灌流系统添加500μmol/L麻黄碱及100μmol/L阿托品,并用膜片钳记录动作电位的变化。结果人诱导多能干细胞高表达多能性标志物oct4、sox2、nanog及tra-1-60。分化得到的心肌细胞高表达ctnt、α-actinin、mlc2v等心肌特异性标志物,同时具有自发节律的动作电位。麻黄碱及阿托品能够显著加快自发动作电位的频率,但对动作电位去极化幅度、最大去极化速率及90%动作电位时程无明显影响。结论麻黄碱及阿托品能够加快人诱导多能干细胞来源心肌细胞自发动作电位的频率,证明其具有良好的药物反应性。