人表皮生长因子缓释型滴眼剂对角膜碱烧伤的基因治疗

目的观察人表皮生长因子基因对角膜细胞的转染情况,探讨用人表皮生长因子基因对角膜损伤治疗的可行性。方法利用基因重组技术构建了人表皮生长因子全基因序列,将该基因序列插入 pcDNA3.1真核表达高效穿梭质粒,用脂质体制成人表皮生长因子基因缓释型滴眼剂,滴眼治疗家兔角膜碱烧伤。在治疗后的不同天数,分别测定了角膜组织中人表皮生长因子 mRNA 和 DNA 的表达,用 ELISA 法测定了人表皮生长因子在兔角膜组织中的含量。结果在基因转染后24h 至28天,角膜组织分别用 RT-PCR 和 PCR 均可检测出人表皮生长因子 mRNA 和 DNA 表达。用 ELISA 法测定人表皮生长因子蛋白质表达水平。结果表明,在转染后24h,实验组分别与对照组和空白组平行对比,实验组蛋白质表达水平明显升高(P<0.01),第7天达高峰,为224.286mg/g 角膜湿重,随后逐渐降低,持续可表达20天以上;在转染后24h,免疫组织化学染色在全层角膜细胞内亦可见 hEGF 蛋白质表达,第7天达到高峰,细胞转染率高达98%以上,随后逐渐降低,持续可表达20天以上。结论用 pcDNA3.1真核表达高效穿梭质粒作为载体,携带人表皮生长因子基因用脂质体包裹后制成缓释型滴眼液,以滴眼的方式给药转染角膜,可达到极高的转染率,具有良好的应用前景。     

重组人表皮生长因子促人角膜缘上皮细胞生长的研究

目的：探讨重组表皮生长因子（rhEGF)对人角膜缘上皮细胞生长的影响。方法：采用rhEGF作用于体外培养的人角膜缘上皮细胞，记录细胞生长曲线，并用四只氮盐（MTT）法测定细胞增殖状况。结果：rhEGF浓度为10ng/ml时对人角膜缘上皮铁促增殖作用最强（P＜0．05）。MTT法48h的吸光度值实验组均高于对照组（P＜0．01）。结论：rhEGF对体外培养人角膜上皮细胞有明显促增生作用。     

人表皮生长因子的三种分离方法及其生物学活性

人表皮生长因子(hEGF)是细胞生长因子之一。本文提出了从人尿中分离hEGF的简单、易行的新方法,并与另外二种方法做了比较。其生物活性用角膜组织培养后,能使角膜上皮,前界膜明显增厚,并使角膜固有层的成纤维细胞的数目明显增多。     

人表皮生长因子对兔角膜上皮细胞生长的影响

人表皮生长因子是细胞生长因子之一。应用本室自制的人表皮生长因子加入培养的兔角膜上皮细胞中，观察对角膜上皮细胞生长的影响。结果表明：加入人表皮生长因子的实验组比未加人表皮生长因子的对照组的上皮细胞数目明显增加。本文提出了快速、简单、大量培养上皮细胞的新方法。     

人角膜表皮生长因子受体的表达

目的 了解化学烧伤,角膜炎及眼穿通伤角膜表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）是否表达。方法 对７例化学烧伤,６例角膜穿孔或白斑,６例角膜穿通伤的角膜片做免疫组化。结果 ７眼化学烧伤中仅１眼ＥＧＦＲ阳性表达,其余为阴性;角膜炎６例５例角膜穿透移植,术后角膜透明,视力增加。６例角膜穿通伤全部有ＥＧＦＲ表达。结论 ＥＧＦＲ在角膜的表达有可能对阐明不同疾病的病理过程和评价手术有帮助。     

角膜异物取出术后重组人表皮生长因子的治疗效果分析

目的:探讨角膜异物取出术患者术后使用重组人表皮生长因子的治疗效果。方法:选取2016年1月—2018年4月在我院眼科接受角膜异物取出术治疗的患者130例为观察对象,根据术后治疗方法分组,对照组患者术后常规使用妥布霉素治疗,实验组患者在对照组治疗措施基础上应用重组人表皮生长因子衍生物滴眼液治疗,对比两组的治疗效果。结果:实验组治疗总有效率明显高于对照组(P<0.05);实验组的术后并发症发生率低于对照组(P<0.05),且实验组的角膜缺损愈合时间短于对照组(P<0.05)。结论:角膜异物取出术后使用重组人表皮生长因子治疗有助于减轻患者的畏光、疼痛感,促进角膜缺损的修复愈合,值得推广应用。     

表皮生长因子受体介导的肿瘤靶向基因治疗的一种新策略

目的建立一种针对表皮生长因子受体(EGFR)富集的恶性肿瘤进行靶向基因治疗的方法.方法构建重组真核表达载体pcDNA3.1-PEⅢmut.将组蛋白H1亚基与表皮生长因子C环(H1-EGFc)融合蛋白作为非病毒载体,与pcDNA3.1-PEⅢmut在体外形成复合物.以此蛋白质-DNA复合物分别处理EGFR富集的BT-325和Hela细胞以及EGFR缺乏的JK细胞,并在处理48 h后计算该蛋白质-DNA复合物对各细胞的杀伤率.结果含3 μg DNA的H1-EGFc与pcDNA3.1-PEⅢmut复合物对EGFR富集的BT-325和Hela细胞的杀伤率分别是46.03%和48.12%,但对EGFR缺乏的JK细胞无杀伤作用.结论成功建立了针对EGFR富集恶性肿瘤的靶向基因治疗方法.     

人表皮生长因子对兔用角膜上皮细胞生长的影响

人表皮生长因子是细胞生长因子之一。应用本室自制的人表皮生长因子加入培养的兔角膜上皮细胞中，观察对角膜上皮细胞生长的影响，结果表明：加入人表皮生长因子的实验组比未加人表皮生长因子的对照组的上皮细胞数目明显增加。本文提出了快速、简单，大量培养上皮细胞的新方法。     

人表皮生长因子含量变化与肝病关系的研究

目的研究ｈＥＧＦ含量变化在肝病中的作用和意义。方法采用放免法测定１１０例各型肝病患者血浆ｈＥＧＦ的含量并结合临床资料进行统计分析。结果各肝病组血浆ｈＥＧＦ含量均较对照组明显增高（Ｐ＜０．０１）,组间比较除慢性肝炎轻度组与急性肝炎组无显著性差异外,其它各组间均呈极显著性差异。结论各肝病组ｈＥＧＦ含量变化提示对衡量肝脏受损的严重程度及预后的判断有一定的临床意义     

hEGF cDNA导入培养的人角朊细胞及其表达

目的 观察外源性人表皮细胞生长因子（ｈＥＧＦ）基因导入正常导入正常角朊细胞后,能否表达及分泌ｈＥＧＦ;为深入探讨ｈＥＧＦ的作用机制及临床应用奠定物质基础。方法 脂质体包埋ｈＥＧＦ－ｃＤＮＡ的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈＥＧＦ转染人角朊细胞,经Ｇ４１８筛选,克隆,扩大及传代培养转基因的角朊细胞,特异性ｎｃｏ探针原位杂交显示转基因细胞内的质粒载体,ｈＥＧＦ抗体免疫细胞化学法观察转基因细胞内ｈＥＧＦ的表     

人表皮生长因子真核表达载体的构建

目的：构建人表皮生长因子的真核表达载体。方法：采用RT-PCR扩增人表皮生长因子(hEGF)cDNA基因序列并克隆入PGEM-T载体,再用限制性内切酶切取目的基因,插入pcDNA3．1真核表达载体。结果：重组体经转化E．coli JM109感受态大肠杆菌后可大量扩增,提取重组体进行限制性酶切及PCR可见目的片段。结论：已成功构建hEGF真核表达载体,为进一步研究hEGF的功能奠定了基础。     

血管内皮生长因子在小鼠角膜碱烧伤后修复过程中的作用

目的研究角膜碱烧伤后修复过程中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达.方法在建立体内角膜碱烧伤模型的基础上,主要采用免疫组化和RT-PCR等方法以确定VEGF的表达规律.结果VEGF在正常角膜组织和伤后3 h几乎无表达.碱烧伤后6 h,VEGF开始有明显表达,到伤后12 h达到峰值,然后有所下降,碱烧伤后24 h和48 h表达最低,之后又有一反弹过程,在伤后96 h和192 h达到最高.表达部位主要集中在基质层.结论VEGF在核酸和蛋白质水平上的表达相似,其表达量随时相点的变化呈波动性趋势.体内角膜组织VEGF的表达是网络调控的结果,与眼新生血管存在着时空对应关系.进一步研究角膜创伤后VEGF对其它抑血管因子的调控作用仍是必需的.     

Experimental study on ex vivo retrovirus-mediated aFGF gene transfer therapy in traumatic brain injury

Objective: To explore the effects of ex vivo retrovirus-mediated gene transfer therapy with acidic fibroblast growth factor (aFGF) in the management of traumatic brain injury. Methods: PLXSN-SPaFGF, a recombinant retroviral vector expressing biologically active aFGF was constructed and transfected into cultured embryonic astroglial cells which were injected into the surrounding areas of the contusion in the rat left parietal cortex. From 3 d to 1 month after the implantation, the survival of and aFGF gene expression in the implanted astroglial cells were examined, and neuronal apoptosis and rat motor function impairment evaluated. Results: The implanted aFGF-transduced astroglial cells survived and expressed aFGF mRNA and protein evidently at 3 d after grafting. The number of and aFGF gene expression in the astroglial cells increased remarkebly 7 d and decreased to some extent 1 month after the implantation. There were significant aFGF mRNA and protein expression in the neurons surrounding the contusion at 7 d that decreased to relatively low levels 1 month after the implantation of aFGF-transdued astrocytes. Diminished neuronal apoptosis (P＜0.05) and significantly improved in the previously impaired motor function (P＜0.05) of the rats were observed from 7 d to 1 month after the implantation. Conclusion: This experiment successfully conducted ex vivo aFGF gene transfer therapy in traumatic brain injury which proved to be effective in rescuing injured nerve cell from death and enhancing recovery of neurological deficiency.     

Experimental study of plasmid TGF-β1 DNA gene transfer with lipofectamine into rabbit corneal epithelial cells<Emphasis Type="Italic">in vitro</Emphasis>

To investigate whether the TGF-beta 1 plasmid DNA carried by lipofectamine could be introduced into cultured rabbit corneal epithelial cells, specific expression of the plasmid pMAM TGF-beta 1 in the cultured corneal epithelial cells was studied. Two days after 12 h of transfection of pMAMT-GF-beta 1 mediated by lipofectamine into the cultured corneal epithelial cells, the TGF-beta 1 protein expression specific for pMAMTGF-beta 1 in the cells was detected by means of immunohistochemical staining and the positive rate was 23.37%. The results suggested that foreign plasmid DNA could be effectively delivered into cultured rabbit corneal epithelial cells by means of lipofectamine, and this will provide a promising method of studying TGF-beta 1 on the mechanism of physiology and pathology concerned with corneal epithelial cells.     

表皮生长因子受体靶向RNAi抑制恶性肿瘤中的研究现状

表皮生长因子受体（EGFR）在许多恶性肿瘤中有过度表达或突变的现象,它借助信号转导使细胞的生长失控和恶化,与肿瘤的发生、发展、转移及预后等密切相关。因此,抑制内源性EGFR及其突变体的表达,是有效治疗恶性肿瘤的途径之一。RNAi是一种发展迅速且极有应用前景的基因治疗技术,细胞内存在一个完整的可引发RNA干扰结构,可将EGFR外源性双链RNA裂解成21～23个核苷酸短干扰RNA（SiRNA）,后者可自动杂交同源EGFR的mRNA上并使之降解,从而达到抑制EGFR表达和治疗恶性肿瘤的目的。     

血管内皮生长因子基因防治兔髂动脉狭窄

目的从基因治疗方面探讨解决经皮血管成型术和其他血管再塑引起的血管内膜损伤,血管狭窄途径。方法构建了ｐｃＤＮＡ３／血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）真核表达载体,通过多聚赖氨酸基因球囊法,将ＶＥＧＦ基因定位导入球囊拉伤的兔髂动脉内壁,应用原位杂交,免疫组织化学,电磁血流量仪,扫描电镜和光镜等方法检测ＶＥＧＦ基因作用效果。结果ＶＥＧＦ基因组球囊拉伤血管２周时内膜有大量ＶＥＧＦｍＲＮＡ和蛋白表达,内膜内皮化范围明显大于空载质粒对照组,内膜与中膜面积之比小于对照组,血流量明显改善。结论血管内导入ＶＥＧＦ基因,可促进内皮细胞增生,加速损伤内膜的修复,抑制血管内膜平滑肌细胞的增生,防治血管狭窄     

甲基营养型酵母系统表达的重组人表皮生长因子的纯化及其性质

目的 获得可用于动物试验和临床试验的人表皮生长因子原料药。方法 化学合成的人表皮生长因子基因在甲基营养型酵母中表达并分泌到培养中的人表皮生长因子蛋白经Phenysepharose6Fast Folw(high sub)柱、Q－sepharose High Performance柱、Superdex30柱纯化后进行生物学性质检测。结果 纯化后的蛋白产物纯度达98％、是无热源、无内毒素、无甲基营养性质的重组蛋白。结论 纯化蛋白符合动物试验和临床试验的要求,为制备多种人表皮生长因子制剂进行动物实验和临床试验打下了基础。     

Chemical and enzymatic synthesis and doning of human epidermal growth factor gene

The human epidermal growth factor gene was synthesized with DNA synthesizer andby enzymes.Computer assisted to design the gene sequence and the restriction enzyme sites,andto elhninate the repeated and self-complementary sequences.So that multiple doning and gene ex-pression were available for the designed gene sequence.The whole gene was formed by annealing8 chemically synthesized oligodeoxynucleotide fragments,enzymatically filling up the 4 twenty-basespaces and ligating the nicks,and was inserted into EcoR I and HInc Ⅱ sites ofplasmid pUC12.The recombinant plasmid was transformed into E.coli JM103 and 200 whitedones were obtained by X-gal and ampicilin screening.The positive clones were isolated andcharacterized by restriction enzyme analysis and DNA sequencing.