主动免疫:预防蓖麻毒素、相思子毒素中毒

<正>蓖麻毒素(Ricin toxin,RT)和相思子毒素(Abrin toxin,AT)都属于大分子植物来源的蛋白毒素,属于Ⅱ型核糖体失活蛋白(Ribosome-inactivating proteins,RIP),能够抑制细胞蛋白合成而具有极强的细胞毒性。由于来源广、毒性强等特点,二者均被认为是重要的致死性生物毒素战剂,美国疾病控制中心(CDC)定义为B级生物威胁~([1])。因此,开展对RT和AT的生防疫苗的研究,对提高军队和国家应对生物战和生物恐怖的能力和水平,增强生防能力     

抗AFP抗体—蓖麻毒素A链偶联物对靶细胞AH66的体外杀伤效应

本文应用流式细胞仪(FACStar~(PIns))的荧光分析技术,去检测与比较羊抗大鼠甲胎蛋白抗体(αAFP)与蓖麻毒蛋白A链(RTA)偶联物(αAFP-RTA)、RTA及αAFP和BTA的混和物(αAFP+RTA)对大鼠腹水型肝癌细胞AH66的体外杀伤作用。其αAFP-RTA、RTA和αAFP+RTA的剂量均以RTA的克分子浓度计算,致死50％靶细胞的浓度(IC_(50))分别为6×10~(-9.6)mol/L、6×10~(-8.4)mol/L、6×10~(-8.2)mol/L。αAFP-RTA与RTA的IC_(50)之比为1:12,αAFP-RTA与αAFP+RTA的IC_(50)之比为1∶14。相当于αAFP-RTA中抗体量的αAFP对AH66细胞不显示杀伤作用。实验证明,αAFP-RTA有明显的导向杀伤靶细胞的效应。上述实验结果与以台盼蓝除外试验所获得的结果基本一致。     

蓖麻毒蛋白A链与Ia抗原单抗偶联物对肿瘤细胞的作用

用ε—氨己酰半乳糖胺—琼脂糖和去唾液酰胎儿球蛋白—Sepharose 4B柱层析纯化蓖麻毒蛋白A链,以DE—52离子交换层析法纯化得Ia抗原MAb—HB_(55)5。将二者通过二硫键交联成免疫毒素RTA—HB_(55)。在体外条件下,RTA—HB_(55)对Raji细胞杀伤的IC_(50)为3×10~(-10)M,游离RTA的IC_(50)为10~(-8)M,RTA—HB_(55)对K_(562)细胞的IC_(50)0则为2×10~(-8)M。表明RTA—HB_(55)能选择性地杀伤靶细胞而不杀伤非靶细胞,可望在B淋巴细胞白血病和淋巴瘤的治疗中获得应用。     

HLA-Ⅱ类抗原McAb导向的蓖麻毒蛋白体外细胞毒性的研究

蓖麻毒蛋白是从植物蓖麻籽(Castor beam、Ricinus Communis)中提取的高毒性毒素,它有A、B二链籍一个二硫键相连,B链能与细胞膜表面乳糖残基特异性结合帮助A链进入细胞浆,A链则催化核糖体失活,使蛋白生物合成停止并导致细胞死亡。737是HLA-     

一种新槲寄生蛋白A链的基因克隆及序列分析

目的克隆槲寄生蛋白具有N-糖苷酶活性的毒性A链。方法利用硫酸铵沉淀、亲和色谱和离子交换色谱法,从吉林产槲寄生[Viscum coloratum(Komar．)Nakai]中提取、分离、纯化其中具有半乳糖结合活性的蛋白质成分。采用SDS-PAGE分析纯化的蛋白样品,蛋白条带转印至PVDF膜后,Edman降解法测定肽链的N端序列。由测序结果设计引物,利用RT-PCR方法克隆一种蛋白A链的基因。结果从槲寄生中纯化出两种高毒性的蛋白质新成分CM-1、CM-2,其中CM-1 A链被克隆并测序,其与白果槲寄生蛋白A链的同源性较高。结论一种新槲寄生蛋白A链的基因被成功克隆。     

抗人端粒酶蛋白亚基单域抗体制备和鉴定

目的　研制抗人端粒酶逆转录酶 (hTERT)蛋白亚基单域重组抗体。方法　以重组His taghTERT融合蛋白为抗原免疫小鼠 ,以逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)扩增小鼠脾细胞重链可变区 ;经克隆噬菌粒载体pCANTAB 5E及转染大肠杆菌建立噬菌体抗体展示文库 ,经过亲和性富集选择阳性克隆 ,并于大肠杆菌 (E .coli.HB2 15 1)中表达为可溶性单域抗体 ;Westernblot确定单域抗体结合特性。结果　以RT PCR扩增His taghTERT免疫小鼠脾细胞RNA ,得到 35 0bp小鼠重链可变区DNA片段 ;通过克隆及转染制备出噬菌体展示抗体文库 ,文库大小是 8× 10 4 ;经过抗原 抗体亲和性筛选 ,得到 4个克隆 ,并表达为可溶性单域抗体 (相对分子质量 16 0 0 0 ) ;WesternBlot分析显示 :其中 2个克隆的可溶性单域抗体可特异性结合His taghTERT融合蛋白 (相对分子质量 16 70 0 ) ,与His tag无关 ;与人癌细胞表达的天然hTERT蛋白 (相对分子质量 12 70 0 0 )分析亦显示其特异性结合能力。DNA序列分析证实可溶性单域抗体为小鼠抗体重链可变区VH基因编码。结论　利用噬菌体展示技术已初步制备出小鼠重链可变区编码的抗hTERT蛋白的特异单域抗体 ,为进一步探索其抑制端粒酶活性及抗肿瘤作用奠定了基础。     

重组蓖麻毒素A链的融合表达、纯化及活性研究

目的: 制备有高生物活性的重组蓖麻毒素A链蛋白(RTA)。方法: 在RTA序列的C末端引入KDEL信号肽,克隆到含有硫氧还蛋白(Trx)的融合表达载体pET32a中, 转入大肠杆菌BL21, 在低温 ( 20℃)下用低浓度 ( 0. 4mmol/L)IPTG诱导重组质粒进行表达。表达上清用钴离子亲和层析柱进行纯化, 20~100mmol/L咪唑溶液洗脱目的蛋白。纯化蛋白经SDS- PAGE电泳与Westernblot鉴定后, 对pUC19质粒进行超螺旋dsDNA裂解研究。结果: 每升细菌培养物回收约60mg的纯化蛋白, 纯度大于 90%, Mr约 45 000, 且 3μg纯化蛋白即可以对 1μg超螺旋dsDNA产生明显的裂解活性。结论: 利用pET32a表达系统可以快速获得大量有高生物活性的可溶性RTA- Trx融合蛋白。     

抗蓖麻毒素A链人源化单域抗体的设计、原核表达及生物活性检测

目的 运用计算机辅助蛋白质分子设计的方法设计针对蓖麻毒素A链(RTA)的拮抗肽,实现在大肠杆菌B121中的可溶性表达,并对其生物学活性进行评价.方法 根据RTA的晶体结构、RTA-rRNA相互作用复合物模型,在CVFF(consistent-valence force field)、Amber力场下,对RTA的空间构象进行理论模拟,初步确定其生物活性功能域;然后针对该功能域设计小分子拮抗肽,并借助人抗体重链町变区骨架,在CDR3区对拮抗肽进行展示,用重叠延伸PCR全基因合成人源化的单域抗体并克隆至载体pET-32a(+);双酶切和DNA测序技术对构建的载体进行鉴定;IPrG诱导人源化的单域抗体表达,用镍离子亲和层析纯化,竞争ELISA和MTT法分别进行结合和中和活性检测.结果 从头搭建并设计合成了人源化的单域抗体,实现了其原核表达,并进行了牛物活性检测;建立了基于人源化的单域抗体的RTA和蓖麻毒素检测方法.结论 研究结果为新型蓖麻毒素小分子拮抗剂的研制奠定了理论和实验基础.     

脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的研究进展

脂肪酸结合蛋白( fatty acid binding protein, FABP)是低分子质量胞浆蛋白超家族， 脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty-acid binding protein, A-FABP/ aP2)为该家族成员之一。A-FABP可逆性地结合饱和及不饱和长链脂肪酸，促进脂肪酸的代谢和转运，调控脂类生成及降解。近年来研究表明, A-FABP生物反应在脂类代谢和各种疾病中显示出重要作用，尤其与代谢综合征、动脉粥样硬化关系密切。     

蛇毒F_(6.3.2)激活蛋白C的可能机制初探

本实验研究蛇毒蛋白C激活组份F6.3.2对蛋白C的激活作用。以BaCl2吸附血浆和纯化蛋白C为作用底物,采用发色底物法测定蛇毒组份F6.3.2对蛋白C的特异性激活作用,同时采用SDS-PAGE.测定该组份对蛋白C的激活机制。结果发现F6.3.2没有直接作用发色底物使之生色的能力。它对BaCl2吸附血浆不表现生色反应能力(与对照组相比P>0.05),而对纯化蛋白C则表现出很强的生色反应能力(与对照组Ⅰ、对照组Ⅱ相比P<0.01).SDS-PAGE结果表明,F6.3.2与纯化蛋白C作用后的混合物,由两条链组成,一条链分子量为19KDa,与纯化蛋白C的轻链相同,另一条链分子量为59.5 KDa。为纯化蛋白C重链与F6.3.2的分子量之和,表明F6.3.2已结合到纯化蛋白C的重链上。因此.我们认为蛇毒蛋白C激活组份F6.3.2对蛋白C有特异性激活作用,它激活蛋白C的可能机制是通过结合于蛋白C的重链,形成F6.3.2-蛋白C复合物,引起蛋白C变构,从而将蛋白C激活为活化蛋白C。     

凝血酶的结构及其变构特性

凝血酶(Thrombin,EC3.4.21.5)是一种多功能丝氨酸蛋白水解酶,具有与胰凝乳蛋白酶相似的序列与结构。它含A、B两条多肽链,由一个链间二硫键相连。B链为功能链,具有典型的丝氨酸蛋白水解酶折叠结构,含有1个位于两个β折叠桶之间的活性中心,2个外结合位点(Exosite Ⅰ、Exosite Ⅱ)。1个Na 离子结合位点,一个自我催化水解环(Autolysis Loop)以及一个W60d环(W60dLoop)。凝血酶具有Na 离子诱导的变构酶特性,在血液中有Na 离子结合型和Na 离子解离型两种构象。这两种构象是可以相互转化的。其相互转化的部分机理是由于效应因子或底物结合到凝血酶的特定位点而引起酶构象发生变化和能量转移,从而改变了Na 离子结合与解离的平衡状态。     

乙型肝炎病毒正链转录及调节的研究进展

乙型肝炎病毒正链转录体(HBV asRNA),通过与HBV负链转录产生的mRNA互补结合成双链RNA(dsRNA),在核内或胞质中下调病毒的转录与表达,是病毒复制表达的重要自身调节分子。HBV通过抑制正链的转录,保护负链的转录产物作为逆转录及翻译相应病毒蛋白的模板,促进自身的复制与表达。因此,研究HBV正链的转录与调节,能深入对HBV分子病毒学机制的探索,为今后的抗病毒治疗提供新的思路。     

海南地区Zeta链蛋白检测在东南亚型α-地中海贫血筛查中的应用价值

目的以α地中海贫血基因检测结果为标准，探讨Zeta链蛋白检测在α地中海贫血东南亚缺失型临床筛查中的应用价值。方法随机收集634例EDTA—K2抗凝全血标本，采用酶联免疫法检测人外周血细胞中Zeta链蛋白，同时提取全血DNA，采用多重PCR结合电泳法检测标本α地中海贫血基因。结果634例全血标本经酶联免疫法检测Zeta链蛋白阳性113例。阴性521例；Zeta链蛋白阳性标本中经基因检测全部确诊为α地中海贫血东南亚缺失型，阴性中无α地中海贫血东南亚缺失型。Zeta链蛋白检测α地中海贫血东南亚缺失型灵敏度为100％，特异度为100％，假阳性率0％。假阴性率0％，阳性试验的预示值100％，阴性试验的预示值100％。结论酶联免疫法检测Zeta链蛋白是一种简便、快速检测α地中海贫血东南亚缺失型的方法，可用于临床大规模筛查。     

Aβ和tau蛋白在AD发病机制中的作用

Aβ和tau蛋白是阿尔茨海默病(AD)的标志性物质。尽管Aβ和tau蛋白其各自的毒性作用早已受到普遍关注,但新近的研究发现Aβ和tau蛋白存在相互协同作用。这一新的发现使我们对tau蛋白在Aβ发病机制中的作用的认识从轴突(tau蛋白在此处作为一种微管结合蛋白发挥着重要作用)转移到树突(tau蛋白在此处介导Aβ的毒性作用)。(1)Aβ对突触的毒性作用:人们普遍认为突触后成分是毒性物作用的靶点,可能为单一受体也可能为多受体介导,Aβ在不同条件下可以结合不同受体,不同的受体介导不同的的毒性作用(如NMDARs介导兴奋毒性及Aβ诱导的脊神经丢失,而mGluRs介导Aβ诱导的长时程抑制)。(2)树突处发现少许tau蛋白:Tau蛋白主要存在于轴突,但新近通过增强免疫组化法证实生理条件下树突也存在少许tau蛋白,这种存在依赖于MTB,截断的tau蛋白缺乏MTB重复序列,不能与微管结合,从而不能到达树突。树突处     

免疫毒素的临床应用及发展趋势

免疫毒素一般是指抗体与毒性蛋白的交联物。以前常用的毒性蛋白来自细菌或植物毒素,例如白喉毒素(DT)、蓖麻毒素(Ricin),假单胞杆菌外毒素(PE)等。近年来基因重组的细胞因子大量出现,其中有些具有明显的细胞毒性,例如肿瘤坏死因子(TNF)等。这些细胞因子也可以作为毒性蛋白与抗体交联。本文简述当前免疫毒     

靶向人c-Met蛋白单链抗体的制备及其对肺腺癌A549细胞的杀伤作用

目的制备并纯化出靶向细胞间质上皮转化因子(c-Met)蛋白的人源单链抗体(scFv),鉴定其靶向c-Met蛋白的特性及其对肺腺癌细胞的作用。方法将scFv基因插入至p Fuse载体构建真核表达载体,表达融合鼠源Fc段的融合蛋白Met-scFv,经AKTA蛋白纯化系统纯化;将纯化的Met-scFv进行功能性检测:ELISA检测Met-scFv亲和力;流式细胞术和免疫荧光细胞化学染色检测Met-scFv识别并结合肺腺癌细胞的特性;CCK-8法检测Met-scFv对细胞增殖的影响;通过补体依赖的细胞毒性(CDC)、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC),用乳酸脱氢酶(LDH)释放试剂盒检测Met-scFv对靶细胞A549细胞的毒性影响。结果 ELISA结果提示,Met-scFv与c-Met呈量效关系;流式细胞术和免疫荧光细胞化学染色实验结果提示,与对照组相比,Met-scFv组信号呈阳性,提示Met-scFv与A549细胞特异性结合;Met-scFv抑制A549细胞增殖并产生细胞毒性,且毒性大小与Met-scFv剂量呈正相关。结论制备出靶向c-Met蛋白的Met-scFv,并可在体外识别并介导杀伤A549细胞。     

2型糖尿病中国地鼠模型构建与小檗碱对肝脏过氧化物酶体增殖体激活受体及其靶基因表达的影响

背景：研究表明小檗碱可用于治疗2型糖尿病,但小檗碱治疗糖尿病胰岛素抵抗尤其是肝脏脂诱性胰岛素抵抗的分子机制仍不明确。 目的：观察小檗碱对2型糖尿病中国地鼠模型肝脏过氧化物酶体增殖体激活受体及其靶基因表达的影响。 方法：以高脂饮食及结合小剂量链脲菌素的方法建立胰岛素抵抗和2型糖尿病中国地鼠模型。建模后随机分成4组：对照组给予普通饮食,胰岛素抵抗组给予高脂饮食,2型糖尿病组给予高脂饮食+小剂量链脲菌素,2型糖尿病小檗碱治疗组给予高脂饮食+小剂量链脲菌素+小檗碱,治疗9周。 结果与结论：实时定量PCR结果显示与对照组相比,胰岛素抵抗及2型糖尿病组地鼠肝脏过氧化物酶体增殖体激活受体α,β/d,酰基辅酶A氧化酶,肉碱棕榈酰转移酶1和中链酰基辅酶A脱氢酶的表达降低(P < 0.05),而固醇调节元件结合蛋白1c,2,过氧化物酶体增殖体激活受体γ,脂蛋白脂酶,脂肪酸转运者(FAT/CD36)和脂肪酸结合蛋白(ap2)的表达增加(P < 0.05)。结果证实,小檗碱可改善胰岛素抵抗,并逆转了氧化物酶体增殖体激活的受体及其靶基因表达的改变,小檗碱治疗2型糖尿病地鼠脂诱性胰岛素抵抗的分子机制与氧化物酶体增殖体激活的受体及其靶基因表达的改变相关。     

全人源性肝癌单链抗体的表达、纯化及功能鉴定

目的:在大肠杆菌中表达人源性肝癌单链抗体(scFv),并分析他的结合活性。方法:应用噬菌体表面呈现技术获得人源性肝癌scFv,利用重叠延伸PCR将VL和VH基因以(Gly4ser)3linker连接成单链,插入表达载体pET28a( ),诱导目的蛋白表达,对包涵体进行溶解、复性、纯化,得到可溶性目的蛋白,应用非竞争细胞ELISA检测与肝癌细胞结合的特异性及结合能力。结果:在A600为0.8时开始诱导,持续6h,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的26%,包涵体经过复性纯化后,得到纯度达到95%的重组scFv,其亲和常数为:3.6×107mol/L。结论:实现了人源性肝癌scFv的蛋白表达,抗体蛋白与肝癌细胞具有较强的特异性结合能力,为今后进行免疫学检测和开发肿瘤靶向治疗提供了研究手段。     

MALToma Ig重链蛋白、IgH基因重排/断裂检测的临床意义

目的探讨Ig重链蛋白、IgH基因重排/断裂在黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma,MALToma)诊断中的应用价值。方法选取40例MALToma作为实验组,15例反应性淋巴组织增生(reactive lymphoid hyperplasia,RLH)作为对照组,应用免疫组化、PCR、FISH技术分别检测两组中Ig重链蛋白、IgH基因重排、IgH基因断裂情况。结果(1) Ig重链蛋白表达根据免疫组化结果可分为三种模式:单种Ig重链蛋白表达(模式Ⅰ)、Ig重链蛋白全阴性(模式Ⅱ)、多种Ig重链蛋白表达(模式Ⅲ)。实验组模式Ⅰ/Ⅱ的阳性率(87. 5%)显著高于对照组(0)(P 0. 01)。(2)实验组IgH基因重排、IgH基因断裂的阳性率分别为72. 5%(29/40)、32. 5%(13/40),而对照组未检出IgH基因重排、IgH基因断裂(P 0. 01,P 0. 05)。(3) Ig重链蛋白模式Ⅰ/Ⅱ和IgH基因重排联合检测以及Ig重链蛋白模式Ⅰ/Ⅱ、IgH基因重排和IgH基因断裂联合检测的阳性率均高达97. 5%。(4)在Ig重链蛋白模式Ⅱ中,有9例检出IgH基因断裂(90%);在模式Ⅰ/Ⅲ中,仅有4例检出IgH基因断裂(13. 3%),两组相比差异有统计学意义(P 0. 01)。Ig重链蛋白表达和IgH基因断裂呈正相关(rs=0. 323,P0. 05)。结论联合检测Ig重链蛋白表达模式和IgH基因重排可有效辅助鉴别MALToma和RLH; IgH基因断裂可能与Ig重链蛋白表达缺失高度相关。     

抗人精浆蛋白单抗κ链基因的克隆及其在HeLa细胞的表达

目的 获得鼠抗人精浆蛋白单抗（mAb)κ链基因，并将其转染到HeLa细胞进行表达。方法 从分泌抗人精浆蛋白mAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA，用RT－PCR法获取κ链cDNA。将其克隆入真核表达载体pcDNA3，用脂质体转染法转染HeLa细胞，并用免疫荧光染色法检测κ链的表达。结果从分泌抗人精浆蛋白的鼠mAb杂交瘤细胞系E4B7中克隆了κ链基因。序列测定表明，Vκ属于鼠免疫球蛋白XⅢ家族。以含κ链基因的真核表达载体pcDNA3-E4B7κ转染HeLa细胞后，在HeLa细胞中检测到了κ链的表达。结论 获得了序列正确的κ链基因，并在HeLa细胞中成功地表达，为进一步构建和表达Fab段打下了良好基础。