携人PTHLH基因慢病毒表达载体的构建

目的构建携带人甲状旁腺相关激素（PTHLH）基因的慢病毒表达载体pGC-FU/PTHLH。方法酶切载体pGC-FU,根据人PTHLH基因合成特定引物,扩增目的基因片段,将其克隆到pGC-FU质粒（含EGFP基因）上,菌落PCR鉴定及测序分析重组载体,使用Lipofectamine 2000诱导转染pGC-FU、pHelper1.0和pHelper2.0载体三质粒进入293T细胞包装慢病毒,并用带PTHLH的慢病毒感染293T细胞和鼻咽癌CEN1细胞确认慢病毒包装是否成功。结果菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,与理论预计值阳性转化子735bp,阴性转化子198bp基本相吻合;PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,结果完全匹配,进一步鉴定载体构建成功。分别将质粒包装系统共转染293T细胞,包装产生空白对照慢病毒（pGC-FU）和过表达PTHLH的慢病毒（pGC-FU/PTHLH）;或用携带PTHLH和EGFP基因的病毒上清感染CNE1细胞,48h后,倒置荧光显微镜下观察293T和CNE1细胞,均可见绿色荧光,转染成功。结论成功构建携人PTHLH基因慢病毒表达载体,为进一步研究PTHLH基因在鼻咽癌转移中的作用及鼻咽癌发病分子机制奠定了基础。     

双自杀基因慢病毒转移系统的建立及其对T淋巴细胞的体外杀伤作用

目的利用分子生物学方法构建CD和豫双自杀基因慢病毒转移载体。方法将慢病毒基因转移系统中的3种成分质粒（包膜质粒、包装质粒及目的基因转移质粒）用脂质体共转染人病毒包装细胞293T,荧光显微镜下观察;透射电镜下观察病毒颗粒;大量收集病毒上清,浓缩后用之感染T淋巴细胞,荧光显微镜下观察。结果荧光显微镜观察到对照组大量绿色荧光蛋白（GFP）;透射电镜证实有大量病毒颗粒存在。单独使用前体药物5-氟脲嘧啶（5-FC）和／或无环鸟苷（GCV）后,细胞的存活率与未转染T淋巴细胞比较,差异显著（P〈0．01）,与单独使用5-FC或GCV比较,联合使用5-FC和GCV时T细胞的存活率明显降低（P〈0．01）。结论慢病毒基因转移系统可使双自杀基因发挥强大的杀伤作用,为一种有效的基因转移系统。     

慢病毒载体介导的肝细胞基因转移

慢病毒(lentivirus)具有可以感染低分裂细胞的独特优势,且基因转移效率高,操作相对简便,在多种疾病的基因治疗、转基因动物的制备等方面成为引人瞩目的病毒载体。本文就慢病毒载体(lentiviral vector,LV)的特点、构建、应用,尤其是慢病毒载体对于肝细胞的基因转移进行综述。     

人CDK2基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的： 构建人细胞周期素依赖蛋白激酶2(CDK2)基因RNA干扰慢病毒载体。〖HJ1.8mm〗方法: 利用Invitrogen公司在线软件设计人CDK2（NM001798）shRNA序列，退火形成ds oligo后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端，测序，再与慢病毒载体重组，测序鉴定，在脂质体的介导下将慢病毒的包装混合物和CDK2基因重组慢病毒载体转染293FT细胞，包装成病毒后，收集细胞培养上清液，测定病毒滴度。结果: 测序证实pENTRTM/U6- CDK2-shRNA为阳性克隆，与慢病毒载体重组后测序结果显示也为阳性克隆，CDK2基因重组慢病毒载体传染293FT细胞后48 h, 细胞培养上清液，病毒的滴度为6×108TU/L。结论: 成功构建人CDK2基因RNAi慢病毒载体，为研究CDK2在自身免疫病中的应用提供了稳定的转染细胞载体。     

粒-巨噬细胞集落刺激因子与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体构建

目的：构建粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与绿色荧光蛋白（GFP）融合基因慢病毒载体。 方法： 采用RT-PCR方法获得GM-CSF全外显子片段, 使之克隆到带GFP慢病毒表达载体质粒 FUGW中，经限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体。在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV.△8.9、包膜基因VSVG、目的基因FUGW-GM-CSF导入病毒包装细胞293T，荧光显微镜检测基因的表达，包装成病毒后，收集病毒上清，浓缩，鉴定。用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测转染FUGW-GM-CSF细胞上清液 GM-CSF表达水平，电子显微镜观察293T细胞中的慢病毒。 结果： 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT-PCR获得的GM-CSF/PCR产物与GenBank中的数据完全吻合; GM-CSF准确克隆入FUGW的多克隆位点。慢病毒的3种质粒可高效转染入293T细胞，荧光显微镜下观察可见大量绿色荧光。转染 FUGW-GM-CSF包装细胞上清液 GM-CSF酶联反应阳性。电子显微镜下见慢病毒颗粒位于293T细胞胞浆的内质网中。 结论： 成功构建了GM-CSF与GFP融合基因慢病毒载体，为诱导DC提供了适合的稳定转染的载体。     

大鼠β防御素2基因慢病毒载体的构建及功能检测

目的 构建大鼠β防御素2（rBD2）基因慢病毒表达载体,并转染培养细胞检测其表达,为rBD2研究及大鼠体内实验奠定基础.方法 提取大鼠上皮细胞总RNA,PCR扩增获得rBD2基因,双酶切PCR产物和慢病毒载体Lentivirus[含H1启动子和绿色荧光蛋白（GFP）],连接构成rBD2基因慢病毒表达载体LV-rBD2,行测序鉴定.用慢病毒包装系统对LV-rBD2进行慢病毒颗粒包装并梯度稀释法测定病毒滴度,病毒液感染培养细胞,RT-PCR和Western Blot检测rBD2表达.结果 凝胶电泳和测序结果表明rBD2基因克隆到慢病毒载体中,序列正确.完成慢病毒颗粒包装,调整病毒滴度至1×105ifu/μl.RT-PCR和Western-Blot显示rBD2基因获得表达.结论 rBD2基因慢病毒表达载体LV-rBD2被成功构建,能转染细胞并获得有效表达.     

人EGFL7基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其在人喉癌细胞中的表达

 目的：构建人表皮生长因子样结构域7（epidermal growth factor-like domain 7, EGFL7）基因RNA干扰（RNA interference, RNAi）慢病毒表达载体,并建立稳定干扰EGFL7基因表达的喉癌细胞亚系,为研究EGFL7蛋白在喉癌发生发展中的功能奠定基础。方法：针对人EGFL7基因序列,设计特异性RNAi靶序列,与pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR线性载体定向连接,得到的阳性重组子再与pLenti6.3-MCS/V5-DEST慢病毒载体进行重组,获得真核表达慢病毒干扰载体。在POLOdelivererTM 3000介导下将慢病毒包装质粒和EGFL7基因重组慢病毒载体导入293T细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染人喉癌细胞HEp-2,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰EGFL7基因的细胞亚系。结果：成功构建EGFL7 pLenti6.3-EGFL7-miR真核表达慢病毒干扰载体并获得相应慢病毒,经测定病毒滴度为5×1011 TU/L,实时荧光定量PCR证实pLenti6.3-EGFL7-miR慢病毒载体对喉癌细胞HEp-2 EGFL7基因的沉默效率为97%。结论：成功构建人EGFL7基因特异性的慢病毒干扰载体,并获得EGFL7基因稳定干扰的喉癌细胞亚系。     

组织蛋白酶B-RNAi-LV载体构建及其对小鼠脑微血管内皮细胞系bEND.3的影响

目的 构建组织蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)小RNA（siRNA）慢病毒载体,并探讨其对小鼠脑微血管内皮细胞（bEND.3）的影响。方法 设计并合成含有干扰Cathesin B基因的19 nt的双链寡DNA片段,将此片段克隆到携有绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒表达载体质粒pGCSIL-GFP上,经测序正确后,命名为pGCSIL-GFP-CTSB,将慢病毒表达载体pGCSIL-GFP-CTSB、慢病毒包装载体pHelper1.0和pHelper2.0 3质粒共同转染于293T细胞,获得携带Cathepsin B基因的 RNAi慢病毒（Cathesin B-RNAi-Lentivirus,即CTSB-RNAi-LV）,通过Real time-PCR和Western blotting方法观察CTSB-RNAi-LV对bEND.3的影响。结果1.pGCSIL-GFP-CTSB中携带有正确的Cathesin B siRNA基因;2.目的基因Cathepsin B siRNA被RNAi慢病毒高效地转导入靶细胞bEND.3内,并达到稳定的表达;3.CTSB-RNAi-LV能有效降低bEND.3中Cathepsin B mRNA和蛋白表达。结论成功构建了RNAi慢病毒载体pGCSIL-GFP-CTSB;并成功包装了RNAi慢病毒CTSB-RNAi-LV;CTSB-RNAi-LV能有效地抑制bEND.3中Cathepsin B mRNA和蛋白表达水平下调。     

EZH2基因RNAi慢病毒载体的包装及鉴定

目的 外周T细胞淋巴瘤（PTCL）源于成熟的胸腺后淋巴细胞,是一类少见的生物学行为及临床表现均高度异质性的疾病,且预后差.包装zeste基因增强子同源物2（EZH2）RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,可为今后相关实验研究奠定基础.方法 靶向EZH2基因的短发夹RNA（EZH2-shRNA）质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒三质粒系统共转染293T细胞,进行慢病毒包装.病毒载体感染Hut78细胞后,观察感染效率,并用反转录定量PCR（RT-qPCR）和Western Blot检测EZH2mRNA和蛋白表达水平.结果 成功包装了慢病毒表达载体,对Hut78细胞的感染效率在95％以上.RT-qPCR和Western Blot检测结果显示,EZH2基因在靶细胞中的表达水平降低.结论 成功包装并鉴定了EZH2基因RNAi慢病毒表达载体.     

慢病毒载体及其应用进展

慢病毒载体具有可感染分裂细胞及非分裂细胞,转移基因片段容量较大,目的基因表达时间较长,不易引发宿主免疫反应等诸多优点,因此,慢病毒载体已成为基因治疗中载体研究的热点.我们以HIV-1来源的慢病毒载体为代表综述了慢病毒载体的结构特点,发展,及其应用研究进展.     

腺病毒载体,腺病毒相关病毒载体与基因治疗

近年来，腺病毒载体（ＡＶ），腺病毒相关病毒载体（ＡＡＶ）已经成为继反转录病毒载体（ＲＶ）以来最重要的病毒载体。与反转录病毒载体相比较，ＡＶ有其独特的优点，构建带有目的基因的腺病毒载体通过２９３辅助细胞产生重组腺病毒颗粒，用于活体基因转移及靶细胞感染。目前已利用ＡＶ研究了ｎｅｏ，ｌａｃＺ，ＨＢｓＡｇ及ＣＦＴＲ等基因在不用组织中的表达，其中人们已利用ＣＦＴＲ基因通过ＡＶ介导对囊性纤维化进行基因治疗临床     

人树突状细胞SOCS1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建人树突状细胞（hDCs）信号传导通路抑制因子1（SOCS1）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体。方法根据人树突状细胞SOCS1基因（NM-0037）,筛选出一个靶序列,设计并合成包含正反义靶序列的互补单链寡核苷酸,与经BamH和Xho酶切后的慢病毒载体质粒pRNA-Lenti-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）（含U6启动子和EGFP）连接产生pRNA-Lenti-SOCS1-EGFP慢病毒重组质粒,与慢病毒包装混合物共转染293T细胞,包装产生慢病毒,收集病毒上清,采取系列稀释法测定慢病毒滴度。然后转染hDCs,通过荧光显微镜观察细胞转染情况,利用荧光实时定量PCR和Westernblot检测干扰组、阴性对照组、空白对照组SOCS1的表达情况。结果将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功。荧光实时定量PCR及Westernblot检测显示慢病毒重组质粒感染hDCs后,与空白对照组及阴性对照组比较,siRNA组mRNA和SOCS1蛋白的表达量显著降低,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论构建的pRNA-Lenti-SOCS1-EGFP慢病毒载体可有效地抑制hDCs的SOCS1的表达,为进一步研究DCs增强抗肿瘤免疫应答效应奠定基础。     

血管生长素-1基因慢病毒载体的构建及其在间质干细胞的表达

目的： 构建带有血管生长素-1（Ang-1）基因的慢病毒载体并实现该基因在大鼠骨髓间质干细胞（rMSCs）中的表达。方法： RT-PCR获得大鼠Ang-1基因，限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒PNL-Ang-1-IRES₂-EGFP，在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒颗粒并感染rMSCs。 PCR检测Ang-1基因的插入，细胞RT-PCR检测Ang-1 mRNA表达，免疫细胞化学和Western blotting检测Ang-1蛋白的表达。结果： 所获Ang-1基因经测序证实与GenBank报道的序列一致。慢病毒载体质粒PNL-Ang-1-IRES₂-EGFP经SalⅠ和BamHⅠ双酶切后电泳显示 1 512 bp Ang-1目的基因片段和10.5 kb PNL-IRES2-EGFP载体片段。病毒基因组PCR证实Ang-1基因插入。荧光显微镜观察到EGFP表达。细胞RT-PCR检测到Ang-1 mRNA表达。免疫细胞化学和Western blotting检测到Ang-1蛋白表达。结论： 成功构建带有Ang-1基因的慢病毒载体并实现在rMSCs中的表达，为Ang-1基因修饰干细胞的应用研究奠定了基础。     

一种新型慢病毒载体制备体系的改进

目的完善已初步建立的以痘病毒为辅助病毒的慢病毒载体（LV）瞬时制备体系。方法通过同源重组质粒pZIPPY-NEO/GUS,将vTF7-3痘病毒D13L基因的ORF通过同源重组被新霉素基因（neo）以及可视性筛选基因（GUS）替代,制备D13L缺陷性痘病毒（vTF7-3-ΔD13L）。结果经RT-PCR鉴定,D13L基因被完全敲除。制备体系中将vTF7-3-ΔD13L代替vTF7-3后,制备体系培养上清经RT-PCR、Western blotting分别检测到慢病毒载体特异性RNA序列以及特征性p24蛋白的存在,提示系统可以正常制备出慢病毒载体颗粒,并进一步评价了慢病毒载体的感染性。此外,对此系统的动力学特征也进行了初步分析。结论 vTF7-3-ΔD13L制备成功,通过此系统可制备出没有复制性痘病毒污染的慢病毒载体,本研究为该系统的大规模应用奠定了客观基础。     

用慢病毒载体介导的RNAi感染CB3细胞后抑制FLI-1的表达

 【摘要】目的 观察慢病毒载体介导的RNA干扰(RNA interference, RNAi)方法对小鼠红白血病细胞（CB3）中FLI-1（Friend leukemia integration-1,FLI-1）基因表达的抑制作用,以为后续实验提供有力的技术支持。方法 设计制备针对目的基因FLI-1的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA),构建制备目的基因的siRNA慢病毒载体,PCR阳性菌落进行测序鉴定,对慢病毒包装与滴度测定后感染CB3细胞,观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达情况。RT-PCR和Western blot检测病毒感染CB3细胞后FLI-1的表达。结果 成功构建了针对FLI-1基因的siRNA慢病毒载体,并包装成慢病毒颗粒,病毒滴度为1.5E+9TU/ml,并可将其高效感染CB3细胞,病毒感染后FLI-1在转录水平和翻译水平的表达量显著低于对照组和未感染病毒组（P<0.001）。结论 成功构建了针对FLI-1基因的siRNA慢病毒载体,并可有效抑制CB3细胞中FLI-1基因的表达,为后续实验提供稳定的感染细胞载体。     

携带甲胎蛋白基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对靶基因的沉默效率

目的构建携带甲胎蛋白（AFP）基因小干扰RNA（siRNA）的慢病毒载体并转染肝癌细胞,评价其对AFP基因的沉默效率。方法设计和构建针对AFP基因的阳性siRNA及不针对任何已知基因的阴性siRNA,将其分别插入携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组慢病毒载体,然后转染到表达AFP基因的人肝癌细胞HepG2并筛选阳性表达细胞株,分别为慢病毒转染阳性siRNA组和慢病毒转染阴性siRNA组。同时设立脂质体转染阳性siRNA组、脂质体转染阴性siRNA组以及加AFPsiRNA而未用转染试剂的siRNA组、空白对照组。荧光显微镜观察评估转染效率,荧光定量PCR和免疫印迹法检测各组HepG2细胞APFmRNA及蛋白的相对表达量,比较不同转染方法对AFP基因表达的抑制率。结果慢病毒能够有效地转染siRNA到HepG2细胞内。荧光定量PCR显示慢病毒转染siRNA对AFPmRNA表达的抑制率显著高于脂质体转染siRNA（92．1％比74．3％,P〈0．05）。免疫印迹亦显示慢病毒转染siRNA对AFP蛋白表达的抑制率显著高于脂质体转染siRNA（88．2％比63．7％,P〈0．05）。结论慢病毒转染AFPsiRNA能够更有效地抑制HepG2细胞内AFP基因表达。     

RNA干扰MEX3A基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制MEX3A基因表达对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响。 方法 应用GV115载体构建针对MEX3A基因的shRNA慢病毒载体,转染包装细胞293T产生慢病毒颗粒,收集并滴度测定后转染5637膀胱癌细胞,实验组转染MEX3A-shRNA慢病毒,对照组转染阴性对照慢病毒;实时定量PCR（Real-time PCR）检测MEX3A基因敲减效率;慢病毒转染3 d后,使用Celigo连续细胞计数5d检测细胞生长;慢病毒转染5d后,进行膜联蛋白V（Annexin V）染色并用流式细胞术检测细胞凋亡。 结果 成功构建MEX3A-shRNA慢病毒载体以及稳定抑制MEX3A表达的细胞株,MEX3A基因敲减效率达到74%;Celigo细胞计数检测显示,与对照组相比,实验组5637细胞的增殖速率受到显著抑制;流式细胞术检测显示,实验组发生凋亡的5637细胞显著增加。 结论 MEX3A基因促进膀胱癌细胞的增殖,抑制膀胱癌细胞的凋亡。     

慢病毒载体介导RNA结合蛋白-5对肺腺癌细胞系H1299的增殖和凋亡的影响

目的 探讨慢病毒载体介导RNA结合蛋白-5（QKI-5）对肺腺癌细胞凋亡的影响。方法 应用GV358（过表达）和GV248（抑制表达）载体分别构建针对QKI-5基因的慢病毒过表达载体和抑制表达载体,转染293T细胞产生慢病毒颗粒,收集并测定慢病毒滴度。将经测序鉴定的QKI-5过表达的慢病毒或抑制表达的慢病毒转染到肺腺癌细胞H1299,Real-time PCR检测QKI-5 mRNA表达,集落形成实验检测H1299细胞增殖情况,膜联蛋白V（annexin V）、碘化丙啶（PI）检测H1299细胞凋亡情况,Western blotting检测促凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-8表达。结果 成功构建QKI-5过表达慢病毒载体和抑制表达慢病毒载体,与对照组比较,QKI-5过表达后,QKI-5 mRNA表达增加,细胞集落形成减少,肺腺癌细胞早期凋亡增加,促凋亡蛋白Caspase-8表达增加;QKI-5抑制表达后,QKI-5 mRNA表达降低,细胞集落形成增加,但肺腺癌细胞凋亡无明显变化,然而促凋亡蛋白Caspase-8表达减少。结论 慢病毒介导 QKI-5抑制增殖,可能通过Caspase-8促进肺腺癌细胞系H1299的凋亡。     

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及表达性能鉴定

为了进一步探讨EB（Epstein Barr）病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）的作用机制及其功能，我们构建了EDL2-N-LMP-慢病毒载体，并对所构建的EDL2-N-LMP-慢病毒载体结构及表达进行鉴定。     

携带人Sox2和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的构建携带人Sox2和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUSGW。方法XhoⅠ线性化pLenti-EF1a-Sox2-IRES-EGFP,回收片段并补平XhoⅠ切口,接着BamHⅠ酶切该片段,回收2.356kb片段而获连接用Sox2-IRES-EGFP;EcoRⅠ线性化pFUGW,回收并补平EcoRⅠ切口,然后BamHⅠ酶切该片段,回收9.174kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒（TaKaRa）中的SolutionⅠ将其与连接用Sox2-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定。所构建载体命名为pFUSGW。获pFUSGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带Sox2和EGFP基因的慢病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）、人胚肺成纤维细胞（HLFs）和人神经胶质瘤细胞（U87）以建立相应病毒感染体系。结果酶切证实成功构建了pFUSGW,按标准程序生产的携带Sox2和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染MEFs、HLFs及U87。结论成功构建携带人Sox2和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUSGW,为相关后续的研究打下了良好的基础。