流式细胞术及其在细胞凋亡检测中的应用

流式细胞术是采用流式细胞仪对单个细胞或其他生物微粒进行快速定性、定量分析与分选的一门技术.它不仅快速、灵敏和准确,而且还具有客观、直接和同时进行多参数检测的优点.细胞在凋亡时产生的一系列形态学、生物化学及分子生物学性质的变化,包括细胞皱缩,核染色质凝聚,细胞膜通透性改变,诱导蛋白酶凋亡分子激活,线粒体跨膜电位降低,膜磷酯酰丝氨酸外化,胞质Ca2+浓度升高,DNA片段化及含量变化等特点,进行定性、定量测试分析,从而实现对细胞凋亡的准确测定.     

流式细胞术的基本原理

流式细胞术的基本原理雷松魏于全华西医科大学附属第一医院肿瘤生物治疗研究中心流式细胞术在医学上的应用编者按：流式细胞术（Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）是利用流式细胞仪对生物颗粒，例如细胞、微生物等的多种物理和生物学特性进行定量分析，并可以对特定细...     

姜黄素诱导K562细胞凋亡及其对细胞周期各时相影响

目的 探讨姜黄素诱导人红白血病细胞（K562）凋亡机制及其对细胞周期各时相变化。方法 应用噻唑蓝（MTT）比色法和流式细胞术检测不同浓度的姜黄素对K562细胞增殖抑制率。细胞周期及凋亡率变化，并通过电子显微镜观察其亚细胞结构改变。结果 姜黄素对K562有明显的增殖抑制作用，且呈剂量依赖性，流式细胞术结果显示，G1期细胞增多，S期细胞减少，G2／M期细胞相对增多，电子显微镜结果显示，细胞空化，线粒体肿胀，染色质趋边凝集。结论 姜黄素对K562细胞有明显的抑制作用，阻止G1期细胞向S期细胞转化进程，诱导K562细胞凋亡。     

小鼠颞叶缺血再灌注后海马CA1区细胞凋亡及行为学实验研究

目的：探讨颞叶海马CA1区神经细胞凋亡在全脑缺血再灌流不同时间的变化规律及行为学改变。方法：在小鼠双侧颈总动脉阻断再灌流后1、3、7d及2、4、6周取海马CA1区脑组织，采用原位末端标记，流式细胞仪对凋亡细胞进行定性、定量分析，并进行行为学（包括卒中指数及神经病学症状）评分。结果：实验组术后第1天卒中指数及神经病学评分明显高于对照组（P＜0．05），细胞凋亡存在于正常颞叶CA1区神经细胞中，在缺血再灌流1d后，神经细胞凋亡开始增加，3d达最高峰，与对照组存在明显差异（P＜0．01）。结论：细胞凋亡存在于正常颞叶CA1区神经细胞内，细胞凋亡是缺血再灌流后颞叶CA1区神经细胞主要死亡形式。     

Rubratoxin B 诱导人绒癌细胞株凋亡及Bcl-2 mRNA 表达的研究

目的:定量分析rubratoxin B(RB)在体外诱导人绒癌细胞株(BeWo)发生凋亡,并探讨其与抑制凋亡基因Bcl-2mRNA表达的关系。方法:利用MTT、HE染色、annexinV-FITC/PI流式细胞技术定性及定量分析经RB处理后BeWo细胞活细胞及凋亡细胞的变化情况;利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测抑制凋亡基因Bcl-2与RB诱导的BeWo细胞凋亡的关系。结果:RB诱导BeWo细胞凋亡的数量与药物浓度及用药时间明显相关。RT-PCR结果显示Bcl-2mRNA的表达随着凋亡细胞的增加而减少。结论:RB能够诱导BeWo细胞发生凋亡,Bcl-2mRNA表达的下调是RB诱导BeWo细胞凋亡的重要机制。     

流式细胞术在细胞凋亡研究中的应用

细胞凋亡的探索已是当前肿瘤治疗研究中的热点，流式细胞术做为一种简捷的研究手段已得到广泛的应用。本文主要对流式细胞术目前在凋亡的确认、鉴别及有关性质方面的研究中的应用做一介绍。     

熊果酸诱导结肠癌HT-29细胞凋亡与凋亡相关基因的关系

目的：体外实验探讨熊果酸诱导结肠癌HT-29细胞凋亡的可能性，揭示该凋亡发生与其相关基因之间的关系。方法：采用四甲基偶氮唑蓝比色、TUNEL法、流式细胞术检测熊果酸对结肠癌HT-29细胞的增殖抑制与杀伤作用；应用免疫组织化学SP法检测凋亡相关基因caspase-9、bcl-2、bax的表达。结果：熊果酸在体外对HT-29细胞有中度增殖抑制效应，在熊果酸作用下，HT-29细胞出现显著的细胞凋亡征象，TUNEL法显示细胞固缩，核染色质聚集或断裂，形成凋亡小体。流式细胞术检测在G1期之前出现sub-G1峰，凋亡率最高为11．63％，熊果酸的作用具有浓度和时间依赖性。在HT-29细胞凋亡过程中，凋亡相关基因caspase-9、bax的表达增强，bcl-2的表达减弱。结论：熊果酸在体外对结肠癌HT-29细胞有诱导凋亡作用，而caspase-9和bax的表达增强，bcl-2的表达减弱可能是其作用机制之一。     

流式细胞术在细胞凋亡研究中的应用

细胞凋亡的探索已是当前肿瘤治疗研究中的热点，流式细胞术做为一种简捷的研究手段已得到广泛的应用。本文主要对流式细胞术目前在凋亡的确认、鉴别及有关性质方面的研究中的应用做一介绍。     

氨茶碱对淋巴瘤细胞系增殖与凋亡的影响及机制探讨

为探讨磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）抑制剂在淋巴瘤细胞增殖与凋亡中的作用及机制，研究了非选择性PDE抑制剂氨茶碱（aminophylline，AM）对Burkitt淋巴瘤细胞系Raji的影响。采用MTT检测，光学显微术，电镜术及膜联蛋白V染色观察细胞增殖、细胞凋亡的形态学变化及凋亡率；用流式细胞术和RT-PCR技术检测细胞周期，周期蛋白B1和Bcl-2的表达及线粒体跨膜电位的变化。结果显示，氨茶碱对Raji细胞增殖呈浓度依赖性抑制作用；形态学观察发现随氨茶碱浓度增加，细胞体积明显缩小，核固缩，核染色质核膜下聚集，出现凋亡小体；细胞涂片显示，核染色质凝聚、核碎裂；电镜观察有典型凋亡细胞；膜联蛋白V染色显示氨茶碱诱导Raji细胞凋亡率增加，线粒体跨膜电位（Δφm）呈浓度依赖性下降；流式细胞术及RT-PCR显示氨茶碱下调Bcl-2蛋白及mR-NA的表达；细胞周期分析显示经氨茶碱处理的细胞出现S期阻滞、细胞周期蛋白B1表达下调。结论：氨茶碱可通过S期阻滞抑制细胞增殖、下调Bcl-2的表达及降低线粒体膜电位而诱导Raji细胞凋亡。     

流式细胞仪对凋亡细胞作用的研究

流式细胞术可用于检测细胞凋亡和测量细胞凋亡过程中细胞内发生的变化。本综述介绍调亡细胞的几种荧光染色和细胞凋亡分析的方法。同时 ,从肿瘤细胞凋亡、抗凋亡蛋白及肿瘤患者淋巴细胞凋亡的研究中探讨了细胞凋亡的临床应用     

姜黄素诱导Jurkat细胞凋亡机制的实验研究

目的 探讨姜黄素对Jurkat（人T淋巴细胞白血病细胞株）细胞增殖抑制率及细胞周期各时相的变化和亚细胞结构改变。方法 应用MTT（噻唑蓝）比色法流式细胞术、电子显微镜技术检测姜黄素对Jurkat细胞的增殖抑制率，细胞周期进程及凋亡率。结果 姜黄素对Jurkat细胞有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性，流式细胞仪分析，G1期细胞增高，S期细胞减少，G2／M期细胞相对增多，凋亡率增加。亚细胞结构，细胞空化，染色质趋边凝集。结论 姜黄素能显著抑制Jurkat细胞增殖，阻止G1期细胞向S期转化进程。促进Jurkat细胞凋亡。     

流式细胞术检测HIE后脑皮质细胞凋亡

目的：探讨脑皮质细胞凋亡在新生猪缺氧缺血性脑病（ＨＩＥ）发生与发展。方法：应用流式细胞术（ＦＣＭ）、ＤＮＡ凝胶电泳对新生猪ＨＩＥ脑皮质细胞凋亡进行定量分析。结果：缺氧缺血后７２小时新生猪左额顶大脑皮质细胞凋亡率较对照组明显增加（ｎ＝１５,１２;ｍａｉｎ±ｓ％＝２６１８±１６３５,３２３±２９３;Ｐ＜００００１）;ＤＮＡ凝胶电泳显示明显“ＤＮＡＬａｄｄｅｒ”。结论：脑皮质细胞凋亡在患ＨＩＥ新生动物的迟发性神经细胞损伤中占有重要地位。     

三氧化二砷对宫颈癌Hela细胞体外生长的影响

目的研究三氧化二砷(AsO3)对人宫颈癌Hela细胞的体外生长的影响，初步探讨其作用机制。方法MTT比色法检测细胞生长抑制作用。光镜下观察细胞凋亡形态学的变化。流式细胞术检测各期细胞分布及细胞凋亡率。结果三氧化二砷能以浓度依赖和时间依赖方式显著抑制Hela细胞生长，阻滞Hela细胞于C2／M期，并诱导凋亡。结论三氧化二砷可显著抑制Hela细胞的体外生长，诱导凋亡可能是其作用机制之一。     

榄香烯诱导人卵巢癌细胞COC1细胞凋亡的研究

目的：探讨榄香烯对人卵巢癌COC1细胞凋亡的诱导作用。方法：采用Hoechst33258和PI荧光染色法、DNA电泳及流式细胞术分析法，检测榄香烯对COC1细胞的作用。结果：经榄香烯处理的COC1细胞出现核固缩，胞浆凋亡小体形成，琼脂糖凝胶电泳呈现出细胞凋亡特征性的DNA状带。凋亡细胞发生率与药物浓度和作用时间呈正相关。结论：榄香烯对肿瘤细胞的杀伤作用主要是通过诱导细胞凋亡。     

三氧化二砷对类风湿性关节炎滑膜细胞凋亡影响的体外研究

目的 类风湿性关节炎(Rheumatoid arthrithis,RA)滑膜细胞体外原代培养并传代至第三代,定量分析三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)对滑膜细胞凋亡诱导作用.方法 双酶消化法体外传代人关节滑膜细胞.采用3代滑膜细胞;应用MTT、流式细胞术对BA滑膜细胞凋亡进行分析.结果 ①MTT法显示不同浓度的As203作用48 h后,能够抑制BA滑膜细胞增殖,且在10～80 μmol/L浓度范围内其抑制作用呈剂量依赖性.②流式细胞仪检测发现不同浓度的As2O3作用48 h后,RA滑膜细胞发生不同比率凋亡,并且在10～80 μmol/L浓度范围内其作用呈剂量依赖性.结论 不同浓度的As2O3作用48 h后RA滑膜细胞均发生凋亡并且呈剂量依赖性.     

浸润淋巴细胞凋亡诱导大鼠肝移植耐受

目的观察移植术后大鼠肝脏内不同细胞成分的凋亡现象，寻找耐受过程中的关键细胞成分，探讨大鼠肝移植耐受机制。方法分离肝脏间质细胞，流式细胞仪检测移植术后大鼠肝脏内不同细胞成分的凋亡现象。结果BN→LEw组大鼠移植肝脏在术后早期发生急性排斥反应，并且移植物内间质细胞存在大量的凋亡，急性排斥反应评分及细胞凋亡指数逐渐升高，术后7d达到高峰随后下降，前者术后28d与术前无明显差异（P〉0.05）；细胞凋亡指数至术后28d较术前仍有明显差异，明显高于LEw→LEw组（P〈0.05）。移植物内发生凋亡的细胞为来自于受体的浸润T淋巴细胞。结论移植物排斥反应评分下降与移植肝脏内CTL清除有关，来源于受体的浸润T淋巴细胞凋亡导致移植肝脏免疫耐受。     

IL-15对MDS患者CD34+细胞诱导增殖分化和抗凋亡作用

为了研究IL—15对体外培养的MDS CD34^＋细胞诱导增殖分化及凋亡的抑制作用，应用MACS免疫磁珠分离系统分离高富集度MDS CD34^＋细胞，建立以造血生长因子为基础的体外培养体系，用不同浓度的IL-15作用于MDS CD34^＋细胞，采用流式细胞术检测和免疫细胞化学染色等方法观察培养后的细胞表面抗原表达、细胞周期、凋亡指数及细胞形态的变化情况，并进行了定量分析。结果表明，MDS CD34^＋细胞经IL—15作用后，MDS CD34^＋细胞出现明显增殖和分化，细胞周期变异，增殖指数和细胞计数增加，形态学向成熟转化，实验组各表面抗原水平CD71、CD33和CD19均较对照组为高，细胞凋亡率则较对照组下降。结论IL—15对MDS CD34^＋细胞有一定的诱导增殖分化和抗凋亡作用，在MDS治疗方面可能有一定的应用前景。     

苦参碱诱导骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的：探讨苦参碱对人骨肉瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡作用。方法：将不同浓度的苦参碱作用于培养的OS732骨肉瘤细胞，通过MTT比色法、流式细胞仪和DNA凝胶电泳、电子显微镜技术观察检测细胞凋亡，研究分析其对骨肉瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡作用。结果：苦参碱浓度为0．5、1．0、1．5g／l时，细胞毒性指数分别为12．1％、21．6％、39．5％；流式细胞术示骨肉瘤细胞的凋亡率分别为9．8％、16．9％、25．5％；DNA电泳见DNA“梯形”图谱；电镜显示细胞的凋亡形态。结论：苦参碱能显著抑制OS732细胞增殖、促进其凋亡。     

5，7-二甲氧基白杨素对体外培养人宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响

[目的】观察5,7-二甲氧基白杨素（dMchR）对体外培养人宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响。【方法】运用A0／EB荧光双染色法观察HeLa细胞凋亡形态;采用PI单染流式细胞术检测HeLa细胞凋亡率;运用FITC荧光标记流式细胞术分析HeLa细胞的Bcl-2,Bax蛋白的表达。【结果]dMChR能有效地诱导HeLa细胞凋亡;dMChR能下调HeLa细胞的Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达,且呈浓度依赖性变化。【结论]dM—ChR具有诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡作用,这种作用与上调细胞Bax／Bcl-2比值有关。     

神经生长因子对新生的大鼠小脑皮质神经细胞凋亡的影响

目的：探讨神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对小脑皮质神经元凋亡的影响，为临床治疗小脑变性疾病的提供新的措施。方法：实验于2001-12／2003-03在锦州医学院科技楼实验室完成。以原代培养的新生SD乳鼠小脑皮质细胞建立谷氨酸诱导的神经细胞凋亡模型。通过流式细胞术检测神经细胞凋亡率；利用光学显微镜技术观察细胞凋亡的形态学改变。结果：谷氨酸(500μmol／L)作用5min可诱导小脑神经细胞凋亡。应用流式细胞仪检测发现受损细胞在G1峰前出现一个G1亚峰，凋亡细胞所占比例为50．2％及45．7％，通过荧光染色观察发现模型组细胞核出现染色体聚集，凋亡小体形成等形态学变化。流式细胞仪检测结果显示模型组与正常对照组亦有明显差异，光学和荧光显微镜观察发现受损细胞的形态学变化也得到明显改善。结论：外源性NGF能够减轻大鼠小脑皮质神经细胞凋亡。