血吸虫病时间分辨免疫荧光检测试剂盒的研制和效能评价

目的研制日本血吸虫SjP38的时间分辨免疫荧光分析(Time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)试剂盒,并评价其效能。方法将抗SjP38的9G7单克隆抗体作为捕获抗体包被96孔板,Eu~(3+)标记1A6单克隆抗体作为检测抗体,研制SjP38 TRFIA试剂盒,并评价试剂盒的准确度、灵敏度、精密度、稳定性以及与病原学检测方法的符合率等指标。结果自制试剂盒准确度好,线性范围为2~1 250 ng/ml,最低检出浓度为0.14 ng/ml;精密度良好,分析内精密度为3.6%~4.6%,分析间精密度为5.1%~6.7%。定性试验表明该试剂盒可在4℃稳定半年,37℃稳定7 d。自制试剂盒与病原学检测方法的阳性符合率为95%,阴性符合率为100%。结论所研制试剂盒的各项性能及检测指标均达到临床检验的要求,但临床推广使用还有待进一步的验证。     

时间分辨荧光免疫分析法测定抗环瓜氨酸肽抗体方法学的建立

目的 建立高灵敏度、宽量程的定量检测患者血清中的抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体的时间分辨荧光免疫分析方法.方法 以CCP重组抗原和鼠抗人IgG抗体分别作为固相抗原和Eu3+记抗体,如果样本中存在抗CCP抗体,则形成CCP重组抗原-抗CCP抗体-Eu3+标记鼠抗人IgG抗体复合物,加入解离增强液解离铕离子,检测荧光强度,样本中抗CCP抗体含量与荧光强度成正比;对建立的时间分辨荧光免疫(TRFIA)法检测抗CCP抗体的线性范围、精密度、检测范围进行分析;对32例阳性血清标本分别利用TRFIA及酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测抗CCP抗体,分析其相关性;收集50名健康献血者,32例系统性红斑狼疮,26例干燥综合征,10例硬皮病,20例混合性结缔组织病,18例多发性硬化症,利用TRFIA检测其血清中的抗CCP抗体,计算临床特异度.TRFIA与ELISA 2种方法检测结果的一致性检验采用Mc Nemar检验.结果 TRFIA法检测高、中、低3种浓度混合血清的批内(20份)精密度分别为2%、3%和4%,批间(8份)精密度分别为3%、4%和7%;平均回收率为101%;方法的灵敏度为1.0 U/ml;TRFIA法检测健康献血者、系统性红斑狼疮、干燥综合征、硬皮病、混合性结缔组织病及多发性硬化症患者血清中抗CCP抗体,临床特异度分别为98%、97%、96%、100%、95%、100%;2种方法检测的相关系数为0.989;TRFIA比ELISA的检测范围更宽,稳定性能好.结论 首次建立稳定的高灵敏度和宽检测范围的TRFIA法检测人血清中的抗CCP抗体,对早期诊断RA及监测疗效具有重要意义,该方法以其优势有望在各检验科室得以普遍应用.     

AFP/CEA双标记时间分辨荧光免疫分析试剂的研制及性能鉴定

目的研制甲胎蛋白（AFP）及癌胚抗原（CEA）的双标记时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）试剂,并鉴定其性能。方法将抗AFP单克隆抗体（E014）与抗CEA单克隆抗体（3E6）混合包被96孔板,用钐标记抗AFP单克隆抗体（E010）,铕标记抗CEA单克隆抗体（S001）,用双抗体夹心一步法建立AFP/CEA TRFIA试剂,测定其线性相关性、灵敏度、精密度、回收率、特异性,并与对应的单标记进口试剂进行比较。结果 AFP分析灵敏度为0.3 U/ml,线性范围为0.3~800 U/ml,平均回收率为99.8%,分析内和分析间变异系数分别为2.1%~5.8%、4.1%~8.7%;CEA分别为0.2 ng/ml、0.2~400 ng/ml、100.3%、2.4%~5.6%、4.8%~9.8%。该试剂与对应的单标记进口试剂的相关系数分别为0.99、0.98。结论成功研制了AFP/CEA双标记TRFIA试剂,其性能均达到临床检测要求,可替代国内外的单标记试剂。     

检测犬弓形虫感染双抗体夹心ELISA方法的建立

目的用42#抗弓形虫SAG3单抗为捕获抗体、29#抗弓形虫SAG3单抗作为检测抗体建立检测犬弓形虫感染的双抗体夹心ELISA方法。方法利用HRP标记检测29#抗弓形虫SAG3单抗;采用棋盘滴定法确定捕获抗体42#抗弓形虫SAG3单抗的包被浓度和弓形虫阳性血清稀释度;对封闭剂、检测抗体的工作浓度等条件进行优化,并进行敏感性、特异性、重复性以及稳定性测定。用所建立的双抗体夹心ELISA方法对76份犬待检血清进行检测,计算阳性率。结果最佳优化条件为捕获抗体包被浓度为1∶800稀释(0.34μg/孔),弓形虫阳性血清稀释度为1∶12,封闭剂为10%FBS溶液,最佳封闭时间为2h,参考阳性血清最佳作用时间为2h,检测抗体稀释度1∶3 000,TMB底物最佳显色时间为10min。优化的ELISA敏感性为1∶48;与犬心丝虫阳性血清、犬等孢球虫阳性血清、犬蛔虫阳性血清及犬巴贝斯虫阳性血清之间均无交叉反应;批内、批间重复性试验的CV均15%;保存于4℃中的包被板稳定性90d。用该方法检测76份犬血清中的弓形虫抗原,阳性率为5.26%。结论建立的双抗体夹心ELISA方法特异、敏感,重复性好,可用于犬弓形虫感染的早期检测。     

狂犬病毒核蛋白时间分辨免疫荧光分析试剂盒研制

目的 研制狂犬病毒（RV）核蛋白（NP）时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）试剂盒。方法 采用双抗体夹心法建立RV NP TRFIA 试剂盒,对试剂盒的各项指标进行评价。结果 试剂盒准确度好,线性范围为5～2 500 mEU/mL,灵敏度为1.018 mEU/mL,精密度良好,分析内精密度为2.7%～9.3%,分析间精密度为3.5%～12.2%。将15份疫苗样品用本法与国内常用ELISA检测试剂盒同时检测,其相关系数r为 0.85,稳定性试验表明试剂可以在4 ℃稳定半年,37 ℃稳定7d。结论 试剂盒各项已检测指标达到临床检验要求,有望替代同类产品进一步作临床检测试验。     

时间分辨荧光免疫分析法和酶联免疫吸附实验法测定乙型肝炎病毒大蛋白的方法学比较

目的对时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)和酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测乙型肝炎患者血清中病毒大蛋白(hepatitis B virus large surface protein,HBV-LP)进行方法学比较。方法收集30例正常体检血清标本作为阴性对照和150例慢性乙型肝炎患者血清标本,利用ELISA法检测HBV-LP,将其中70例阳性标本作为阳性样本,70例阴性标本作为阴性样本,再分别采用TRFIA法检测HBV-LP,对二者的灵敏度、特异度、一致性、检测线性范围、精密度、相关性及两种试剂盒的稳定性进行比较。其中TRFIA与ELISA结果不一致的12例标本采用PCR法进行验证。结果TRFIA检测HBV-LP的最小测定值为0.1 ng/ml,ELISA检测HBV-LP的最小测定值为2.5 ng/ml,二者的特异度均为100%。TRFIA和ELISA检测HBV-LP的Kappa值为0.83。12例ELISA和TRFIA检测不一致的标本,经PCR验证后有10例HBV DNA103拷贝数。TRFIA试剂检测的线性范围在0.625~10 252 ng/ml之间,ELISA试剂盒检测的线性范围在5~1 281.6 ng/ml。TRFIA法检测高、中、低3个浓度水平的批内CV平均为6.10%,ELISA法的批内CV平均为8.98%。TRFIA批间CV平均为6.91%,ELISA的批间CV平均为10.45%。TRFIA试剂盒的结合下降率为6.61%,ELISA试剂盒的结合下降率为23.59%。结论 TRFIA与ELISA具有高度的一致性,但是两者相比,前者有更高的灵敏度和精密度,且TRFIA试剂盒的稳定性更好。     

应用重组抗原(rSAG1)检测IgM抗体诊断弓形虫病的研究

目的以刚地弓形虫RH株重组主要表面抗原1作为检测抗原,建立检测弓形虫IgM抗体的rSAG1-ELISA.方法用Ni2 螯合柱纯化重组抗原rSAGI;以不同浓度的rSAG1的包被聚苯乙烯酶标条,阳性和阴性混合血清分别作1:100和1:200稀释,以辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgM为二抗,采用正交试验确定rSAG1-ELISA的最佳检测条件;按其最佳检测条件分别对弓形虫IgM阳性和阴性混合血清重复测20次进行精确度的检测;采用抗体抑制试验检测其特异性;同时对用进口试剂盒筛得的35份弓形虫IgM阳性血清和57份弓形虫IgM阴性血清进行检测.结果 制备的rSAG1重组蛋白纯度在90%以上;rSAG1-ELISA的最佳检测条件为:rSAG1的包被浓度为2.5μg/m1,血清稀释度1:100,酶标记的羊抗人IgM 1:4 000稀释;用rSAG1-ELISA对混合弓形虫IgM阳性和阴性血清的重复检测表明:IgM阳性混合血清检测值的变异系数(CV值)为13.8%,IgM阴性混合血清的CV值为7.7%;灵敏度检测表明血清稀释度在1:50～1:200均可检出阳性;特异性试验的抑制率为62.0%;rSAG1-ELISA与进口试剂盒的总符合率为88.0%,其中阳性和阴性符合率分别为82.9%(29/35)和91.2%(52/57).结论 rSAG1-ELISA具有较好的灵敏度和特异性,与进口试剂盒相比有较高的符合率,表明该法对弓形虫病早期诊断具有较高的价值,可进一步推广应用.     

西尼罗病毒抗体酶联免疫吸附试验检测方法的评价

目的系统地评价血清西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,为在人群和宿主动物中进行WNV感染血清流行病学调查提供技术支持。方法利用构建的包膜蛋白重组质粒(pQE-30)表达纯化西尼罗病毒包膜蛋白,以此为抗原进行ELISA检测。在对抗原包被量、酶标抗体浓度、血清稀释度进行优化的基础上,对本方法的灵敏度和特异度进行评价。结果确定最适抗原包被量为0.034μg,酶标抗体工作浓度和血清稀释度分别为1∶4 800和1∶80;批内变异和批间变异分别为6.7%和22.6%;对小鼠WNV抗体阳性血清53份、JEV抗体阳性血清48份和阴性对照血清94份进行检测,灵敏度为86.8%,特异度分别为93.8%和92.6%。结论本研究建立的ELISA方法灵敏、检测抗体特异,结果可重复,是一种有价值的血清学调查方法。     

建立和评价ELISA法检测血清和唾液中旋毛虫IgG抗体的研究

目的 建立检测血清和唾液中旋毛虫抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法.方法 应用方阵滴定法,筛选适宜的旋毛虫抗原(肌肉幼虫可溶性抗原、肌肉幼虫排泄分泌抗原、成虫可溶性抗原、成虫排泄分泌抗原)浓度、血清和唾液稀释度、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔、山羊抗人IgG抗体稀释度.共有20份旋毛虫感染兔、10份旋毛虫病患者血清和唾液用于这4种抗原的敏感性试验,20份健康兔与38份其他寄生虫感染兔和患者的血清和唾液用于这4种抗原的特异性试验.结果 这4种抗原适宜包被浓度依次为8.0 μg/ml、6.0 μg/ml、10.0 μg/ml、9.0 μg/ml.适宜的血清稀释度依次为1:100、1:200、1:50、1:200,唾液均用原液.适宜的山羊抗兔、山羊抗人IgG稀释度分别为1:2 500和l:2 000.这4种抗原检测旋毛虫感染兔血清和唾液的敏感性分别为100%和80%~100%,检测旋毛虫病患者血清和唾液的敏感性分别为100%和60%~80%;检测血清和唾液的特异性依次为81.03%、89.65%、77.59%、82.76%和93.10%、96.55%、89.65%、91.35%.结论 建立了检测兔和人血清及唾液中旋毛虫lgG抗体的ELISA方法.当采集血清标本有困难时,可将唾液替代血清用于检测旋毛虫病.     

双抗夹心ELISA检测犬粪贾第虫抗原方法的建立及应用

目的建立简便、特异的检测犬粪贾第虫抗原贾第素α-12的双抗夹心ELISA方法。方法利用辣根过氧化物酶标记抗贾第素α-12单克隆抗体4C9,通过过滤、超声的方法处理犬粪样品。以抗贾第素α-12单克隆抗体3H10为捕获抗体,5%脱脂奶粉作为封闭剂,辣根过氧化物酶标记的抗贾第素α-12单克隆抗体4C9为检测抗体,经底物显色后,用酶标仪测量490nm处的吸光度（A）值。通过棋盘滴定法确定抗体最适包被浓度、最佳封闭剂、待检粪液最佳稀释度及酶标抗体最佳稀释度。应用建立的ELISA方法对122份犬粪样品进行检测。结果建立的双抗夹心ELISA检测标准阳性样品的A490为0.465,标准阴性样品的A490为0.098;优化的最佳检测条件为：抗体包被浓度为0.01mg/ml,封闭剂为1%BSA,粪液稀释度为1∶2,酶标二抗稀释度为1∶400,该试验与犬等孢球虫、犬隐孢子虫、犬蛔虫样品均无交叉反应,批间和批内变异系数较小,重复性好。应用本方法对122份犬粪进行检测,阳性率为36.9%。结论建立的双抗夹心ELISA方法特异性高,重复性好,为贾第虫流行病学调查提供了一种更简便、快速、特异的免疫学检测方法。     

Detection of anticardiolipin antibody IgG by time-resolved fluoroimmunoassay

In an effort to improve the quantitative detection of anticardiolipin antibodies (aCL) IgG so as to classify patients correctly as antiphospholipid syndrome (APS) positive, we developed a new immunoassay based on a sandwich time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA) using the complex of cardiolipin plus bovine β₂GPI as antigen and Eu³⁺-labeled rabbit antihuman IgG as conjugate. The precision, sensitivity, specificity, and stability of the assay were evaluated, and comparison with the classical ELISA was also made. The aCL IgG TRFIA kit we established had a wider detectable range than three commercial ELISA ones from different manufacturers when a specimen was diluted, with strong positive result from 1:12.5 to 1:204,800. The average intra-assay and inter-assay CVs detected by the aCL IgG TRFIA was 3.14 and 3.70?%, respectively. The sensitivity was 0.1?GPL?U/ml, and the clinical diagnostic specificity was 98?%. The established assay kit also behaved better in stability than the commercial ELISA ones. Additionally, the immunoassay we established correlated well with the ELISA, and the correlation coefficient was 0.975. We thus conclude that the TRFIA we developed for aCL IgG detection gives promise to a more sensitive and reliable diagnosis of APS and has potential value for large-scale screening programs.     

TRFIA法检测总免疫球蛋白E的分析灵敏度及可报告范围的建立

目的 探讨时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）检测总免疫球蛋白E（总IgE）的分析灵敏度,并建立可报告范围.方法 以试剂盒0 IU/mL的校准品A为空白样本,用校准品A将12 IU/mL的校准品稀释成低浓度系列样本作为分析灵敏度试验样品,空白样本批内重复检测20次,分析灵敏度样本天间重复检测20次,记录每次测定的发光值CPs,计算检测低限（LLD）、生物检测限（BLD）和功能灵敏度（FS）.参考EP6-A文件和相关文献,选用1.21 IU/mL和2 001.01 IU/mL的样本按比例精确配制成不同浓度的系列分析测量范围（AMR）试验样品,重复检测4次,将实测值与预期值作比较,建立该系统的AMR,并选用3份接近AMR上限的高浓度样本,用稀释液做不同倍数稀释后检测,计算稀释回收率,确定该系统最大允许稀释倍数,并结合FS建立临床可报告范围（CRR）.结果 本研究总IgE TR-FIA系统的LLD可达0.21 IU/mL,BLD可达1.00 IU/mL,FS为1.00 IU/mL,AMR为1.12～1 601.03 IU/mL.确定了可最大允许稀释倍数为1：100,CRR为1.00 IU/mL～ 160 103 IU/mL.结论 本研究总IgE TRFIA系统的灵敏度高,AMR和CRR可满足临床需要.     

时间分辨荧光免疫分析法检测C反应蛋白方法的建立及应用

目的 制备4,7-（氯磺酸基苯基）-1,10-菲啰啉-2,9-二羧酸（BCPDA）鳌合剂,并以其建立时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）技术检测C反应蛋白（CRP）的方法.方法 用二甲基甲酰胺（DMF）溶解自制BCPDA后测定其吸光度;以BCPDA分别标记铕（Eu3＋）、CRP多克隆抗体制备CRP多克隆抗体-BCPDA-Eu3＋荧光标记物;以纳米磁珠为固相载体包被CRP单克隆抗体,分别加入CRP抗原及CRP多克隆抗体-BCPDA-Eu3＋,应用六合一板式检测仪检测CRP荧光强度.结果 自制BCPDA吸收光谱为220～360 nm, 用337 nm 的紫外光激发得到CRP多克隆抗体-BCPDA-Eu3＋的荧光发射光谱, 利用TRFIA可检测到0.1 mg/L 的CRP抗原.结论 本研究成功制备CRP多克隆抗体-BCPDA-Eu3＋荧光标记物并建立了TRFIA检测CRP的方法,此为临床检测CRP提供了新的思路,亦为TRFIA的推广应用提供了理论依据.     

微量快速检测血吸虫抗体的斑点免疫金渗滤法试剂盒研制

目的 研制一种适用于现场使用的血吸虫抗体快速检测试剂盒.方法 通过对原有的斑点免疫金渗滤法全面改进,建立新的快速检测血吸虫抗体试剂盒.采用双盲法,检测慢性血吸虫病人血清100人份,正常人、乙肝患者及其他寄生虫病感染血清140人份.以敏感性、特异性、Youden指数、Kappa值等指标评价试剂盒的检测效果.结果 试剂盒的敏感性为92%,特异性为95.08%,Youden指数为0.87,Kappa值为0.87,与华支睾吸虫感染者血清交叉反应率为5%.结论 斑点免疫金渗滤法试剂盒血清用量少,反应快,敏感性、特异性较高,适用于现场血吸虫抗体检测.     

牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿BP亚基单克隆抗体胶体金标记试纸条制备

目的 本研究通过优化牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿BP亚单位单克隆抗体的性能,制备胶体金标记检测牛乳腺炎无乳链球菌的试纸条。方法 利用pET30a(+)-BP重组质粒表达蛋白纯化物免疫小鼠,无菌取脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选杂交瘤细胞,制备单克隆抗体,对单克隆抗体进行胶体金标记后制备检测试剂盒,并确定其灵敏度、特异性等技术指标。结果 经数轮筛选,获得1株阳性杂交瘤细胞株,抗体效价达到1∶256 00。胶体金标记试纸条灵敏度量达到10⁶ CFU/mL。特异性测试结果表明,胶体金标记试纸条与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、副结核杆菌、化脓性链球菌培养物人工污染的牛乳样均无阳性反应,只与无乳链球菌乳样出现阳性结果。结论 该胶体金标记免疫层析试纸条,具有实际应用价值,将为牛乳腺炎的筛查检测提供新型、便捷的技术产品。