悬浮芯片技术在生物医学领域中的应用

Luminex悬浮芯片技术是美国Luminex公司在20世纪90年代中期开发的一种多功能的液相芯片分析平台,也称xMAP (flexible multiple-analyte profiling)、多功能悬浮点阵(multi-analyte suspension arrays,MASA)或液体芯片(liquidchip).它有机地整合了有色微球(color-coded microspheresor beads)、激光技术、最新的高速数字信号处理和计算机技术,集中了分子生物学、免疫学、高分子化学、激光物理学、微流体学和计算机科学等多门学科,使得Luminex悬浮芯片技术的检测特异度和灵敏度得到了前所未有的发展.     

多种呼吸道病原微生物快速筛查技术的建立

目的解决临床急性呼吸道感染病原微生物快速筛查诊断的难题,建立一种能同时快速检测多种病原体的有效方法。方法采用多重PCR与Luminex xMAP多重分析技术平台相结合,以荧光微球为检测载体,建立快速、多重检测DNA或RNA技术平台。结果经14种(18个亚型)常见呼吸道病原微生物标准株检测,在反应体系中多重PCR产物只与相应的病原菌检测微球杂交,无非特异性反应;通过138例临床标本检测验证,肺炎患者支气管肺泡灌洗液标本中,细菌检出率占总病原微生物的37.68%,其中结核分枝杆菌占18.84%;病毒检出率占总病原微生物的44.93%,支原体、衣原体占17.39%;患者支气管肺泡灌洗液和鼻咽拭子标本中流感病毒A型的检出率分别为18.75%和26.92%。结论多重检测技术平台对急性呼吸道感染疾病的病原微生物快速检测具有实用价值,尤其在解决流行病病原学分析方面具有重要意义。     

常见7种食源性致病菌xMAP液相芯片快速筛查方法的建立及应用

目的采用xMAP液相悬浮芯片检测方法,建立一管同时检测金黄色葡萄球菌、沙门菌、副溶血弧菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157∶H7、创伤弧菌和空肠弯曲菌的快速筛查方法。方法根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌肠毒素nuc基因、沙门菌侵袭性基因ssaR、副溶血弧菌通用基因toxR、单增李斯特菌的hlyA基因、大肠杆菌O157∶H7的rfbE基因、创伤弧菌的vvh基因和空肠弯曲菌的gyrA基因,设计特异性引物和探针,利用上游引物和生物素标记的下游引物对7个靶序列进行不对称实时PCR扩增,7重实时PCR扩增产物和制备的7种偶联探针的微球在同一体系中进行杂交,最后利用藻红蛋白和生物素的亲和作用报告荧光,从而建立7种食源性致病菌的xMAP液相悬浮芯片检测法。结果 xMAP液相悬浮芯片体系检测140株菌株,均出现特异性荧光中值信号,7种食源性致病菌检测互不干扰。DNA和菌液检出限分别为1～100ng和105～108cfu/ml对56份各类食品标本进行检测,检出金黄色葡萄球菌2份、沙门菌4份、副溶血弧菌7份、单增李斯特菌1份、创伤弧菌3份,未检出大肠杆菌O157∶H7和空肠弯曲菌,此结果与传统方法分离结果相一致。结论xMAP液相悬浮芯片技术从样品处理到检测结果需3.5h左右,该方法可应用于食品安全风险监测中食源性致病菌的快速筛查和食源性致病菌的分型鉴定。     

应用压电基因传感器芯片检测结核分枝杆菌DNA

目的 由结核分枝杆菌引起的医院感染快速诊断问题已为越来越多的研究者所重视，压电基因传感器芯片技术主要依据晶体液相振荡理论，运用压电传感器与基因芯片技术结合，对标本中靶基因进行检测。方法 使用压电基因传感器芯片技术检测结核分枝杆菌ＤＮＡ。先以结核分枝杆菌ＤＮＡ探针结合在基因芯片表现，然后将１０６例结核患者标本ＤＮＡ分别与之杂交，将杂交信号通过数频处理器以频率变化值的形式输入电脑，再以专用分析软件进行结果分析。结果 检测阳性率为４２．５％，以ＰＣＲ扩增法及涂片法对相同标本进行检测，阳性率分别为３６．８％和１７．０％，同时对压电基因传感器芯片技术的特异性及灵敏度进行检测。结论 实验结果表明压电基因传感器芯片技术是一种比ＰＣＲ扩增法更简便、快速的结核分枝杆菌检测方法。     

Xpert MTB/RIF检测技术在结核病患者痰标本中的应用价值分析

目的评价Xpert MTB/RIF技术对临床标本中结核分枝杆菌及利福平耐药检测的应用价值。方法对80份痰标本采用Xpert MTB/RIF系统进行结核分枝杆菌与利福平耐药基因rpoB的突变检测,以培养结果及表型药敏试验为金标准,判断Xpert MTB/RIF检测的敏感度、特异度、95%CI。结果对临床确诊为结核病患者的80份临床标本中,Xpert MTB/RIF系统的结核分枝杆菌阳性检出率为76.2%;42份培养阳性标本中,Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌的敏感度为97.6%;38份培养阴性标本中,Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌的敏感度为52.6%;以传统表型药敏试验为金标准,采用Xpert MTB/RIF系统行利福平耐药性检测的敏感度为95.4%,特异度为95.1%。结论 Xpert MTB/RIF是一种简便、快速、准确,且能够同时对结核临床标本行结核分枝杆菌检测与利福平耐药性检测的分子检测技术,对及时发现病情与耐药结核病患者诊断具有重要价值。     

聚合酶链反应鉴定结核分枝杆菌常用靶基因序列的研究进展

分枝杆菌种类繁多,至今已发现有150余种,包括结核分枝杆菌复合群、麻风分枝杆菌以及非结核分枝杆菌,而结核分枝杆菌复合群是引起人类结核病的主要病原菌。分子生物学技术的发展为实现结核分枝杆菌的快速鉴定提供了方向,建立了各种以核酸序列为靶基因,如IS6110、16S rRNA、16S-23S rRNA ITS、hsp65、rpoB和gyrB等的快速鉴定方法。本文对聚合酶链反应(PCR)检测方法中鉴定结核分枝杆菌常用靶基因序列鉴定方法的敏感度和特异度研究进展进行综述。     

结核分枝杆菌部分耐药相关基因的突变特点

目的 分析结核分枝杆菌耐药相关基因的突变特点,评价DNA序列分析用于结核分枝杆菌快速耐药性检测的应用价值.方法 利用DNA序列分析检测结核分枝杆菌的katG、rpoB和gyrA基因片段.结果 86.81%(79/91)异烟肼耐药株存在katG基因的点突变和/或单碱基插入,最常见的突变形式为R463L,占76.92%(70/91).90.38%(94/104)的利福平耐药株在rpoB基因耐药决定区(RRDR)发生突变,突变类型有26种,涉及11种氨基酸,突变集中在密码子第507～533位.70.49%(86/122)氧氟沙星耐药株在gyrA基因耐药决定区(QRDR)发生突变,突变主要形式为A90V、D94Y、D94N、D94H及S91P.结论 耐药相关基因突变的检测,可作为临床快速检测结核分枝杆菌耐药性的方法之一.     

TaqMan MGB双探针实时PCR快速检测结核分枝杆菌rpoB基因多位点突变方法的建立

目的建立快速、灵敏的检测结核分枝杆菌rpoB基因常见突变位点的新方法。方法采用TaqMan小沟结合物(MGB)探针技术,检测146例活动性肺结核患者和35例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况,测序方法为参考方法。结果146例活动性肺结核患者痰标本中,双探针方法检出阳性118例,其中rpoB基因突变56例,与测序方法比较符合率100.0%;35例非结核性肺部疾病患者痰标本双探针方法检测均为阴性,特异性100.0%;该方法最低检出下限为1×103拷贝/ml。结论TaqMan MGB双探针方法能快速、准确地检测结核分枝杆菌rpoB基因位点突变情况,适用于临床对耐药结核分枝杆菌的快速诊断。     

MPT抗原阴性的结核分枝杆菌复合群临床分离株mpt64突变特征分析

目的 分析MPT抗原阴性的结核分枝杆菌复合群临床分离株mpt64突变特征。 方法 收集湖南省胸科医院2017年1—6月BACTEC MGIT 960法(MGIT 960)培养分离的菌株,通过生化和分子生物学方法进行菌种鉴定,然后将结核分枝杆菌复合群随机抽取部分MPT抗原阳性株及全部MPT抗原阴性菌株进行DNA提取、mpt64基因扩增测序和序列比对,并对结核分枝杆菌复合群MPT抗原呈阴性的临床分离株mpt64突变特征进行分析。 结果 2017年1—6月湖南省胸科医院就诊的结核病患者的痰液或支气管肺泡灌洗液等标本共分离出2 560株结核分枝杆菌,其中MPT抗原检测阳性有2 458株,MPT抗原检测阴性有102株,MPT抗原阴性占比3.98% (102/2 560)。随机抽取的20株MPT抗原阳性株的mpt64基因无突变。测序成功的85株MPT抗原阴性的临床分离株中,有81株mpt64基因存在 63 bp碱基的缺失突变,有4株存在单碱基突变,2株402位G→A,2株613和614位间加了碱基C。 结论 湖南省胸科医院MPT抗原呈阴性的结核分枝杆菌复合群临床分离株mpt64基因突变主要类型为63bp碱基的缺失。     

PCR-SSCP银染法检测结核分枝杆菌rpsL基因突变

目的 探讨结核分枝杆菌对链霉素（SM）的耐药分子机制,建立快速、准确的SM耐药性检测方法。方法 应用PCR－SSCP银染分析技术,检测87例结核分枝杆菌临床分离株链霉素耐药性及rpsL基因变异情况,以结核分枝杆菌H37Rv标准株做对照。结果 25株对SM敏感的临床分离株rpsL基因未见异常,62株耐SM的临床分离析中48株rpsL基因SSCP分析结果异常。结论 rpsL基因突变是SM耐药性的重要分子机制,PCR－SSCP技术可以快速、准确地检测结核分枝杆菌对SM的耐药性。     

结核分枝杆菌L型特征及临床意义研究进展

结核病是影响公共卫生健康安全的一种慢性传染性疾病。其病原菌是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB),而结核分枝杆菌L型(Mycobacterium tuberculosis L-forms,MTB-L)是MTB细胞壁缺失的一种特殊形态,在显微镜下呈现抗酸染色阴性、形态多样的特点,且目前临床实验室检测率低,较难发现。近年来MTB-L型在临床中的报道越来越多,本文通过对MTB-L的生物学特征、耐药性和临床致病力等方面进行综述。     

线性探针技术快速诊断本溪地区耐多药肺结核效果评价

目的 评价线性探针技术(LPA)在本溪地区快速检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性的特异性和敏感性。 方法 采用传统罗氏培养法培养2013年3月-2014年6月期间全市县区所有登记的414例涂阳肺结核患者痰标本,获得菌株经比例法药物敏感性试验和线性探针技术检测利福平和异烟肼耐药性,并以比例法药物敏感性试验为金标准分析线性探针方法的特异性和敏感性。 结果 经培养获得394株结核分枝杆菌菌株,与比例法药物敏感性试验相比较,线性探针技术检测利福平和异烟肼的特异性分别为97.9%和96.6%,敏感性分别为91.1%和81.3%;对耐多药检测的特异性和敏感性分别为98.8%和89.9%。 结论 线性探针技术是一快速、敏感、特异的诊断结核分枝杆菌利福平、异烟肼耐药和耐多药(MDR)的有效方法,可在本溪地区推广应用。     

结核分枝杆菌利福平分子药敏结果与其表型药敏差异的研究

目的 分析结核分枝杆菌利福平耐药的分子药敏(Xpert MTB/RIF)检测与在表型药敏(Bactec MGIT 960)检测结果不一致的机制。 方法 从2015年10月－2018年4月在长沙医学院第一附属医院进行 Xpert MTB/RIF 检测的8 274位患者中筛选出 Xpert MTB/RIF 检测利福平耐药而 Bactec MGIT 960 利福平敏感的患者39例,以及Xpert MTB/RIF 检测利福平敏感而 Bactec MGIT 960 利福平耐药的患者7例,共46例患者标本复苏其分离株,然后提取基因组DNA并进行rpoB的利福平耐药决定区域(rifampicin resistance determining region, RRDR)测序,同时对所有复苏的分离株进行最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)测定,观察不同突变菌株的耐药程度。 结果 46例患者中有2例菌株复活失败、2例菌株丢失,剩下42例菌株完成测序,其余有5株菌株RRDR区未发生突变,剩余的37株在rpoB基因的RRDR区有不同位点及不同类型的变异,其中有2株在508和509位点发生缺失突变,其它突变的位点有511、516、526、531、533。多数突变位点集中在526位,突变类型包括His526Asn、His526Leu、His526Gly、His526Cys四种,其余位点突变形式为Leu511Pro、Asp516Tyr、Leu533Pro。在511、516、526、533位点突变中,MIC测定除了一株突变类型为His526Leu的菌株为32 μg/ml外,其余位点突变均表现为低水平耐药或敏感,而531位点突变中Ser531Trp、Ser531Leu均表现为高水平耐药。 结论 基于rpoB测序和MIC测定的结果显示特定rpoB基因突变可能导致结核分枝杆菌利福平耐药水平的改变,结核分枝杆菌利福平耐药(Xpert MTB/RIF)检测与(Bactec MGIT 960)检测结果不一致。     

产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的检测及耐药性变迁

目的 了解肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的感染现状及其耐药变迁。 方法 收集中山市中医院2011年1月-2014年12月间分离出的2 171株肺炎克雷伯菌进行鉴定和药敏试验,应用WHONET5.6软件进行耐药性分析。 结果 2 171株肺炎克雷伯菌中,其中产ESBLs株564株,占25.98％;药敏结果显示产ESBLs菌株的耐药率普遍高于不产ESBLs株,产ESBLs菌株对碳青霉烯类未见耐药菌株,对头孢唑啉的耐药率高达99.11%。产ESBLs菌株呈多重耐药。 结论 产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药现象严重,及时监测产ESBLs菌株的发生率及其耐药趋势,采取积极应对措施,应根据不同耐药特点合理使用抗菌药物,以延缓细菌耐药性的产生。     

平远县2009-2014年结核分枝杆菌检出及耐药情况

目的 了解2009-2014年期间广东省平远县结核分枝杆菌的检出和耐药情况。 方法 收集2009-2014年期间广东省平远县慢性病防治站收治的结核病患者或疑似结核病患者痰标本1 682份,对样品抗酸染色、采用改良罗氏培养基对结核分枝杆菌进行培养,并对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素四种抗结核病药物进行药敏试验。 结果 共分离到结核分枝杆菌191株, 其中166株来自初治患者、25株来自复治患者。总耐药率为35.1%,对四种药物耐药率分别为19.8%、 25.7%、7.3%和18.3%,初治患者和复治患者的菌株耐多药率分别为22.9%和48.0%,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 平远县结核病人耐药形势严峻,应加强耐药监测和检测,并合理使用药物。     

贵州地区2017—2020年结核分枝杆菌卷曲霉素耐药与相关基因突变关系

目的 检测结核分枝杆菌(M.tb)对卷曲霉素(CM)耐药相关基因突变情况,探究基因型与表型的关联,为临床使用CM提供指导。方法 收集2017—2020年某院痰抗酸染色阳性的肺结核病患者痰标本,培养获得临床分离M.tb,药物敏感试验(DST)明确菌株耐药表型;提取DNA送全基因组测序(WGS),检测CM耐药相关基因tlyA、rrs、rpsL、eis、Rv0194及Rv1258C的突变情况,探索CM与利福平(RIF)表型耐药相关性。结果 共培养123株M.tb,WGS检出6个CM耐药相关基因共23个非同义突变位点;DST结果显示52例RIF耐药,4例CM、RIF均耐药。CM耐药菌株检出rrs基因A1401G、rpsL基因A128G以及Rv0194基因C3293T和T221C非同义突变位点;CM与RIF耐药相关性分析显示,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 M.tb CM耐药可能与rrs基因A1401G、rpsL基因A128G和Rv0194基因C3293T突变有关,CM存在与RIF交叉耐药可能,在制定抗结核治疗方案时可作参考。     

结核分枝杆菌Lsr2蛋白原核重组表达及其多克隆抗体制备

目的 利用原核系统获得重组结核分枝杆菌Lsr2蛋白,制备抗Lsr2多克隆抗体。 方法 以临床标准株 H37Rv DNA为模板,合成引物PCR扩增Lsr2核酸序列,插入原核表达载体pET28a,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达,柱上复性纯化后,重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备并纯化抗Lsr2多克隆抗体,采用间接ELISA和Western-blotting实验对抗体进行验证。 结果 成功构建pET28a-Lsr2表达质粒,重组蛋白Lsr2经SDS-PAGE电泳鉴定分子量为14 kD。亲和层析及柱上复性后,纯化的重组蛋白纯度在95%左右。制备的抗Lsr2多克隆抗体效价在1:5.5×10⁶以上,并能特异性识别纯化的重组蛋白和结核分枝杆菌菌体蛋白。 结论 成功在原核系统内表达并纯化了重组结核分枝杆菌Lsr2蛋白,制备了高效价的抗Lsr2多克隆抗体,为进一步研究Lsr2蛋白的功能,筛选其下游相互作用蛋白以及相关分子机制研究奠定了基础。     

全基因组测序技术在结核病分子流行病学中的应用进展

结核病给全球带来了严重的疾病负担,防控结核病具有重要意义.结核病分子流行病学将结核分枝杆菌分型技术与流行病学资料相整合,在研究结核病的传播和流行特点中起到了极其重要的作用.全基因组测序能够构建生物体基因组的完整DNA序列,具有高分辨率、高通量、结果精确等优势,在结核病分子流行病学研究中非常有吸引力和发展潜力.比较全基因...