4-1BBL介导逆向信号在HL-60细胞对淋巴细胞活性影响中的作用

目的:观察4-1BBL介导逆向信号对HL-60细胞表达肿瘤生长因子-β(TGF-β)的影响,以及阻断4-1BB/4-1BBL信号前后的HL-60细胞培养上清液对淋巴细胞活化、增殖和凋亡诱导作用的影响,探讨肿瘤的免疫逃逸机制。方法:流式细胞术检测HL-60细胞4-1BBL表达水平和阻断4-1BBL信号前后HL-60细胞TGF-β表达水平;将阻断4-1BBL前后的HL-60细胞培养上清液加入淋巴细胞培养液中,流式细胞术检测淋巴细胞活化、凋亡水平,MTT法检测淋巴细胞增殖水平。结果:HL-60细胞表面4-1BBL表达率为92.6%;阻断4-1BBL后的HL-60细胞表达TGF-β水平下降(P<0.05),其细胞培养上清液对淋巴细胞活化没有明显影响(P>0.05),但对淋巴细胞增殖抑制作用和诱导凋亡作用下降(P<0.05和P<0.01)。结论:表达在HL-60细胞表面的4-1BBL可介导逆向信号,通过调节TGF-β分泌抑制机体淋巴细胞活性,为肿瘤细胞的生存创造条件。     

激发型鼠抗人4-1BBL单克隆抗体的研制

目的鼠抗人4—1BBL单克隆抗体的制备及其生物学特性研究。方法以高表达人4—1BBL分子的基因N-程细胞株L929／4—1BBL为免疫原免疫BALB／c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,经过选择性克隆化培养及流式细胞术分析,筛选分泌特异性抗A4—1BBL单抗的杂交瘤细胞株;采用快速定性试纸法鉴定单抗亚类、间接免疫荧光法检测单抗对肿瘤细胞株的识别谱。进而,将所获抗人4-1BBL单抗体外刺激白血病细胞株U937,通过细胞计数法分析单抗对U937生长的影响。结果获得一株持续、稳定分泌鼠抗人4—1BBL单抗的杂交瘤细胞株,并将其分泌的单抗命名为39A8。单抗39A8可有效识别不同肿瘤细胞株表达的4—1BBL,经细胞计数分析,39A8对U937细胞的生长具有明显的促增殖作用。结论单抗39A8是可激发4-1BBL逆向信号的单克隆抗体,是研究4—1BBL分子及其功能的重要工具。     

siRNA靶向抑制4-1BBL基因表达在HL-60细胞对淋巴细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察4-1BB配体（4-1BBL）-siRNA对HL-60细胞细胞因子分泌的影响;对比观察4-1BBL基因被干扰前后,HL-60细胞培养上清液对淋巴细胞增殖、凋亡诱导作用的影响;探讨肿瘤细胞的免疫逃逸机制。方法:采用化学合成法人工合成靶向人4-1BBL基因的siRNA,脂质体转染法转染HL-60细胞;半定量RT-PCR和流式细胞术检测干扰前后HL-60细胞4-1BBL-mRNA和表面蛋白的表达水平;ELISA法检测4-1BBL干扰前后HL-60细胞培养上清液转化生长因子-β（TGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）分泌水平。密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,收集4-1BBL干扰后的HL-60细胞培养上清液与体外分离的人淋巴细胞共培养,MTT法检测机体淋巴细胞增殖水平;流式细胞术检测淋巴细胞凋亡比率的变化。结果:靶向4-1BBL-siRNA转染HL-60后,4-1BBL-mRNA和蛋白的表达水平明显降低（P<0.01）; ELISA结果显示,4-1BBL基因被干扰后,HL-60细胞培养上清液中TGF-β和VEGF分泌水平明显降低（P<0.01和P<0.05）。与干扰前比较,干扰后的HL-60细胞培养上清液对机体淋巴细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用均下降（P<0.05）。结论:HL-60细胞高表达的4-1BBL信号具有反向调节作用,通过促进其分泌TGF-β、VEGF,使肿瘤细胞培养上清液对淋巴细胞活性的抑制作用增强并促进淋巴细胞凋亡,可能是肿瘤细胞逃避宿主免疫监视的机制之一。     

不同血液肿瘤细胞株survivin基因和蛋白表达及意义的研究

目的：研究survivin在不同血液肿瘤细胞株(Jurkat, Raji, EL 4, K562, K562/AO2)的表达，并探讨其与相关因素的关系。方法：应用RT PCR技术检测survivin mRNA在各细胞株的表达，用免疫组化法检测survivin 蛋白的表达，流式细胞仪检测细胞周期。结果：survivin mRNA在4种人源性细胞株(Jurkat, Raji, K562, K562/AO2)中均有表达，耐药株K562/AO2高于其他细胞株；免疫组化结果显示survivin蛋白在胞核与胞浆均有表达，且表达水平与mRNA水平一致；细胞周期结果显示，survivin表达较高的细胞株G2/M期细胞比例和增殖指数较高。结论：survivin基因在血液肿瘤细胞株中普遍表达，survivin 高表达可能与肿瘤细胞增殖及耐药有关。     

靶向4-1BBL基因siRNA抑制HL-60B细胞生长的体外研究

目的：观察4-1BBL基因小分子干扰RNA（siRNA）对HL-60细胞生长及诱导其凋亡作用的影响。方法：化学合成法合成靶向人4-1BBL基因siRNA,脂质体转染法转染HL-60B细胞;半定量PCR和流式细胞术检测转染前后HL-60B细胞4-1BBL的表达水平,MTT法检测HL-60B细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果：靶向4-1BBL基因siRNA转染HL-60B细胞后,4-1BBLmRNA和蛋白的表达明显降低;细胞增殖被抑制,其抑制作用在转染后48h最明显,增生抑制率达到（22.1±2.3）%;细胞凋亡率增加,由（9.8±2.5）%上升到（32.5±5.1）%。结论：化学合成的siRNA在体外能成功抑制靶基因4-1BBL的表达和HL-60B细胞的增殖,并有助于细胞趋向凋亡。     

人4-1BBL转基因细胞株的构建及其生物学功能的研究

目的为探讨人4-1BBL分子的生物学功能，构建人4-1BBI。转基因细胞株。方法利用RT-PCR方法克隆人4-1BBI。全长基因，继而重组入逆转录病毒表达载体pEGZ．Term。重组逆转录病毒载体pEGZ．Term／4-1BBI。与两个辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T，用含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞，筛选获得Zeocin抗性的转基因细胞。^3H-TdR掺入实验分析4-1BBL转基因细胞对T细胞增殖的影响，ELISA法分析细胞因子的分泌。结果流式细胞仪表型分析结果表明，L929／4．1BBL转基因细胞稳定表达人4-1BBL分子。体外实验表明，L929／4-1BBL细胞能够促进T细胞活化、增殖及IL-2、IL-6和IFN-γ的分泌。结论该研究成功克隆了人4-1BBL基因，构建了能稳定表达4-1BBL分子的转基因细胞株L929／4-1BBL，该株转基因细胞能提供有效的4-1BBL共刺激信号，促进T细胞活化、增殖及细胞因子的分泌。     

昆布多糖硫酸酯对急性髓性白血病HL-60细胞的调控

目的：研究昆布多糖硫酸酯(LAMS)对急性髓性白血病HL-60细胞株的调控作用。方法：用MTT法测定不同浓度LAMS对HL-60细胞株的增殖抑制作用；流式细胞仪分析不同浓度作用下细胞凋亡率；免疫组化法测定LAMS对HL-60细胞株NF—κB家族P65亚单位的作用。结果：HL-60细胞增殖抑制程度与昆布多糖硫酸酯的浓度呈正相关；HL-60细胞凋亡率随药物浓度的增加而升高；在LAMS浓度为0．75μg／ml作用下，P65在12h表达呈强阳性，24h几乎不表达，而IKbα在6h表达呈强阳性。结论：LAMS可以诱导体外HL-60细胞凋亡，其中对凋亡的调控作用可能为负调控；LAMS能够调控NF-κB的表达，其表达有时间差异性。说明LAMS已作用于分子水平。     

Bmi-1和Mel-18基因在MG-132诱导的人HL-60细胞系凋亡中的表达变化

目的研究Bmi-1和Mel-18基因在人急性髓系白血病细胞株HL-60凋亡过程中的表达。方法将HL-60细胞用Proteasome抑制剂MG-132进行处理后，采用Real—Time RT-PCR法检测不同时间点的Bmi-1和Mel-18的表达水平，用流式细胞仪检测细胞凋亡状况，同时共聚焦显微镜观察细胞内NF-κB活性。结果MG-132处理前HL-60细胞Mel-18表达水平很低，而Bmi-1表达水平较高；处理后Mel-18表达水平未见明显变化，而Bmi-1表达水平明显下降，细胞凋亡比例增加，同时观察到HL-60细胞内NF-κB活性明显抑制。结论MG-132抑制NF-κB活性的过程中很可能通过下调Bmi-1的表达，诱导了HL-60细胞凋亡。     

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在前列腺癌细胞中的表达

目的:构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体,并检测其在前列腺癌细胞株(PC-3)中的表达。方法:将目的基因m4-1BBL全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),获得m4-1BBL定向插入重组子pcDNA3.1(+)m4-1BBL,采用限制性内切酶和测序鉴定是否成功构建。用脂质体法将重组质粒转入PC-3细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测m4-1BBL在PC-3中的表达。结果:酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有小鼠4-1BBL全长cDNA编码序列,转染实验表明m4-1BBL基因能在PC-3细胞中表达。结论:小鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在PC-3细胞中的表达均获成功,为进一步研究莫定了基础。     

昆布多糖硫酸酯对急性髓性白血病HL-60细胞株NF-κB表达的实验研究及CD11b在HL-60细胞株的表达

目的 研究昆布多糖硫酸酯(LAMS)对急性髓性白血病HL-60细胞株NF-κB表达的影响及CD11b在HL-60细胞株的表达。方法 用MTT法测定不同浓度LAMS对HL-60细胞株的增殖抑制作用；流式细胞仪分析不同浓度作用下细胞凋亡率，免疫组化法测定MMS对HL-60细胞株NP-κB家族P65亚单位的作用及CD11b表达。结果 HL-60细胞增殖抑制程度与昆布多糖硫酸酯的浓度呈正相关；HL-60细胞凋亡率随药物浓度的增加而升高；在LAMS浓度为0．75μg/ml作用下，P65在12h表达呈强阳性，24h几乎不表达，而IKbα在6h表达呈强阳性，CD11b不表达。结论 LAMS可以诱导体外HL-60细胞凋亡，其中对凋亡的调控作用可能为负调控；LAMS能够调控NF—κB的表达，其表达有时间差异性。说明LAMS已作用于分子水平，且对CD11b在HL-60细胞株的表达无影响。     

4-1BBL分子在人恶性血液病细胞系的表达

目的:研究共刺激分子4-1BBL分子在人恶性血液病细胞系的表达及其生物学意义。方法:流式细胞仪检测4-1BBL分子在不同的人恶性血液病细胞系的表达;用可介导4-1BBL逆向信号的鼠抗人4-1BBL单抗(mAb1F1)作用于8个不同的人恶性血液病细胞系,细胞计数法和3H-TdR掺入法评价细胞系的体外生长和增殖。结果:FACS结果显示4-1BBL分子在人恶性血液病细胞系上有不同程度的表达,其中髓性白血病细胞系U937、HL60及B淋巴瘤细胞系Raji、Daudi上呈现较高水平的表达。细胞计数和3H-TdR掺入实验结果表明mAb1F1对髓性白血病细胞系U937和HL60,具有较强的促增殖效应。结论:共刺激分子4-1BBL分子在髓性白血病细胞系和B淋巴瘤细胞系上表达率较高;4-1BBL分子可通过介导逆向信号促进髓性白血病细胞系U937和HL60的生长和增殖。     

激发型4-1BBL抗体促进原代急性髓细胞白血病细胞的增殖和MMP-9分泌

目的:研究共刺激分子4-1BBL分子逆向信号对原代急性髓细胞白血病细胞的促增殖作用及其生物学效应?方法:用流式细胞术(FCM)检测4-1BBL分子在26例初诊急性髓细胞白血病(AML)患者白血病细胞表面的表达,分离AML患者的白血病细胞并加入激发型4-1BBL抗体(1F1单抗)共培养,同时设置IgG1同型对照组,Alamar Blue法检测4-1BBL单抗1F1促AML原代细胞的增殖?收集培养细胞的上清液,用ELISA方法检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的水平?结果:FCM测得初诊AML患者的白血病细胞上存在4-1BBL分子的表达,26例AML患者中4-1BBL分子的阳性表达率为46.15%;1F1单抗能明显促进4-1BBL+ -AML细胞的生长,4-1BBL+ -AML组刺激指数明显高于4-1BBL- -AML组(P < 0.01)?1F1与4-1BBL+ -AML细胞共培养48 h后,用ELISA法检测其上清液中MMP-9含量显著高于IgG1同型对照组[(965.06 ± 229.94) vs (596.49 ± 129.28) pg/ml,P < 0.01],而4-1BBL- -AML组的MMP-9与IgG1组无显著差异(P > 0.05)?结论:部分AML患者的白血病细胞可以表达4-1BBL分子,1F1单抗与AML细胞上4-1BBL分子交联后,可以促进AML细胞的生长,同时促进MMP-9的分泌?     

4-1BBL/4-1BB信号对系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞活化的影响

目的:探讨4-1BBL/4-1BB信号对系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血淋巴细胞活化及共刺激分子表达的影响。方法:用CD3单抗刺激SLE患者外周血单个核细胞,并用抗4-1BBL单抗阻断4-1BBL/4-1BB共刺激信号,流式细胞术检测阻断前后T、B细胞上4-1BB、CD40L、4-1BBL、CD40以及CD69表达水平。结果:SLE患者T细胞上CD69表达明显高于正常对照组(P<0.01);SLE患者外周血T细胞上4-1BB、CD40L和B细胞上4-1BBL、CD40表达明显高于正常对照组(P<0.01),活化后T细胞上共刺激分子表达升高更加明显(P<0.01);抗4-1BBL单抗阻断后4-1BB、CD40L表达明显下降(P<0.01),B细胞上CD40表达下降,与SLE未活化组和活化组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:SLE患者外周血T、B细胞活化水平升高,4-1BBL/4-1BB信号对其活化状态维持可以起重要作用。     

重组人可溶性TRAIL分子诱导细胞凋亡机理探讨

目的 探讨重组人可溶性TRAIL蛋白（rhsTRAIL）诱导细胞凋亡的机理。方法 应用DNA染料和流式细胞仪定性分别检测rhsTRAIL诱导的细胞凋亡；流式细胞仪检测靶细胞膜表面TRAIL受体表达格局，荧光定量法检测凋亡细胞中Caspase-3活性。结果 100ng/ml人可溶性TRAIL蛋白分子对外周血淋巴细胞无明显毒性，但可诱导肿瘤细胞凋亡，不同的肿瘤细胞凋亡率有差异。凋亡范围在26%-57%。不同细胞表面TRAIL受体表达量不同，外周血淋巴细胞的死亡受体DR4，DR5受体表达5%，而诱骗受体DcR1表达55%，相反肿瘤细胞上的DR4，DR5表达高（40%——88%）。而DcR1表达很低（8%-17%），rhsTRAIL诱导HL-60细胞发生凋亡，其细胞内Caspase-3活性增高，ActD可增加TRAIL抑制细胞生长活性。结论 重组人可溶性TRAIL蛋白分子可诱导肿瘤细胞凋亡，凋亡活性TRAIL受体类型及Caspase-3活性增高有关。