体外癫痫模型海马神经元中线粒体衔接蛋白Miro1表达的改变及其意义

目的探讨体外癫痫模型海马神经元中线粒体衔接蛋白Miro1表达的改变及其意义。方法原代培养新生24 h内的SD大鼠海马神经元,通过无镁细胞外液诱导体外癫痫模型。培养至14 d的海马神经元随机分为对照组(CON组)、无镁诱导组(AE组)、AE+对照腺病毒组(AE+r Ad组)、AE+sh RNA腺病毒组(AE+r Ad-Miro1-sh RNA组)。CON组及AE组分别用正常细胞外液和无镁细胞外液作用3 h后,更换为正常维持液。AE+r Ad组、AE+r Ad-Miro1-sh RNA组分别于无镁诱导48 h前转染对照腺病毒、靶向大鼠Miro1基因的sh RNA重组腺病毒真核表达质粒。各组分别于造模后24 h终止细胞培养。采用Western blot法检测细胞内Miro1、ND6蛋白的表达,免疫荧光法检测细胞内ND6蛋白的表达,比色法测定丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)的蛋白浓度。结果与CON组比较,AE组、AE+r Adv组大鼠海马神经元Miro1表达明显升高,AE+r Ad-Miro1-sh RNA组大鼠海马神经元Miro1表达明显降低(均P0.05);AE组、AE+r Adv组、AE+r Ad-Miro1-sh RNA组大鼠海马神经元ND6表达及GSH蛋白浓度明显降低,MDA蛋白浓度明显升高(均P0.05)。AE+r Ad-Miro1-sh RNA组大鼠海马神经元Miro1、ND6表达及GSH蛋白浓度明显低于AE组和AE+r Adv组,MDA蛋白浓度明显高于AE组和AE+r Adv组(均P0.05)。结论线粒体衔接蛋白Miro1可能对无镁致痫海马神经元有保护作用。抑制线粒体Miro1蛋白表达后,ND6、GSH蛋白表达减少,MDA蛋白表达增加,加重线粒体氧化应激损伤。     

FAM134B介导的内质网自噬在无镁外液致痫海马神经元线粒体钙稳态及凋亡中的作用

目的 探讨FAM134B介导的内质网自噬在无镁外液致痫海马神经元线粒体钙稳态及凋亡中的作用.方法 原代培养新生24 h SD大鼠海马神经元,建立无镁外液诱导的体外癫痫模型,并通过慢病毒载体干预FAM134B表达.将培养10 d的海马神经元随机分为对照组(CON)、无镁诱导组(AE)、空载病毒组(NC)、FAM134B过...     

FAM134B介导的自噬在无镁外液致痫海马神经元内质网应激及凋亡中的作用

目的 探讨FAM134B介导的自噬在无镁外液致痫海马神经元内质网应激及凋亡中的作用。方法原代培养新生24 h的SD大鼠海马神经元,通过无镁外液诱导体外癫痫模型。将海马神经元随机分为对照组(CON)、无镁诱导组(AE)、阴性对照组(Lenti-pGV)、过表达FAM134B组(Lenti-FAM134B)和低表达FAM134B组(Lenti-FAM134B-shRNA),并进一步采用选择性自噬抑制剂3-MA进行干预;采用LDH法检测细胞活力、TUNEL法检测细胞凋亡、Western blotting法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、内质网应激相关蛋白GRP78及CHOP的表达。结果 与CON组相比,AE组LDH释放率明显升高,海马神经元活力下降,神经元凋亡明显增加,过表达FAM134B显著降低LDH释放率,增加海马神经元活力,减少AE诱导的神经元凋亡; AE组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例增加,过表达FAM134B使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例进一步增加; AE组GRP78和CHOP的表达明显增加,过表达FAM134B显著减少AE诱导的GRP78和CHOP表达的增加,而低表达FAM134B均发挥相反作用。与过表达FAM134B组相比,3-MA消除过表达FAM134B对AE诱导的内质网应激及神经元活力的影响,显著增加GRP78和CHOP的表达,并增加LDH释放率。结论 FAM134B可能通过调控自噬途径对内质网应激和神经元凋亡发挥保护作用。     

Omi/HtrA2在无镁外液致痫海马神经元凋亡中的作用机制及其特异性抑制剂UCF-101的神经元保护作用

目的观察线粒体丝氨酸蛋白酶Omi/Htra2在体外颞叶癫痫模型中神经元凋亡方面发挥的作用及其机制,以及其特异性抑制剂UCF-101对痫性损伤神经元的保护作用。方法原代培养新生24 h内的SD大鼠海马神经元至10 d,随机分成对照组、无镁细胞外液处理后3 h组、8 h组以及24 h组,观察细胞形态学特征,采用免疫蛋白印迹法观察海马神经元中Omi/Htra2蛋白的表达变化;再随机将神经元分为对照组、无镁细胞外液处理后24 h组、UCF-101处理组以及DMSO组,采用TUNEL法检测各组神经元凋亡,免疫蛋白印迹法观察神经元XIAP、caspase3、HAX-1蛋白的表达变化。结果随着无镁外液作用时间的延长,Omi/Htra2在线粒体中的含量逐渐减少,胞浆中含量逐渐增多。与正常对照组相比,致痫24 h后神经元凋亡数目以及caspase3蛋白表达显著增多(P<0.05),且HAX-1蛋白表达下降(P<0.05),而XIAP蛋白的表达正常对照组与模型组相比无统计学差异。与致痫24 h组相比,UCF-101处理组神经元凋亡细胞数和caspase3的表达均明显减少(P<0.05),XIAP及HAX-1蛋白表达增多(P<0.05),DMSO组神经元凋亡细胞数、上述蛋白表达方面与致痫24 h组无明显差异(P>0.05)。结论神经元遭到无镁细胞外液作用后,Omi/Htra2从线粒体移位到了胞浆,其特异性抑制剂UCF-101能有效抑制神经元凋亡,下调神经元caspase3蛋白的表达,上调XIAP、HAX-1蛋白的表达,发挥神经元保护作用。     

线粒体钙单向转运体在匹鲁卡品致痫大鼠海马神经损伤中的作用

目的研究线粒体钙单向转运体(mitochondrial calcium uniporter,MCU)在氯化锂-匹鲁卡品(pilocarpine,PILO)癫痫大鼠模型神经损伤中的作用。方法将84只雄性SD大鼠随机分成空白对照(CON)组、PILO组(2 h、8 h、24 h和72 h 4个亚组)、Ru360组和精胺(Spermine)组。观察各组大鼠行为学改变,并荧光染色法测定海马组织线粒体Ca~(2+)浓度,TUNEL染色检测海马CA3区神经元凋亡,并采用Western Blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cyt C和caspase-3表达变化。结果 (1)与CON组比较,PILO组海马神经元线粒体Ca~(2+)浓度明显升高,凋亡明显增加(P0.05);与CON组比较,PILO组海马Bax表达水平、线粒体Cyt C释放及caspase-3激活明显增多,而Bcl-2表达水平明显减少(P0.05)。(2)与PILO组比较,Ru360组海马神经元线粒体Ca~(2+)浓度明显降低,凋亡明显减少(P0.05);与PILO组比较,Ru360组海马Bax表达水平、线粒体Cyt C释放及caspase-3激活明显减少,而Bcl-2表达水平明显增多(P0.05)。(3)与PILO组比较,Spermine组海马神经元线粒体Ca~(2+)浓度明显升高,凋亡明显增加(P0.05);与PILO组比较,Spermine组海马Bax表达水平、线粒体Cyt C释放及caspase-3激活明显增多,而Bcl-2表达水平明显减少(P0.05)。结论 MCU在PILO癫痫大鼠海马神经损伤中发挥重要作用,抑制MCU可发挥对海马神经元凋亡的保护作用,其机制可能是通过抑制线粒体介导的细胞凋亡途径。     

脐血间充质干细胞外泌体对APP/PS1小鼠海马神经元的保护作用及其机制

目的 研究脐血间充质干细胞外泌体(MSC-EXO)对阿尔茨海默病(AD)小鼠海马神经元的保护作用及其机制。方法 将20只APP/PS1小鼠随机分为AD+saline组和AD+EXO组,每组10只;将10只野生型C57小鼠作为正常对照组。AD+EXO组小鼠经尾静脉注射EXO悬液,AD+saline组和对照组小鼠注射等体积的生理盐水。30 d后取脑,用免疫组织化学染色检测脑内Aβ负荷,尼氏染色检测神经元的数量及尼氏小体,透射电子显微镜观察海马神经元的超微结构,Western blot检测海马Nrf2、Keap1及HO-1的表达量。结果 与对照组相比,AD+saline小鼠脑内有大量Aβ沉积,Aβ阳性面积明显增多,海马DG区神经元数量减少(P 0. 01);并且海马神经元的线粒体出现明显肿胀、空泡化等损伤表现。与AD+saline相比,AD+EXO小鼠皮层与海马组织的Aβ负荷降低,海马DG区的神经元数量显著增多(P 0. 05),线粒体水肿、空泡化减轻。与对照组相比,AD+saline组小鼠海马Nrf2、HO-1蛋白的表达量升高,Keap1蛋白的表达量降低(均P 0. 05);而AD+EXO组与AD+saline组相比,Nrf2和HO-1蛋白的表达量降低,Keap1蛋白的表达量升高(均P 0. 05)。结论MSC-EXO可能通过调节Nrf2/Keap1通路,而发挥对APP/PS1小鼠海马神经元的保护作用。     

阿托伐他汀对Aβ1-40诱导AD模型的氧化应激及凋亡的影响

目的观察阿托伐他汀对Aβ1-40诱导AD大鼠模型的氧化应激和凋亡的影响。方法雄性SD大鼠40只,体质量250～300g,随机分为空白对照组、假手术组、Aβ组、Aβ+生理盐水组、Aβ+阿托伐他汀组,每组8只。后3组在大鼠双侧海马CA1区立体定向注射Aβ造AD模型,假手术组注射生理盐水,正常对照组不做任何处理。Aβ+阿托伐他汀组在造模1周前开始给予阿托伐他汀20mg/(kg.d)灌胃,Aβ+生理盐水组给予等量生理盐水灌胃。造模4周后,测定大鼠脑皮质、海马组织MDA、SOD及GSH活性的变化;蛋白印迹技术检测大鼠海马区Bcl-2及Caspase-3的表达。结果与空白对照组相比,Aβ组大鼠脑皮质、海马组织内MDA活性明显升高(P<0.05),SOD、GSH活性明显降低(P<0.05),Caspase-3的表达升高(P<0.05),Bcl-2的表达降低(P<0.05),与Aβ组相比,Aβ+阿托伐他汀组大鼠的大脑皮质、海马组织内MDA明显减低(P<0.05),SOD、GSH活性明显升高(P<0.05),Caspase-3的表达下降(P<0.05),Bcl-2的表达升高(P<0.05)。结论阿托伐他汀对Aβ1-40诱导AD大鼠模型有一定的脑保护作用,其机制与抑制氧化应激及抗凋亡有关。     

MiR-133b对MPP~+诱导的帕金森病多巴胺能神经元模型中酪氨酸羟化酶表达的影响

目的探讨miR-133b对l-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的帕金森病(PD)多巴胺能神经元模型中酪氨酸羟化酶(TH)表达量的影响。方法采用大鼠胚胎(孕14 d)中脑腹侧组织进行原代细胞培养,依据不同处理方法分为4组:1空白对照组,无任何干预措施;2阴性对照组,使用携带空载miRNA慢病毒颗粒(miR-NC)持续转染48 h,换液后无血清培养基继续培养24 h;3miR-NC+MPP+组,使用携带空载miRNA慢病毒颗粒持续转染48 h,换液后10μmol·L-1MPP+继续作用24 h;4miR-133b+MPP+组,使用携带miR-133b慢病毒颗粒持续转染48 h,换液后10μmol·L-1 MPP+继续作用24 h。采用Western blot法分别检测各组TH蛋白表达水平。结果与miR-NC+MPP+组比较,miR-133b+MPP+组TH蛋白表达量显著升高,差异有统计学意义(F=22.598,P0.05)。结论 miR-133b可提高PD多巴胺能神经元模型中TH蛋白表达水平,发挥一定的神经保护作用。     

慢性低氧低糖培养影响新生大鼠海马神经元α-分泌酶的实验研究

目的探讨慢性低氧低糖培养对新生大鼠海马神经元α-分泌酶活性及表达的影响。方法取新生24h的Wistar大鼠海马原代培养神经元并予以鉴定,培养第七天予以12h、24h、36h低氧低糖培养干预,MTT法检测海马神经元的活力,荧光法检测α、β-分泌酶活性,Western blot检测α-分泌酶蛋白表达水平。结果低氧低糖培养12小时组海马神经元α-分泌酶活性升高(P<0.01),低氧低糖培养24h、36h组α-分泌酶(TACE)活性无明显变化(P>0.05),低氧低糖培养12h、24h、36h组海马神经元β-分泌酶(BACE1)活性升高(P<0.05);低氧低糖培养12h、24h、36h组海马神经元α-分泌酶蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论慢性低氧低糖培养降低新生大鼠海马神经元α-分泌酶的表达。     

miR-146a通过靶向TRIB3调节癫痫大鼠海马神经元凋亡及炎症反应

目的探讨miR-146a靶向调控Tribble同源蛋白3(TRIB3)对癫痫大鼠海马神经元凋亡的影响,以及对炎症反应的调控作用。方法体外培养新生Sprague-Dawley(SD)大鼠的海马神经元,制备癫痫海马神经元模型,采用免疫荧光双染法和膜片钳技术检测癫痫海马神经元模型。将海马神经元随机分为四组:空白对照组(control组):正常海马神经元;癫痫组(EP组):癫痫海马神经元;阴性对照组(miR-146a NC组):转染100 nM miR-146a NC至癫痫海马神经元;miR-146a mimic组:转染100 nM miR-146a mimic至癫痫海马神经元,采用脂质体介导法进行转染;流式细胞术检测各组海马神经元细胞的凋亡情况;Western blot检测各组海马神经元中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)以及肿瘤抑制基因p53的蛋白表达;ELISA法检测各组海马神经元细胞培养液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6 (IL-6)含量;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平;双荧光素酶报告基因实验确定miR-146a与TRIB3的靶向作用情况。结果癫痫组大鼠海马神经元与正常组大鼠海马神经元相比较形态未见明显异常;癫痫大鼠海马神经元自发性放电频率明显较正常大鼠海马神经元明显增加(P0.05);与空白对照组比较,癫痫组miR-146a表达水平升高,海马神经元凋亡数目显著增加,海马神经元中caspase-3、Bax及p53的蛋白表达显著增加,Bcl-2蛋白表达减少,TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平与细胞培养液中的含量均升高,差异均有统计学意义(P 0.01)。与癫痫组比较,miR-146a mimic组海马神经元凋亡数目下降,caspase-3、Bax及p53的蛋白表达显著减少,Bcl-2蛋白表达增加,TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平与含量均下降,差异均有统计学意义(P 0.01)。TRIB3与miR-146a存在靶向关系,在野生型TRIB3-WT中,miR-146a mimic组荧光素酶活性较miR-146a NC组显著降低(P0.01)。结论高表达miR-146a通过靶向调节TRIB3 mRNA表达来抑制海马神经元凋亡的发生,并减少TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的释放。     

无镁诱导惊厥后发育中皮层神经元γ-氨基丁酸A受体α1亚单位的变化

目的 研究无镁诱导对惊厥后发育中皮层神经元表达γ-氨基丁酸A受体(GABAAR)α1亚单位的影响.方法 以原代培养的大鼠大脑皮层神经元无镁诱导的反复惊厥样放电为模型,根据对培养6 d皮层神经元的不同处理分为正常细胞外液组和无镁细胞外液组.神经元在上述2种液体中孵育3 h,然后恢复正常DMEM培养液继续培养,1、7及12 d后应用流式细胞技术、免疫细胞化学技术及实时荧光定量PCR测定2组大鼠皮层神经元GABAAR α1亚单位表达的变化.结果 应用流式细胞技术发现无镁损伤后12 d时无镁组GABAAR α1阳性细胞率较对照组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);应用免疫细胞化学方法发现无镁损伤后7d、12 d时实验组GABAAR α1蛋白表达较对照组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);应用实时荧光定量PCR发现无镁损伤后1 d时,无镁组GABAAR α1 mRNA表达较对照组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05).结论 早期无镁细胞外液处理可以诱导发育中大鼠皮层神经元GABAAR α1表达的改变.     

褪黑素对癫痫状态大鼠海马Caspase-3 mRNA表达和脂质过氧化的影响

目的 探讨褪黑素（melatonin,Mel）神经元保护作用的机制.方法 采用匹罗卡品（pilocarpine,PILO）诱导大鼠癫痫持续状态（status epilepticus,SE）模型,用比色法检测海马丙二醛（malondialdehyde,MDA）、还原型谷光甘肽（glutathione,GSH）水平和谷光甘肽还原酶（glutathione reductase,GR）的活力,用RT-PCR技术检测海马caspase-3 mRNA的表达.结果 PILO组大鼠SE后6h～72h,海马MDA含量明显高于对照组（P＜0.01）;海马GSH含量和GR活力均明显低于对照组（P＜0.01）,SE后7d,海马MDA含量和GR活力基本恢复正常.PILO＋Mel组大鼠,在SE后各时相点海马MDA含量均明显低于PILO组大鼠（P＜0.01）;而海马GSH含量和GR活力均显著高于PILO组大鼠（P＜0.05）.SE后6h～72h,PILO组大鼠海马caspase-3 mRNA的表达明显高于对照组（P＜0.01）和PILO＋Mel组（P＜0.01）,提示给予Mel可明显抑制SE大鼠海马caspase-3 mRNA的表达.结论 Mel发挥神经元保护作用的机制是通过提高SE大鼠海马GSH水平和GR活力,来减轻脂质过氧化损伤;并通过抑制caspase-3 mRNA的表达,来干预细胞凋亡.     

Akt1在颞叶癫痫大鼠海马中的表达变化

目的研究颞叶癫癎模型海马区神经元Akt1表达变化,探讨其在癫癎发生发展中的作用。方法采用氯化锂-匹罗卡品方法制备颞叶癫癎大鼠模型,Western blotting检测海马区总蛋白、Quantity one软件行灰度值分析;免疫组织化学染色观察海马各区Akt1蛋白表达变化,计数不同处理组阳性神经元数目。结果 Western blotting检测结果显示,与正常对照组相比,癫癎模型组大鼠于癫癎持续状态发作即刻海马区Akt1蛋白表达升高(t=2.445,P=0.034),并于第30天时达峰值水平(t=1.214,P=0.002),发作后24 h表达水平迅速降低,并低于正常值范围(t=4.294,P=0.000),其余各测量时间点表达无明显改变;与氯化锂组相比,癫癎模型组大鼠于癫癎持续状态后1h海马区Akt1蛋白表达开始降低,24 h降至最低水平(t=4.134,P=0.000),至发作48 h后开始逐渐升高(t=2.481,P=0.002),并于发作第7天时升至氯化锂组水平。免疫组织化学染色显示,癫癎持续状态发作后海马CA3区Akt1蛋白表达阳性神经元数目立即增加,12h达高峰(t=16.586,P=0.000),48 h减少并降至正常值水平(t=0.357,P=0.089),发作后第10天再次增加(t=3.123,P=0.000),于第30天时阳性神经元数目再次达峰值水平(t=18.339,P=0.000),第50天开始恢复至正常值水平(t=3.219,P=0.000);氯化锂组仅海马CA3区Akt1蛋白表达于实验初始(0 h)升高并高于正常对照组(P<0.05),海马CA1和CA2区Akt1蛋白表达变化组间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论海马及海马CA3区Akt1蛋白表达均呈现癫癎持续状态后升高、降低、再升高的动态过程,提示可能存在神经元保护作用,对抗细胞凋亡、促进细胞存活。     

树脑缺血后海马线粒体应激与神经元损伤机制研究

目的研究光化学诱导树脑缺血后不同时间海马神经元细胞色素C(CytC)表达及caspase mRNA含量的改变;探讨脑缺血时神经元线粒体应激导致海马继发性损伤的分子机制。方法免疫组化法检测树缺血后不同时间缺血侧海马神经元CytC蛋白表达;低温差速离心分离海马脑组织线粒体和细胞质部分,western blot法检测其CytC的含量变化;实时荧光PCR检测海马组织caspase-3及caspase-9 mRNA。结果光化学诱导树脑缺血后,海马神经元CytC于24h时由线粒体释放入胞质,而caspase-3、caspase-9 mRNA显著升高,caspase-3与caspase-9之间具有相关性。结论光化学诱导树脑缺血后,海马神经元线粒体应激,促凋亡蛋白CytC从线粒体释放入胞质,改变了空间分布,启动caspase级联反应,是脑缺血后海马神经元继发性损伤的病理生理机制之一。     

树鼩脑缺血后海马线粒体应激与神经元损伤机制研究

目的 研究光化学诱导树鼩脑缺血后不同时间海马神经元细胞色素C（Cyt C）表达及caspase mRNA含量的改变;探讨脑缺血时神经元线粒体应激导致海马继发性损伤的分子机制.方法 免疫组化法检测树鼩缺血后不同时间缺血侧海马神经元Cyt C蛋白表达;低温差速离心分离海马脑组织线粒体和细胞质部分,western blot法检测其Cyt C的含量变化;实时荧光PCR检测海马组织caspase-3及caspase-9 mRNA.结果 光化学诱导树鼩脑缺血后,海马神经元Cyt C于24h时由线粒体释放入胞质,而caspase-3、caspase-9 mRNA显著升高,caspase-3与caspase-9之间具有相关性.结论 光化学诱导树鼩脑缺血后,海马神经元线粒体应激,促凋亡蛋白CytC从线粒体释放入胞质,改变了空间分布,启动caspase级联反应,是脑缺血后海马神经元继发性损伤的病理生理机制之一.     

缺血预处理后Fas蛋白表达与迟发性神经元凋亡的关系初步探讨

目的动态观察缺血预处理后大鼠大脑皮层和海马CA1区神经元凋亡与Fas蛋白表达变化情况,初步探讨缺血预处理后Fas蛋白表达与迟发性神经元凋亡的关系。方法四血管阻断法复制全脑缺血模型,动物随机分为非缺血对照组、预处理对照组、缺血预处理组和缺血组。采用尼氏和TUNEL染色法观察皮层及海马CA1区神经元存活数和凋亡细胞数,免疫组化方法检测Fas蛋白在缺血预处理后表达变化情况。结果缺血组缺血6h在皮质及海马CA1区Fas阳性表达细胞计数升高,12h达高峰;缺血预处理组缺血12h阳性细胞计数升高,24h达高峰。缺血组缺血6h出现凋亡细胞,48h凋亡细胞数达到高峰;缺血预处理组凋亡细胞数较缺血组明显减少。缺血组缺血7d神经元数明显减少,12周时神经元大量减少;缺血预处理组缺血7d时神经元数无明显变化,但12周时神经元同样大量减少。结论全脑缺血可能通过诱导Fas蛋白的表达增多,启动细胞凋亡,导致缺血后神经元凋亡的发生;缺血预处理虽可延缓缺血后神经元的凋亡,但无法提供真正的长时期的神经元保护作用,其有限的保护作用可能是通过延缓Fas蛋白的表达而减缓了神经元凋亡的进程。     

α-细辛醚对无镁细胞外液培养海马神经元构建难治性癫痫细胞模型的影响**★

背景：无镁细胞外液处理培养的海马神经元可诱导产生反复自发性癫痫样放电，该模型可作为临床难治性癫痫细胞模型。 目的：探讨难治性癫痫细胞模型中α-细辛醚对神经元的保护作用。 方法：分离培养新生24 h内的SD大鼠海马神经元，取经鉴定的海马神经元，加入含终浓度为7.5，15，30，60，120 mg/L α-细辛醚的维持培养液培养4 h后，换为无镁液建立难治性癫痫细胞模型，3 h后恢复含α-细辛醚的维持培养基继续培养24 h，MTT法检测海马神经元活力。 结果与结论：经无镁细胞外液培养后，海马神经元的活力显著降低(P < 0.01)，α-细辛醚处理后，海马神经元的活力显著升高(P < 0.01)，且随α-细辛醚浓度的增加，海马神经元的相对活力升高。说明α-细辛醚可以抑制难治性癫痫细胞模型中的神经元损伤，发挥神经元保护作用，且具有剂量依赖性。     

GSH对体外培养海马神经元氧应激状态的双相调控作用

目的:探讨还原型谷胱苷肽GSH(glutathione)对海马神经元氧应激状态的影响及可能机制。方法:利用H2O2诱导建立了海马神经细胞氧应激的实验模型,H2O2的剂量为0.1nM.GSH取4个剂量(分别为0.2mM,2mM.20mM,200mM),通过形态学观察、图像分析细胞光密度MOD(matrixopticaldensity)检测添加GSH对海马神经元氧应激的影响,利用DTNB比色法测定氧化型谷胱苷肽GSSG、总GSH(GSH+GSSG)含量及GSSG/GSH比值。结果:GSH组的海马神经元光密度与单纯H2O2组有显著性差异。加入GSH对海马神经元GSSG、GSH含量及比值的影响:较低剂量的GSH可以显著降低H2O2所致的GSSG的升高,而当GSH剂量高于20mM时,GSSG含量与H2O2组无显著性差异。从GSSG/GSH比值上看,较低剂量的GSH可以显著降低GSSG/GSH的比值,而当GSH剂量达到20mM时,GSSG/GSH比值与H2O2组无显著性差异。结论:抗氧化剂GSH对于H2O2诱导的体外培养海马神经元的氧应激状态具有双相作用,即较低剂量GSH可以逆转这种氧应激,而较高剂量则没有表现出明显的逆转作用。     

匹罗卡品诱导癫痫大鼠颞叶中Miro1表达的改变

目的探讨在氯化锂-匹罗卡品诱导的癫痫大鼠中线粒体运动相关蛋白Miro1的表达变化特征。方法用氯化锂-匹罗卡品诱导SD大鼠癫痫模型,之后用Western blot检测癫痫持续状态后1天,3天,7天,14天,30天和60天的癫痫大鼠颞叶皮质中Miro1表达的变化,并通过立体定向注射技术,脑室注射Mitotracker进而进行共聚焦显微镜观察3天,60天颞叶组织切片中Miro1表达的变化。结果 Miro1的表达在急性期显著升高,慢性期显著降低。结论 Miro1在癫痫发作过程中动态的变化提示Miro1在癫痫发生中起到重要的作用。     

瑞香素通过抑制TXNIP/NLRP3信号通路来减轻OGD/R诱导的海马神经元炎症反应和凋亡

目的 探讨瑞香素通过抑制硫氧还蛋白结合蛋白(Thioredoxin-interacting protein,TXNIP)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)信号通路来对氧糖剥夺/复氧(Oxygen-glucose deprivation/Reoxygenation,OOGD/R)诱导的海马神经元炎症反应和凋亡的影响。方法 对体外培养的小鼠海马神经元HT-22做OGD/R处理诱导建立细胞损伤模型,采用细胞计数试剂盒-8(Cell counting Kit-8,CCK-8)实验检测0、5、10、20、40、80 μmol/L的瑞香素对其细胞活力的影响,筛选出最佳作用水平; 将体外培养的HT-22细胞随机分为对照组、模型组、瑞香素(40 μmol/L)组、TXNIP空载(转染TXNIP空载质粒)组、TXNIP过表达(转染TXNIP过表达质粒)组、瑞香素(40 μmol/L)+TXNIP过表达组,以瑞香素和质粒提前处理12 h后进行OGD/R诱导建立细胞损伤模型; 采用二苯甲亚胺、三氯化氢2'-(4-羟基苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2,5'-二-1H-苯并咪唑(2'-(4-Hydroxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-bi-1H-benzimidazole,trihydrochloride,Hoechst)33258染色及流式细胞实验检测各组HT-22细胞凋亡情况; 采用试剂盒检测各组HT-22细胞线粒体膜电位; 应用酶标仪测量各组HT-22细胞肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(Interleukin,IL)-6、IL-1β、IL-18、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)及乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)释放水平; 采用免疫印迹实验检测各组HT-22细胞TXNIP/NLRP3通路蛋白表达水平。结果 选择40μmol/L瑞香素处理OGD/R诱导HT-22细胞进行后续实验; 与对照组比较,模型组HT-22细胞凋亡率、细胞TNF-α,IL-6,IL-1β,IL-18及ROS水平、细胞LDH释放水平、细胞TXNIP,NLRP3及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1(Cysteine-containing aspartate-specific proteases-1,Caspase-1)蛋白表达水平明显升高(P<0.05),线粒体膜电位、细胞SOD及CAT水平明显降低(P<0.05)。分别与模型组、瑞香素+TXNIP过表达组比较,瑞香素组HT-22细胞凋亡率、细胞TNF-α,IL-6,IL-1β,IL-18及ROS水平、细胞LDH释放水平、细胞TXNIP,NLRP3及Caspase-1蛋白表达水平均降低(P<0.05),线粒体膜电位、细胞SOD及CAT水平均升高(P<0.05); TXNIP过表达组HT-22细胞凋亡率、细胞TNF-α,IL-6,IL-1β,IL-18及ROS水平、细胞LDH释放水平、细胞TXNIP,NLRP3及Caspase-1蛋白表达水平均升高(P<0.05),线粒体膜电位、细胞SOD及CAT水平均降低(P<0.05); TXNIP空载组HT-22细胞各指标水平均无明显变化(P>0.05)。结论 瑞香素可通过抑制TXNIP/NLRP3信号通路来降低OGD/R诱导的ROS和炎性因子过量表达,抑制炎症和氧化应激反应,缓解海马神经元线粒体损伤,减轻神经元凋亡。