SOX12、CDK4在肝细胞中的表达及意义

目的观察SOX12、CDK4在肝癌细胞(HepG2)与正常肝细胞(HB611)中的表达情况,分析SOX12与肝细胞癌的关系。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HepG2、HB611细胞中SOX12 mRNA、CDK4 mRNA的表达水平,采用Western blot法检测HepG2、HB611细胞中SOX12蛋白、CDK4蛋白的表达水平,采用基因抑制剂shRNA抑制两种细胞中的SOX12基因,采用RT-PCR法检测两种细胞中SOX12 mRNA与CDK4 mRNA的表达情况,分析SOX12与肝细胞癌的关系。结果 SOX12 mRNA在HepG2细胞中表达水平高于HB611细胞,CDK4 mRNA在HepG2细胞中表达水平低于HB611细胞,差异有统计学意义(均P<0.05)。两种细胞中SOX12蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05),CDK4蛋白在HB611细胞中的表达水平高于HepG2细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。抑制SOX12基因后,两种细胞SOX12 mRNA的表达水平较抑制前降低,CDK4 mRNA表达水平也较抑制前降低,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论 SOX12与CDK4在HepG2、HB611细胞中均有表达,在两种细胞中SOX12 mRNA、CDK4 mRNA的表达水平存在差异,SOX12蛋白表达水平相近,CDK4蛋白表达水平存在差异。SOX12可能通过影响CDK4的表达参与肝细胞癌的发展进程,可能成为治疗与预测肝细胞癌预后新的标志物。     

乙型肝炎病毒调节Pasha启动子活性的初步研究

目的：研究乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）对microRNA形成相关因子Pasha表达的调控,并对其作用机制进行初步探讨。方法：用RT-PCR,Western blot的方法检测HepG2细胞及稳定表达HBV的HepG2-H7细胞中Pasha的表达差异。构建Pasha启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒,分别转染HepG2细胞及HepG2-H7细胞,检测HBV对Pasha启动子的影响。将Pasha启动子质粒与HBV 4种蛋白的真核表达质粒共转染HepG2细胞,寻找对启动子影响较大的HBV蛋白。结果：RT-PCR和 Western blot的结果显示Pasha在HepG2-H7细胞中的表达较HepG2细胞明显下降。萤火虫荧光素酶活性分析显示HBV能抑制Pasha启动子的活性,且HBx和HBs蛋白对其影响较大。结论：HBV蛋白可以通过抑制Pasha启动子活性调节其在HepG2-H7细胞中的表达。     

HBV对HepG2.2.15细胞α干扰素的JAK-STAT信号转导途径分子及MxA mRNA表达的影响

目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)对α干扰素(IFN-α)JAK-STAT信号转导途径分子及MxA mRNA表达的影响.方法 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测IFN-α处理的HepG2.2.15细胞在不同处理时间点的STAT1、STAT2、IS-GF3γ mRNA表达水平,并比较分析干扰素抗病毒蛋白MxAmRNA在HepG2和HepG2.2.15细胞中的表达.结果 RTPCR显示经IFN-α处理后HepG2.2.15细胞STAT1、STAT2、ISGF3γ mRNA表达水平明显升高,表明转染HBV全基因组并能分泌完整HBV病毒子的HepG2.2.15对IFN-α有应答.抗病毒蛋白MxA mRNA在HepG2.2.15细胞中未检测到表达,而在HepG2细胞中却能表达.结论 HBV或其抗原成分并不影响IFN-α JAK-STAT信号转导途径分子mRNA表达,但影响抗病毒蛋白如MxA mRNA的表达.     

HBV对肝癌细胞中AKR1C1基因表达的影响

目的研究HBV对肝癌细胞中AKR1C1基因表达的影响,并对其作用机制进行初步的探讨。方法RT-PCR和Real-time PCR检测HepG2.2.15和HepG2细胞中AKR1C1基因的差异表达情况;构建AKR1C1基因启动子虫荧光素酶报告质粒,并分别与HBV、HBx、HBs、HBp、HBc的表达质粒共转染HepG2细胞,双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶活性。结果AKR1C1基因在HepG2.2.15细胞中的表达高于HepG2细胞1.5倍;在HBV表达质粒与AKR1C1基因启动子虫荧光素酶报告质粒共转染的HepG2细胞中,虫荧光素酶的活性明显增强,为对照组3.37倍;相对HBs、HBp、HBc,HBx升高虫荧光素酶的活性的作用最强。结论HBV可以增强AKR1C1基因启动子的转录活性,促进AKR1C1在肝癌细胞中的表达,HBx在这一转录激活当中发挥重要作用。     

siRNA沉默HBx基因对肝癌细胞YKL-40蛋白表达影响的研究

目的 观察HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒X(HBx)基因沉默对酿酒酵母YKL-40蛋白表达的影响.方法 构建靶向HBx基因的siRNA真核表达载体pRNAT-HBx和阴性对照质粒,同时设空白对照组,采用Lipofectinamine 2000脂质体转染法转染人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞.采用RT-PCR检测各组中HBx和YKL-40的mRNA水平,Western blot、细胞免疫荧光检测各组中HBx蛋白和YKL-40蛋白的表达.结果 pRNAT-HBx明显抑制HepG2.2.15细胞中HBx基因的表达,同时YKL-40的mRNA和细胞内蛋白表达水平也随之相应下调.结论 抑制HBx基因的表达能下调HepG2.2.15细胞中YKL-40蛋白的表达,提示HBx蛋白对YKL-40蛋白的表达具有一定的激活作用.     

siRNA抑制乙型肝炎病毒在HepG2.2.15细胞中的复制与表达

目的 探讨靶向HBV S基因的siRNA表达质粒在HepG2.2.15细胞中对HBV病毒的复制与表达的抑制效应及其抗病毒活性.方法 设计并构建了两个靶向HBV S基因的siRNA表达质粒S1和S2,随机设计的用于对照的非同源siRNA表达质粒S3.首先在HepG2.2.15细胞中通过实时荧光定量PCR评估该siRNA表达质粒对HBV mRNA表达的抑制效应,接着在HepG2.2.15细胞中通过ELISA方法进一步枪测它们的抗病毒活性细胞上清液中HBV标志性蛋白HBsAg、HBeAg的表达水平.结果 在siRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞后48 h,HBV S基因mRNA表达量下降64%～88%,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了60%～82%和56%～78%.S1+S2联合使用转染细胞中显著抑制HBV病毒的复制与表达的效率,而对照组S3无抑制效果.结论 发现靶向HBV S基因的siRNA表达质粒能够在HepG2.2.15细胞中有效的抑制HBV病毒的复制与表达,并能够降低细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平.S1+S2联合使用转染细胞中可以显著抑制HBV的复制与表达的效率.RNAi可能成为防治HBV感染有效的全新的抗病毒防御策略.     

HBV通过下调PTEN的表达拮抗IFN-α抗病毒活性

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)感染所致的第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)下调与α-干扰素(IFN-α)抗病毒活性的相关机制。方法 在适宜条件下培养HepG2细胞和HepG2.2.15细胞,以空白载体(pcDNA3.1)和HBV1.3质粒分别转染HepG2细胞,Western blot法检测PTEN蛋白质的表达;将pcDNA3.1和PTEN过表达(PTEN-OE)质粒分别瞬时转染HepG2.2.15细胞,化学发光法分析细胞培养上清液中HBV相关抗原的表达,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析HBV前基因组RNA(HBV pgRNA)表达;使用合成RNA双链体poly(I∶C)刺激PTEN-OE的细胞,qRT-PCR技术分析IFN-αmRNA的表达,Western blot法分析JAK/STAT信号通路中干扰素调节因子9(IRF9)、黏病毒抗性蛋白1(MxA)的表达。结果 瞬时表达HBV的HepG2细胞和稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞中,PTEN蛋白的表达降低;PTEN-OE的HepG2.2.15细胞中,HBV相关抗原及HBV pgRNA的表达...     

HBX在肝癌细胞中通过下调miR-199a增强AKT的表达

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBX)调节miR-199a的表达在HBV相关性肝癌发生中的分子机制.方法 重组HBX腺病毒(Ad-HBX)感染人肝癌HepG2细胞,HBX的siRNA转染稳定表达HBV基因的人肝癌HepG2.2.15细胞,荧光定量PCR方法检测HBV相关性肝癌组织标本和肝癌细胞中HBX、miR-199a、AKT的mRNA表达水平及运用Western blot检测肝癌组织标本和肝癌细胞中HBX、AKT的蛋白表达水平;分别用miR-199a mimics和miR-199a inhibitor的转染肝癌细胞后,荧光定量PCR方法检测肝癌细胞中AKT的mRNA表达水平及运用Westem blot检测肝癌细胞中AKT的蛋白表达水平.结果 miR-199a在HepG2.2.15细胞中表达水平显著低于HepG2细胞,并且证实其表达下调受到了HBX的调控(P＜0.05),HepG2.2.15细胞中AKT表达水平显著高于HepG2细胞(P＜0.05),在HepG2.2.15细胞中过表达miR-199a能明显下调AKT表达水平以及在HepG2细胞中抑制miR-199a能明显上调的AKT表达水平(P＜0.05),此外,miR-199a的表达量在HBV相关性肝癌组织比相应的癌旁组织表达降低.结论 HBX可以通过miR-199a调节AKT导致HBV相关性肝癌发生.     

HBV对肝癌细胞中MIA2表达的影响

目的探讨黑色素瘤抑制蛋白2(MIA2)在肝癌细胞中的表达水平与乙型肝炎病毒(HBV)感染状态的关系。方法培养人肝癌细胞株HepG2和持续表达乙肝病毒的人肝癌细胞株HepG2.2.15,采用细胞免疫组织化学和蛋白免疫印迹检测(Western blotting)2种细胞株中MIA2蛋白表达水平差异。结果 MIA2蛋白在HepG2.2.15细胞株中的表达水平较HepG2细胞株减低,差异有统计学意义。结论 MIA2蛋白在HBV阳性肝癌细胞中表达水平减低,提示HBV感染可能通过抑制MIA2的表达导致肝癌发生。     

丙肝病毒核心蛋白抑制乙肝病毒转录与复制的实验研究

目的观察丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV core)对乙型肝炎病毒(HBV)基因转录和病毒复制的影响。方法将不同剂量的HCVcore表达质粒(pNKF-HC Vcore)转染HepG2.2.15细胞。以空载质粒(pNKF)转染HepG2.2.15细胞作为阳性对照,转染HepG2细胞作为阴性对照。以Northern吸印杂交检测HBV mRNA的转录水平,以Southern吸印杂交检测HBV复制中间体DNA的复制水平。结果20μg pNKF-HCV core转染HepG2.2.15细胞后,可使细胞中HBV mRNA转录水平及HBV复制中间体DNA复制水平明显降低,抑制率分别为51.9%及36.5%。10μg及15μg pNKF-HCV core较pNKF转染的HepG2.2.15细胞的HBV mRNA信号与HBV复制中间体DNA检出信号强度无显著差异。结论HCV核心蛋白达到一定的剂量后能够在一定程度上抑制HBV的转录与复制。     

靶向La的外源性microRNA抑制HBV复制和表达的实验研究

目的 设计并构建靶向La的microRNA表达载体,观察其对La基因的抑制作用,探讨其在HBV感染基因治疗中的应用价值.方法 以La为靶基因,设计并构建3个针对La不同位点的microRNA表达载体,通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR和Western blot检测其对La mRNA和蛋白的抑制作用...     

利用纳米和RNA干扰技术抑制HBV-DNA 在HepG2 2.2.15细胞中的复制和表达

目的：通过RNA干扰和纳米技术抑制HBV-DNA在体外的复制和HBV核心抗原的表达。方法：制备靶向HBV核心抗原（HBcAg）的纳米小干扰RNA（siRNA）,利用U6启动子质粒转染入HepG2 2.2.15细胞;RT-PCR和Western印迹检测转染细胞HBV核心抗原在mRNA和蛋白水平的表达情况;real-time PCR 检测上清液HBV-DNA,放射免疫法检测细胞HBV表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）、核心抗原（HBcAg）。结果：成功构建了含磁性纳米的siRNA质粒;多种方法检测均显示转染后的细胞HBV核心抗原表达明显下降;其表面抗原、e抗原和HBV-DNA值均较对照组降低。结论：RNA干扰联合纳米技术可明显下调HBV核心抗原的表达,抑制HBV-DNA复制。     

小干扰RNA分子对乙肝病毒复制的抑制作用研究

目的 筛选特异高效抗乙型肝炎病毒(HBV)的小干扰RNA分子(siRNA),评价其干扰效果.方法 在HepG2.2.15细胞内导入筛选的3条特异抗HBV的siRNA分子,用实时荧光定量RT-PCR的方法,检测干扰后HBV的mRNA表达水平;Western blot检测细胞上清中乙肝表面抗原(HBsAg),分析siRNA对HBV基因表达的抑制作用.结果 导入特异siRNA分子细胞中HBV的mRNA表达量明显降低(P＜0.05),上清中HBsAg含量显著减少.阴性对照细胞中HBV的mRNA含量和上清中HBsAg含量基本不变(P＞0.05).结论 所筛选的siRNA分子能特异性抑制HBV的mRNA和蛋白的合成.     

乙型肝炎病毒蛋白诱导白细胞介素32表达情况的研究

目的  探讨乙型肝炎病毒蛋白诱导白细胞介素32（IL-32）的表达以及临床意义。方法  用Lipofectamine 2000 TM介导转染HepG2细胞。转染48 h后,采用聚合酶链反应（RT-PCR）,蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测HepG2细胞中IL-32的mRNA及蛋白的表达量。结果  RT-PCR结果显示转染HBV的HepG2细胞中IL-32 mRNA的表达量比转染空载体（未转染）的细胞中IL-32 mRNA高2.3倍;Western blot结果显示与空载体转染的HepG2细胞比较,转染pIRES2-HBV-EGFP的HepG2细胞中IL-32蛋白质表达增高,且差异有统计学意义（P <0.05）。结论  HBV促进IL-32蛋白的表达,从而证实乙型肝炎的严重程度与IL-32的表达有关。

     

APOBEC3G真核表达载体构建及抗HBV复制的初步研究

目的构建人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G（APOBEC3G）真核表达载体,并探讨其抗乙型肝炎病毒（HBV）复制的作用。方法采用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因编码区片段,构建pcDNA3.1-A3G真核表达载体,利用脂质体转染法将pcDNA3.1-A3G转染HepG2.2.15细胞,分别于转染后第24、48、72 h收集细胞培养上清液和细胞总蛋白,Western blot检测HBx蛋白表达情况,ELISA法检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg表达情况。结果测序结果显示pcDNA3.1-A3G真核表达载体中APOBEC3G编码区序列存在1处碱基同义突变;HepG2.2.15细胞经APOBEC3G蛋白干扰后,HBx、HBsAg和HBeAg表达量逐渐降低,于72h表达量显著降低。结论成功构建了APOBEC3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G;APOBEC3G在体外可以抑制HBV复制,为深入研究APOBEC3G作为抗HBV药物提供了实验基础。     

乙型肝炎病毒对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体诱导凋亡的影响及其机制

目的：研究乙型肝炎病毒（HBV）转染后,细胞对肿瘤坏死因子（TNF）相关的凋亡诱导配体（TRAIL）诱导 的凋亡的敏感度变化及作用机制。通过人肝癌细胞HepG2及转染了HPV全基因组的HepG2.2.15细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感度研究,探讨HBV感染对细胞凋亡的影响及其机制。方法：流式细胞仪检测TRAIL诱导的凋亡反应和细胞表面TRAIL蛋白的表达,酶联免疫吸附试验检测细胞培养上清液中分泌型TRAIL蛋白质的表达,半定量逆转录聚合酶链反应检测TRAIL受体和其转导通路中凋亡拮抗分子FLIP的表达。结果：HepG2和HepG2．2．15对TRAIL诱导的凋亡率分别为51．60％和9．12％。与HepG2相比,HepG2．2．15细胞表面TRAIL蛋白质及其受体的表达都有不同程度的下调,而抵抗细胞凋亡的分子－FLI的表达却显著上调（P＜0．01）,两细胞系上清中分泌型TRAIL的表达量差异无显著意义（P＞0．05）。结论：HBV转染可以抵抗TRAIL诱导的细胞凋亡,可以下调细胞表面TRAIL蛋白质及其受体的表达,但使FLIP的表达显著上调。这能从一定程度上解释HBV感染逃逸机体免疫监视,持续存活,导致相应病理变化的机制。     

金丝桃素抗乙型肝炎病毒作用及机制的体外研究

目的：从细胞水平评价金丝桃素（HY）的抗乙型肝炎作用,并初步探寻其药物作用靶点。方法选择可分泌乙型肝炎病毒的肝细胞株 HepG2．2．15为实验对象,HY 为 HY 组,拉米夫定（3TC）为3TC 组,去离子水为空白对照组,对细胞进行分组给药。给药72 h 后,采用 Southern 印记杂交及荧光定量 PCR 检测病毒 HBV-DNA 的复制水平;ELISA 检测 HBV 表面抗原（HBsAg）和 HBVe 抗原（HBeAg）的抑制率;采用 Northern blot 与荧光定量 PCR 检测 pgRNA 的表达水平;Western blot 及荧光定量 PCR 检测调控因子肝细胞核因子3（HNF3β）、肝细胞核因子4（HNF4α）、过氧化物酶体增殖激活受体／视黄受 X 受体（PPARα／RXRα）的表达水平。结果与空白对照组相比,HY 组与3TC 组对 HepG2．2．15细胞中的 HBV DNA 及 HBsAg、HBeAg 的表达有明显抑制作用（P ＜0．05）。与空白对照组相比,HY 可显著减少 pgRNA 的表达（P ＜0．05）,而3TC 无明显变化（P ＞0．05）。与空白对照组和3TC 组相比,HY 对调控因子 HNF3β与 HNF4α的表达有显著影响（P ＜0．05）,但对 PPARα和PXRα的表达无影响（P ＞0．05）。结论 HY 具有强效抗乙型肝炎病毒作用,且其可使负向调控因子 HNF3β的表达升高并降低正向调控因子 HNF4α的表达。提示其药物作用靶点可能为 pgRNA。     

姜黄素抑制多药耐药肝癌细胞HepG2/ADM的增殖及其机制研究

目的 观察姜黄素对多药耐药(MDR)的肝癌细胞株HepG2/ADM细胞增殖的抑制作用及其机制.方法 制备、培养HepG2/ADM细胞,然后用不同浓度的姜黄素(5、10、20、40 mol/L)处理该细胞24、48、72 h.采用CCK-8试剂检测姜黄索对HepG2/ADM细胞的增殖活力的影响.流式细胞仪检测细胞内罗丹明123(R-123)的浓度和阿霉素(ADM)的浓度;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组细胞内mdr-1 mRNA的水平变化;用Western blot检测细胞内p-糖蛋白(pgp)水平的变化.结果 与空白对照组和DMSO组相比,姜黄素对HepG2/ADM细胞增殖的抑制作用更加明显(P＜0.05);更能够明显抑制细胞内Rh123的外排(P＜0.05);RT-PCR和Western blot结果分别显示,姜黄素对HepG2/ADM细胞内的mdr-1 mRNA和P-gp水平更有明显的降低(P＜0.05),且呈浓度-时间依赖性(P＜0.05).结论 姜黄素可以显著抑制多药耐药HepG2/ADM细胞的增殖,其机制可能与抑制和MDR密切相关的mdr-1基因及其编码的P-gp水平有关.