生防菌对黄瓜枯萎病防效及其对黄瓜诱导抗性测定

为确定生防菌对黄瓜枯萎病的防效及其对黄瓜诱导抗性,采用生物测定方法,测定了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌剂、粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)菌剂、棘孢木霉(Trichodema asperellum)及嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)对黄瓜枯萎病的防治效果及黄瓜叶片几种防御酶活性的影响。结果表明:经棘孢木霉菌对黄瓜枯萎病的防治效果达到70.24%。生防菌剂处理后的黄瓜叶片中4种防御酶的活性变化呈现一定的规律:经粉红粘帚霉、枯草芽孢杆菌和棘孢木霉处理的黄瓜叶片POD活性是空白对照的1.26倍、1.11倍和1.40倍;经嗜麦芽寡养单胞菌和棘孢木霉处理的黄瓜叶片SOD活性分别是空白对照的3.92倍和2.66倍;经粉红粘帚霉、枯草芽孢杆菌、棘孢木霉和嗜麦芽寡养单胞菌4种生防菌处理的黄瓜叶片PAL活性分别仅为空白对照处理的43.01%,69.11%,33.81%,34.70%;经枯草芽孢杆菌、粉红粘帚霉、棘孢木霉和嗜麦芽寡养单胞菌4种生防菌处理的黄瓜叶片CAT活性分别是空白对照的1.04倍、1.88倍、1.07倍和1.07倍。说明黄瓜经生防菌诱导处理后的一部分防御酶活性会升高。     

地衣芽孢杆菌TG116诱导黄瓜抗病性相关防御酶系的研究

为了探讨地衣芽孢杆菌TG116诱导黄瓜抗病性机理,研究其对黄瓜叶片防御酶活性的影响.采用比色法测定了地衣芽孢杆菌TG116诱导黄瓜根部后对叶片中多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等3种防御酶活性及丙二醛(MDA)含量的影响.结果显示,经地衣芽孢杆菌TG116灌根处理后,黄瓜叶片中的POD、PPO、PAL等防御酶类活性升高,MDA含量略有下降并达到新的平衡;经黄瓜枯萎病病原菌灌根处理后,黄瓜叶片中的POD、PPO、PAL等防御酶活性及MDA含量迅速上升;尤其同时接种TG116和黄瓜枯萎病病原菌后,3种防御酶类活性上升的幅度比单独接种要高,同时黄瓜叶片中MDA含量比单独接种黄瓜枯萎病病原菌有所降低,减轻植株细胞膜脂过氧化损伤.研究表明,地衣芽孢杆菌TG116在一定程度上能够诱导黄瓜的系统抗病性.     

生防菌YN201490在黄瓜植株体内的定殖能力及防病机制的初步研究

为研究枯草芽孢杆菌YN201490在黄瓜体内的定殖能力及防病机制,采用平板对峙试验的方法测试该菌株对不同病原菌的抑制作用,利用灌根的方法研究其在黄瓜体内的定殖能力,并通过抑制孢子萌发对其发酵液进行了初步分离与活性检测.研究通过平板对峙试验证明了枯草芽孢杆菌YN201490对小麦雪腐病菌、番茄枯萎病菌、烟草赤星病菌、玉米拟轮枝镰孢菌、茶轮斑病菌和水稻叶鞘腐败病菌有很好的抑菌活性.用自然转化法以GFP标记,获得了荧光标记菌株YN90-P43GFPmut3a.通过灌根法,证明该菌株能在黄瓜植株体内定殖,其数量分布为根叶茎. YN201490发酵液的正丁醇萃取物能裂解小麦雪腐病菌孢子,使胞质外流,抑制91.72%孢子萌发,对黄瓜白粉病的预防效果达66.26%,并能诱导黄瓜产生明显抗性.研究结果表明枯草芽孢杆菌YN201490对多种病原真菌具有明显的抑制作用,并能够在黄瓜体内稳定定殖,具有作为生物菌剂开发利用的潜能.     

4株菌根辅助细菌对苗木猝倒病菌的抑制作用

菌根辅助细菌（MHB）对植物具有促生作用,为探讨MHB对土传病原真菌的生防功能,采用离体平板对峙和活体接种的方法测定了4株MHB对土传病原真菌的抑制作用。结果表明：在离体平板对峙测定中,蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）HB12、HB59菌株和短小芽孢杆菌（B. pumilus）HR10菌株对苗木猝倒病病原丝核菌（Rhizoctonia sp.）有较为明显的抑制作用,其中短小芽孢杆菌HR10对丝核菌的抑制作用最强,抑菌率达85.58 %;蜡状芽孢杆菌HB12和HB59、短小芽孢杆菌HR10、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）HR15对苗木猝倒病病原尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）均无抑制作用。将筛选获得的短小芽孢杆菌HR10进行活体松苗接种,结果显示,经HR10菌株处理后的黑松苗木其猝倒病的发病率仅为15 %,病死率也低至10 %,而单接种病原丝核菌的对照黑松苗木的发病率则高达80 %,病死率为65 %。说明菌根辅助细菌（MHB）除对植物具有促生作用外,对某些植物土传病害也具有一定的抑制作用。     

枯草芽孢杆菌启动子的克隆及功能验证

以pHT01穿梭质粒为骨架,构建以卡那霉素抗性基因为报告基因的启动子探针载体pHT-kan.利用该探针载体在大肠杆菌中克隆枯草芽孢杆菌168的启动子活性片段,挑取得到100个重组子.通过卡那霉素浓度梯度筛选出2个抗性最强的片段进行序列测定和分析,将启动子片段命名为BSP25、BSP31.将抗性最高的两个载体转入枯草芽孢杆菌168菌株,结果表明,它们可以在枯草芽孢杆菌中启动卡那霉素抗性基因的表达,重组菌株表现出卡那霉素抗性.     

发酵海带对刺参生长和免疫及消化生理的影响

对枯草芽孢杆菌发酵海带的条件进行优化,并以此发酵海带饲养刺参,结果表明,枯草芽孢杆菌发酵海带的优化条件为发酵温度30 ℃、适宜发酵时间96 h、接种剂量12%,发酵后海带的粗蛋白含量为14.65%,相对提高了15.17%。在36 d饲养时间内,实验组在刺参的配合饲料中添加了30%的发酵海带,刺参特定生长率、溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性、酸性磷酸酶活性、蛋白酶活性和淀粉酶活性皆有显著提高（P<0.05）,但是,刺参体腔液细胞数量、纤维素酶活性皆无显著变化（P>0.05）,此外,刺参摄食发酵海带还导致其消化道异养菌总数减少、弧菌相对数量降低、芽孢杆菌相对数量升高。由此可见,投饲枯草芽孢杆菌发酵海带能够促进刺参生长,提高消化酶活性和免疫力,调节肠道菌群结构。     

绿色荧光蛋白基因转化内生解淀粉芽孢杆菌的研究

通过重叠延申法将枯草芽孢杆菌的启动子PSJ2与绿色荧光蛋白基因（gfp）的ORF连接起来,构建绿色荧光蛋白表达盒,再通过Rco R I和Pxt I双酶切将表达盒连接到pUS186载体上,转化解淀粉芽孢杆菌TB2菌株,得到可发出绿色荧光工程菌,工程菌对黄瓜枯萎病菌的拮抗作用与野生菌株相当。     

抗黄瓜灰霉病的枯草芽孢杆菌筛选及其抑菌活性的初步研究

结合涂布平板法和温室盆栽植株法,测定了41株枯草芽孢杆菌发酵液对灰霉病病原菌及黄瓜灰霉病的抑制效果,以此筛选出针对灰霉病的生防菌株.结果表明,抑菌效果最好的枯草芽孢杆菌为BS01和BS03.采用涂布平板法研究了菌株BS01和BS03抑菌活性,结果表明,抑菌效果均为50%时,BS03比BS01的菌体浓度低,得到抑菌效果最好的菌株BS03.采用温室盆栽植株法测试了菌株BS03的抑菌活性,结果表明,菌悬液比发酵滤液的抑菌效果好,并且在菌悬液处理黄瓜苗后的第3天抑菌活性最高.     

青枯病生物杀菌剂天禾2000菌株筛选和分类研究

从福建福州、莆田、将乐、宁化、宁德、泉州等8个市县青枯病流行病区的烟草、番茄、马铃薯、花生、生姜、甜椒、茄子田间采集病株根系土壤和植株,进行分离培养,获得土壤微生物15000多株。初筛获得128个菌株对青枯病有不同程度抗性,部分菌株对烟草、番茄青枯病菌有较好的拮抗作用。进一步通过对青枯病菌抑菌力评测,稳定性测定筛选获得3株对供试指示菌有较强抑制作用的拮抗菌株,经形态特征、培养特性和生理生化性状的测定,这3株芽孢杆菌被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),代号为2000,2001,2002。抑菌谱的测定结果表明,这3株枯草芽孢杆菌为广谱的拮抗菌株。     

枯草芽孢杆菌的ade基因在大肠杆菌中的MBP融合表达及活性鉴定

扩增了枯草芽孢杆菌的ade基因, 重组入载体pMal-c2x中, 构建了麦芽糖结合蛋白（MBP）融合蛋白的表达体系. 通过IPTG诱导表达, 用MBP亲和层析法, 纯化该融合蛋白（104 700）, 并通过SDS-PAGE对表达及纯化结果进行检验, 对其酶学性质进行了初步研 究. 分析结果表明: 该融合酶蛋白具有显著的腺嘌呤脱氨酶活性, 证明了ade基因是枯草芽孢杆菌中编码腺嘌呤脱氨酶的基因.     

内生细菌YBS106对棉花的诱导抗性研究

本实验以从一把伞南星(Arisaema erubescens(Wall.)Schott)组织分离到的内生细菌YBS106对三叶一心棉苗进行灌根诱导,同时挑战接种棉花枯萎病菌或棉花黄萎病菌,测定YBS106诱导对棉叶中抗性相关酶POD和PPO活性及与抗性相关的MDA和VC含量的影响,同时测定YBS106对棉花枯、黄萎病的相对防效。结果表明,YBS106诱导对POD和PPO活性及MDA和Vc含量均有显著影响。YBS106能有效诱棉叶中POD和PPO等防御酶活及Vc含量增加和MDA含量的减少,MDA和Vc含量在诱导后第5天达到最高,POD和PPO活性在诱导后第10天达到最高。病原菌挑战接种100 d时,YBS106对棉花枯萎病菌和黄萎病菌的相对防效分别为64.24%和71.37%,这与棉花系统抗性相关的防御酶活及相关物质(MDA和Vc)含量的变化趋势吻合。该结果表明YBS106诱导棉花产生了对棉花枯萎病菌和棉花黄萎病菌的系统抗性。     

筛选假单胞菌株M18防治大棚黄瓜枯萎病害

设计了一种新的高效筛选程序,从植物根际土壤中分离出一株具有ＡＣＣ脱氨酶活性的促生拮抗双功能假单胞菌株Ｍ１８．在培养皿中,Ｍ１８能有效地抑制黄瓜枯萎病菌以及多种其他枯萎病原菌和植物病原菌的生长．Ｍ１８活菌浸种处理春黄瓜种子以及在大棚定植后根际土壤浇灌的试验中,与对照组相比,黄瓜枯萎病的株发病率降低７０％～８０％,霜霉病的发病率和病情指数都同时平均下降７０％左右,黄瓜产量提高２０％以上,每公顷可增加产值０．９万元以上,Ｍ１８的生物防治效果达到极显著程度．     

枯草芽孢杆菌对早熟禾和紫花苜蓿修复镉污染土壤的强化作用

植物-微生物联合修复是一种经济可行且生态良好的重金属污染土壤修复方法.通过盆栽试验,探究接种枯草芽孢杆菌对两种草坪植物(早熟禾、紫花苜蓿)去除土壤中镉效率的影响及机制.结果表明,种植早熟禾时,枯草芽孢杆菌能够阻隔早熟禾吸收镉,显著提高生物量,增加土壤酶活性,降低土壤有效态镉含量,并且将土壤中总镉的去除率提高约49％;对于紫花苜蓿,枯草芽孢杆菌能够促进紫花苜蓿吸收镉,显著提高生物量,增加土壤酶活性、微生物物种多样性以及有效态镉含量,并且将土壤中总镉去除率提高约140％.可见,接种枯草芽孢杆菌对两种草坪植物修复镉污染土壤均表现出显著的强化作用,而且能够改善只种植紫花苜蓿造成的土壤微生态环境破坏.研究接种枯草芽孢杆菌对两种草坪植物不同的影响和强化机制将为重金属污染场地的植物-微生物修复策略的制订与实施提供理论支持.     

稻白叶枯菌弱毒株诱导的系统抗性——兼论与防御酶活性的变化

2 个品种(余水糯, 浙辐802)的水稻幼苗经白叶枯菌( Xanthomonas oryzae pv. oryzae) 弱毒株75-1处理后,均获得了对白叶枯菌强毒株 76-25 的系统抗性,超氧化物歧化酶( SOD) 、 过氧化氢酶( CAT) 活性下降, 脂氧合酶( LOX)、 丙二醛含量升高Ti ron 削弱了75- 1对上述指标的诱导作用,导致75-1对余水糯和浙福 802 的互作由非亲和性类型转变为类似亲和性性类型.提示 O^{- .}₂ 等活性氧介导的脂膜过氧化损伤及防御酶系统的活性变化与水稻幼苗对稻白叶枯病的系统性抗性有关.     

黄赭色链霉菌11F发酵工艺及其对黄瓜幼苗生长的影响

为了深入研究黄赭色链霉菌对黄瓜生长及黄瓜枯萎病的防治效果,采用固体发酵单因素方差分析对菌株11F的固体发酵条件(种龄、配水比、接种量、发酵基质)进行优化,通过检测存活率测定在不同条件处理下菌剂链霉菌孢子对菌剂耐热力与抗紫外作用进行了分析,通过温室盆栽实验研究菌株11F菌剂对黄瓜生长的影响及对黄瓜枯萎病的防治效果。结果表明:最佳固体发酵基质配比为80%大米+10%麦麸,最佳料比水为1∶0.3,最佳种龄为60 h,最佳接种量为10%。通过筛选得到菌剂最适载体是壳聚糖,温室盆栽实验显示菌株11F的发酵液与固体菌剂对黄瓜的生长都有促生作用。菌剂11F与蛭石的比例为1∶100时黄瓜幼苗的株高、根长、鲜重、干重都显著高于其他处理,株高增加39%,根长增加了33.9%,鲜重增加了35.3%,干重增加了40.9%,其长势茂盛,叶色浓绿,促生效果明显。菌剂11F对黄瓜枯萎有明显的防治效果,防效为73.45%,由此说明菌株11F菌剂可用于黄瓜枯萎的防治。     

Purification and characterization of a novel antifungal protein from Bacillus subtilis strain B29

An antifungal protein was isolated from a culture of Bacillus subtilis strain B29. The isolation procedure comprised ion exchange chromatography on diethylaminoethyl (DEAE)-52 cellulose and gel filtration chromatography on Bio-Gel® P-100. The protein was absorbed on DEAE-cellulose and Bio-Gel® P-100. The purified antifungal fraction was designated as B29I, with a molecular mass of 42.3 kDa by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), pI value 5.69 by isoelectric focusing (IEF)-PAGE, and 97.81% purity by high performance liquid chromatography (HPLC). B29I exhibited inhibitory activity on mycelial growth in Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Fusarium moniliforme, and Sclerotinia sclerotiorum. The 50% inhibitory concentrations (IC₅₀) of its antifungal activity toward Fusarium oxysporum and Rhizoctonia solani were 45 and 112 μmol/L, respectively. B29I also demonstrated an inhibitory effect on conidial spore germination of Fusarium oxysporum and suppression of germ-tube elongation, and induced distortion, tumescence, and rupture of a portion of the germinated spores.     

10种蔬菜内生细菌的分离筛选

以抑制植物主要病害病原菌和内生防病相关酶活性为评价标准,从蔬菜作物体内分离筛选植物内生细菌资源。从苦瓜、丝瓜、空心菜、大豆等10种蔬菜体内分离到101株细菌,发现内生细菌在不同种类的蔬菜中出现的频率不同,其中丝瓜叶上的内生细菌数量最多,洋葱体内分离到的内生细菌数量最少。运用平板对峙法从中筛选出了对黄瓜枯萎病菌、番茄青枯病菌、水稻细条病菌、荔枝霜疫霉病菌等有较强拮抗作用的菌株,获得对以上4种病菌均有拮抗作用的内生细菌有41株,占总株数的40．6％。对101株细菌进行纤维素酶、蛋白酶和几丁质酶活性测定表明,同时具有3种酶活性的菌株有32株,占总菌数的31．7％。从中选出13株拮抗效果较好的内生细菌。经初步鉴定均属于芽孢杆菌属（Bacillus sp）。进一步对筛选获得的同时对以上4种病原菌均有拮抗作用,且具有纤维素酶、蛋白酶和几丁质酶活性的13号、14号、59号和82号菌株进行16SrDNA序列分析,表明4个菌株均为枯草芽孢杆菌（B．subtilis）或其近缘种。     

荧光蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达

枯草芽孢杆菌是生物工业用的重要宿主体系。为实现荧光蛋白从分子水平定量追踪枯草芽孢杆菌培养过程的目的,构建了一系列整合型表达载体pX-GFPmut1和游离型表达载体pSW1-GFPmut1,pSW1-CFP,pSW1-YFP,研究了不同颜色荧光蛋白在枯草芽孢杆菌中整合型表达和游离型表达的差异。最适合的荧光蛋白表达体系是用游离型质粒pSW1-GFPmut1在枯草芽孢杆菌中表达绿色荧光蛋白GFPmut1。含pSW1-GFPmut1枯草芽孢杆菌通过木糖诱导表达GFPmut1后,细胞破碎后的荧光强度和细胞浓度呈线性关系。结果表明,利用枯草芽孢杆菌表达荧光蛋白可以实现利用荧光蛋白快速定量枯草芽孢杆菌培养过程。