乳膜培养人内皮细胞及其整装电镜标本制作技术的研究

用Falcon塑料培养器皿的原料，自制一种支持膜（PF），经明胶处理后，首次用于浮膜培养人内皮细胞。细胞片长至亚融合时，以高锰酸钾混合固定液固定、消化细胞以保存细胞的膜系统。将固定后的细胞连同PF贴附于铜网上，干燥后在TEM80Kv条件下，细胞的内质网及线粒体等超微及立体超微结构可被清楚地观察到。还讨论了本方法的优点并与文献中的其它整体细胞方法做了比较。     

流式细胞术同时检测GFP和PI细胞的预处理方法

目的：以绿色荧光蛋白（GFP）作为报道基因,探讨转染GFP的培养细胞检测细胞周期的流式细胞技术。方法：用贴壁细胞MCF-7细胞以脂质体转染PEGFP—C,,转染后24h收集细胞,分别用70％乙醇固定、1％多聚甲醛固定和1％多聚甲醛固定后用透膜齐3透膜PI染色,以非转染细胞作为阴性对照,转染CFP非固定细胞作为阳性对照,用流式细胞仪检测。结果：用70％乙醇固定细胞导致GFP完全淬灭;用1％多聚甲醛固定保持99％的GFP阳性率,荧光强度稍有下降;而经过皂素破膜和PI染色后,GFP的阳性率也能保持有原来的80％左右;1％多聚甲醛固定24h内对GFP的阳性率没有大的影响。结论：对于含有GFP基因的细胞在进行流式细胞周期的检测时,应避免使用细胞周期常规的乙醇固定方法;l％多聚甲醛固定加皂素破膜能有效保证GFP的荧光活性。     

京尼平固定NGF壳聚糖膜的制备及缓释NGF作用探讨

目的:探讨京尼平固定神经生长因子(NGF)壳聚糖膜(GCN膜)缓释NGF的方法和作用。方法:实验组(GCN膜)采用纯天然生物交联剂京尼平将NGF固定在壳聚糖上,采用壳聚糖固定NGF以后的膜与未分化的PC12细胞共培养法观察细胞生长状态。另设阴性对照组(GC膜)不加NGF,阳性对照组(低血清F12K完全培养基中加入50ng/mlNGF)。结果:GCN膜组的PC12细胞在膜中释放出的NGF作用下突起生长明显,与阴性对照组有显著差异。结论:京尼平固定NGF壳聚糖膜可以有效缓释出具有生物活性的NGF,为临床上损伤神经的修复提供新的可能。     

整装培养细胞内质网的透射电镜观察

采用以高锰酸钾为固定剂的整装培养细胞制样技术:观察了几种细胞系细胞(Hela,LA₇₉₅,2BS)内质网(endoplasmic reticulum,简称ER)的超微结构.由ER小管构成的连续的网络系统存在于整个细胞的细胞质中.此法同样适于观察线粒体的超微结构及线粒体的三维空间关系,在Hela细胞中,仅用高锰酸钾固定剂固定7min就能清晰地看到线粒体的嵴.结果表明,本方法适于观察细胞中膜细胞器的分布和超微结构.     

整装培养细胞内质网的透射电镜观察

采用以高锰酸钾为固定剂的整装培养细胞制样技术：观察了几种细胞系细胞（Ｈｅｌａ，ＬＡ_（７９５），２ＢＳ）内质网（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，简称ＥＲ）的超微结构。由ＥＲ小管构成的连续的网络系统存在于整个细胞的细胞质中。此法同样适于观察线粒体的超微结构及线粒体的三维空间关系，在Ｈｅｌａ细胞中，仅用高锰酸钾固定剂固定７ｍｉｎ就能清晰地看到线粒体的嵴。结果表明，本方法适于观察细胞中膜细胞器的分布和超微结构。     

血浆清蛋白对脂蛋白脂肪酶(LPL)活性的影响

脂蛋白脂肪酶由实质细胞(尤其是心肌及脂肪细胞)合成,后转移至毛细血管内皮细胞膜上与膜磷脂的氨基葡聚糖(GAG)以离子键相连而固定于毛细血管内皮细胞膜上,水解乳糜微粒(CM)及     

脱细胞真皮基质修复膜修复软腭黏膜缺损

目的 评价脱细胞真皮基质修复膜不加压包扎修复软腭黏膜缺损的疗效.方法 以异种脱细胞真皮基质修复膜修复8例患者软腭黏膜缺损,平均缺损面积16.4 cm2,采用密集的贯穿软腭肌层与修复膜褥式缝合方法将补片固定于创面,术后密切观察1周,并随访1年以上.结果 术后观察1周未见修复膜脱落,无感染,术后随访均1年以上,软腭黏膜缺损修复良好,术区外观及质地较正常黏膜无差异,患者无腭咽闭合不全主诉.结论 应用脱细胞真皮基质修复膜修复软腭黏膜缺损,以密集的贯穿软腭肌层与修复膜的褥式缝合代替加压包扎,修复效果可靠.     

培养心肌细胞原位固定的简易粘揭法

培养乳大鼠心肌细胞原位固定染色后,用1％聚乙烯醇缩甲醛制膜粘揭细胞作形态学观察。此法能保持细胞体外生长的原始状态,不造成细胞结构的化学机械损伤。     

硝酸纤维素膜在细胞培养和染色中的应用

目的提供一种新的用于细胞培养和病理技术的支持介质。方法应用硝酸纤维素膜培养细胞和病理染色并与常规方法培养细胞的比较。结果细胞生长良好,形态正常,染色后结构清晰,与常规玻璃培养的细胞无明显差异。结论硝酸纤维素膜具有良好的透光性及化学稳定性,无细胞毒性作用,同时对细胞有较好的亲合性,可以替代玻片,较玻片具有广阔的应用前景。     

兔膀胱移行上皮细胞构建组织工程尿道的初步研究

目的 探索以膀胱移行上皮细胞为种子细胞构建组织工程尿道的可行性。方法 取兔膀胱移行上皮细胞，体外培养传代后作为种子细胞与自制胶原膜体外联合培养并行裸鼠体内移植，通过对复合物扫描电镜、HE染色及角蛋白免疫组化检测，了解细胞在材料上的生长情况。结果 2h后移行上皮细胞在胶原膜上贴附生长，复合物移植体内20d后，移行上皮细胞分化成层，层厚1～5层。结论 该方法获取的膀胱移行上皮细胞是构建组织工程尿道的良好种子细胞，与胶原膜构建的复合物在体内形成了尿道类似物，有望成为替代尿道的组织工程材料。     

氢过氧化枯烯对整装培养人血管内皮细胞损伤作用的研究

本实验改良了传统方法,自创PF膜和浮膜培养法,首次整装培养人血管内皮细胞成功,经高锰酸钾固定剂固定,消化细胞内蛋白质,保留脂质膜性系统,应用透射电镜进行整体观察。在此基础上,用氢过氧化枯烯处理,造成整装内皮细胞线粒体,内质网的脂质过氧化损伤模型。本实验进一步证实脂质过氧化对内皮细胞生物膜的损伤,并报告了内质网和线粒体损伤的整体结构变化。     

血小板第四因子对CD34+白血病细胞系KG1a粘附功能的影响

目的研究血小板第四因子(PF4)对CD34 白血病细胞系KG1a细胞与人脐静脉内皮细胞系ECV-304细胞之间粘附性及对多种粘附分子表达的影响。方法采用粘附实验、粘附阻断实验、MTT染色、半定量RT-PCR、免疫标记流式细胞仪测定等方法。结果穴1雪PF4可以增加KG1a细胞与ECV-304细胞之间的粘附作用。PF4与KG1a及ECV-304细胞同时孵育或与KG1a或ECV-304细胞单独孵育,均使KG1a细胞粘附能力增加。穴2雪抗粘附分子CD49d、CD106、CD54单克隆抗体可显著减少PF4对KG1a粘附的增加作用,而抗粘附分子CD62L、CD62E、CD62P单抗则对PF4的这种增加粘附的作用没有影响。穴3雪在PF4作用的3h内,半定量RT-PCR检测粘附分子CD49d、CD106、CD54mRNA表达水平有不同程度的上调。(4)PF4作用2h后,流式细胞仪分析显示KG1a细胞上的CD49d、ECV-304细胞上的CD54蛋白表达水平显著增加。结论PF4通过上调粘附分子的表达促进KG1a细胞的粘附功能。     

人胎肾上腺髓质细胞原代分离培养

本文介绍了一种较简捷、快速的人胎肾上腺髓质细胞原代分离培养的方法。分离出的人胎肾上腺髓质经胶原酶消化后,用Percoll液密度梯度离心可获得纯度为75～85%的肾上腺髓质细胞,将髓质细胞接种到铺有胶原的培养板上,培养2-7天后髓质细胞胞体增大,长出突起,胞浆含有颗粒,用特异性儿茶酚胺诱发萤光技术进一步确定培养的肾上腺髓质细胞的性质,用HPLC测定培养液中单胺类物质的含量。对培养过程中的某些技巧问题进行了讨论。     

兔骨髓间充质干细胞的筛选与体外培养

目的 :探讨兔骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)体外分离筛选及扩增的条件 ,同时观察骨髓细胞体外培养的生物学特性。方法 :无菌条件下采集兔骨髓 ,肝素抗凝 ,经淋巴细胞分层液 (相对密度为 1 .0 77)密度梯度离心分离骨髓单个核细胞 ,进而贴壁培养 ,获得MSCs。采用常用细胞培养技术和细胞培养的研究方法 ,观察不同贴壁时间、不同种植密度、有无包被成分及不同蛋白包被培养板对MSCs生长增殖的影响。结果 :预先蛋白包被培养板有利于MSCs贴壁。在细胞生长和增殖方面 ,纤粘连蛋白优于明胶和Ⅰ型胶原 ,以贴壁 48～ 72h ,种植密度 (3～ 9)× 1 0 4 /ml为最适条件 ,有利于梭形细胞形态和快速增殖能力的维持 ,保持成体干细胞的多向分化性。结论 :建立了MSCs体外分离和培养的最适条件 ,为进一步研究MSCs的诱导分化和应用提供了保证     

简易的单个肿瘤干细胞分离及其培养方法

目的建立一套简单有效的单个肿瘤干细胞分离及培养方法,提高研究的效率与质量。方法在火焰上轻烤拉伸后的毛细管,与无菌塑料管连接建立口控毛细管单细胞分离装置。分离单个SW480细胞无血清培养筛选出克隆球,CD133、CK7荧光标记鉴定;消化克隆球吸取单个肿瘤干细胞并移至石蜡油封闭的微滴及96孔板中培养对比观察。结果 SW480细胞克隆形成率约为1.04%,其CD133表达强CK7表达弱;口控毛细管单细胞分离装置分离单个肿瘤干细胞的有效率可高达98.99%;单个肿瘤干细胞在微滴中培养与在96孔板中培养的比较:在分裂时间点上,前两次分裂时间相差无几(P>0.05),在微滴中培养的细胞后续分裂需时较长;在持续扩增的数量上,微滴培养为11.5%(22/192)而96孔板为9.2%(17/184),两者差异无统计学意义(P>0.05)。结论单个SW480细胞无血清培养可形成肿瘤干细胞球,口控单细胞分离装置能够有效分离单个肿瘤干细胞,石蜡油封闭微滴培养法和96孔板培养法均能够有效扩增单个肿瘤干细胞。但石蜡油封闭微滴培养法操作灵活、观察便捷、环境稳定,可作为培养单个肿瘤干细胞的首选。     

兔膀胱移行上皮细胞与丝素蛋白膜相容性研究

目的 探讨用于膀胱组织工程研究的移行上皮种子细胞的培养方法,检测丝素蛋白膜与膀胱移行上皮细胞的细胞相容性,探讨构建泌尿系腔道组织工程器官的可能性.方法 (1)取兔膀胱移行上皮细胞体外培养,观察细胞形态变化及生长、增殖过程,并进行免疫荧光鉴定;(2)分别设立空白组(无细胞)、阴性对照组(培养基)和实验组(丝素蛋白膜浸提液).取对数生长期的膀胱移行上皮细胞,lx104/ml接种于96孔板中,每组各5孔,于接种后24、72和120h,通过MTT法显色.并于酶标仪490nm波长下检测吸光度值,计算相对增殖率,对丝素蛋白膜与膀胱移行上皮细胞的相容性进行评估.结果 细胞在第9～10天融合形成单层,细胞形态呈多角形的铺路石子状,经免疫荧光鉴定证实为移行上皮细胞;24、72和120 h实验组吸光度值分别为0.424±0.020、0.996±0.118和1.285±0.048.阴性对照吸光度值分别为0.419±0.030、1.105±0.098和1.228±0.052,两组比较无明显差异(P＞0.05).结论 丝素蛋白膜与膀胱移行上皮细胞相容性良好,具有作为泌尿系腔道组织工程支架的潜在运用价值.     

血小板第4因子对脐带血CD34+细胞增殖及归巢相关功能影响的研究

目的探讨血小板第4因子(PF4)对脐带血(UCB)CD34 细胞增殖及归巢相关功能影响。方法采用免疫荧光标记流式细胞仪测定、结晶紫染色测定、Transwell实验等方法。结果(1)PF4在体外能通过抑制UCB CD34 细胞凋亡增强细胞生存能力,在本研究建立的FST无血清扩增培养体系中加入PF4可在一定程度上增加CD34 细胞扩增倍数。(2)PF4能够明显上调CD34 细胞CD49d、CD49 e、CD54表达,提高CD34 细胞的黏附能力。(3)PF4能够明显提高CD34 细胞CXCR-4的表达和SDF-1诱导迁移率。结论PF4能够应用于UCB CD34 细胞体外扩增,保持扩增的CD34 细胞的黏附和迁移能力。     

胎盘免疫调节因子对PCI2细胞生长的影响

目的：观察胎盘免疫调节因子（placenta factor,PF）对PCI2细胞生长的影响。方法：培养PCI2细胞,用MTT法观察PF对体外无血清培养PC12细胞存活率的影响及PF对低血清培养PCI2细胞增殖、分化的影响。结果：对无血清培养的PCI2细胞加入不同浓度的PF培养44h后,PF在浓度为50、25、12．5、6．25mg／L时可以显著提高无血清培养PCI2细胞的存活率（P〈0．05）。对低血清培养的PCI2细胞加入不同浓度的PF培养68h后,PF在浓度为12．5mg／L和6．25mg／L时可以显著提高PCI2细胞的数量（P〈0．01）。对低血清培养的PCI2细胞加入不同浓度的PF培养10d,PF在浓度为3．13mg／L和1．56mg／L作用第6天时,细胞长出突起。结论：PF能提高无血清培养PCI2细胞的存活率,促进PCI2细胞增殖,诱导PC12细胞分化。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

目的：探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)向神经细胞体外定向诱导分化的条件。方法：从正常SD大鼠骨髓中分离获取MSC,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,采用丁羟茴醚(BHA)和二甲亚砜(DMSO)对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学对诱导后的细胞进行鉴定。结果：诱导1h、2h、3h后有部分细胞表达神经干细胞标志蛋白nestin,且随诱导时间延长呈下降趋势;诱导5h后,大部分细胞具有典型神经元形态,表达神经元标志物,神经元特异性烯醇化酶(NSE),少部分细胞呈星型胶质细胞状,表达胶质细胞标志物—胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结论：骨髓间充质干细胞可以在体外培养扩增并诱导成为神经元样细胞和星型胶质样细胞。     

一种高选择性、高效的牛视网膜微血管内皮细胞培养方法

目的 建立一种高效、可行、特异性高的牛视网膜微血管内皮细胞(BREC)培养方法.方法 取新鲜牛眼,分离视网膜并用DMEM进行冲洗、匀浆剪碎,过75μm筛,将滤网上滤渣转移至50 ml离心管,用I型胶原酶、DNaseI及蛋白酶等多种酶混合液消化20 min,人血清中和后,过46μm网筛并冲洗,离心5 min,将组织扣在培养皿中,转入15 ml离心管,用10％人血清含生长因子ECGS的DMEM培养液培养于25 cm2,选择性培养视网膜血管内皮细胞,接种于明胶包被培养瓶中,采用ECGS配合肝素培养液促进内皮细胞生长,观察细胞形状生长特性,并用免疫化学荧光方法进行鉴定.结果 选择性培养视网膜微血管内皮细胞成单层、镶嵌铺路石状生长,Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测为阳性纯度均大于95％以上,将细胞种在凝固的基质胶表面,12～18 h形成官腔结构.结论 本方法过程简单、可靠,培养的内皮细胞纯度高,生长状态良好,稳定传代,为视网膜血管生成疾病研究建立了模型.