斑马鱼心脏发育候选基因Titin-Cap的CRISPR/Cas9打靶有效性分析

CRISPR/Cas9基因打靶技术是近几年发展起来的一种高效率的定向打靶技术,被认为是遗传领域的革命性技术。Titin-Cap基因是本实验室已初步鉴定的斑马鱼心脏发育候选基因,且国内外目前尚无斑马鱼Titin-Cap基因的敲除品系。为了研究Titin-Cap基因在心脏发育过程中的作用机制,我们利用CRISPR/Cas9基因打靶技术建立斑马鱼Titin-Cap基因的敲除品系。测序结果显示,注射了CRISPR/Cas9 gRNA的胚胎出现双峰,说明在打靶位点附近出现了碱基缺失或插入,证明我们设计的gRNA是有效的。对F0代突变体成鱼的筛选中,测序结果同样显示有阳性结果。这些结果说明用CRISPR/Cas9基因打靶技术成功敲除了斑马鱼Titin-Cap基因,获得了Titin-Cap基因敲除的嵌合体斑马鱼。     

斑马鱼miR-196a-1基因敲除品系的构建

microRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为19～23个核苷酸的非编码RNA,通过影响mRNA的稳定性和翻译,来参与基因表达的转录后调控。生物信息学分析表明该基因在各个物种中高度保守。为了阐明该基因在肠道发育中的作用,本文利用Cloning free CRISPR/Cas9基因编辑技术构建miR-196a-1基因敲除的斑马鱼品系。首先通过分析软件筛选出斑马鱼miR-196a-1基因的两个敲除位点,两个敲除位点相隔132 bp,利用PCR技术扩增miR-196a-1的向导DNA,再以向导DNA为模板转录得到miR-196a-1的sgRNA,将miR-196a-1基因的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼胚胎1细胞期胚胎中。斑马鱼胚胎发育到36 hpf后进行基因编辑的有效性检测,研究结果显示,miR-196a-1基因出现102 bp碱基的缺失,表明CRISPR/Cas9系统对miR-196a-1基因的敲除有效。对其F0代、F1代、F2代进行筛选,成功获得斑马鱼miR-196a-1基因敲除品系,为研究miR-196a-1在肠道发育中的作用奠定了基础。     

针对Fbxl5基因关键结构域F-box的Crispr/Cas9打靶有效性分析

为了在动物体内研究Fbxl5基因是通过什么机制导致斑马鱼心脏出现突变表型,本文利用近几年兴起的CRISPR/Cas9打靶技术建立斑马鱼Fbxl5基因敲除品系。本文将打靶位点定位于Fbxl5的F-box结构域,也就是Fbxl5的第五号外显子上。首先经过基因打靶网站分析筛选出针对Fbxl5基因F-box结构域最适合的打靶位点,扩增出Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶双链DNA,并转录为RNA,与Hcas9共注射至斑马鱼胚胎。最后,在注射48 h后对Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶的有效性进行检测。首先在注射48 h之后收集胚胎提取基因组DNA,用特异性引物进行PCR扩增;将纯化后的Fbxl5基因PCR产物连接到p MD18-T载体,再经质粒提取,测序分析,通过与WT斑马鱼基因组序列进行比对发现Fbxl5-9号在PAM序列AGG下游缺失了4个碱基。证明该CRISPR/Cas9系统在敲除心脏发育候选基因Fbxl5是有效的,该研究为最终获得Fbxl5基因敲除斑马鱼奠定了良好的基础。     

斑马鱼myo7ab基因敲除品系的构建

MYO7A是人类Usher综合征(US)的致病基因。由MYO7A突变导致的Usher综合征病例占Usher综合征1型病例的29%～55%。研究发现人类MYO7A突变能够导致Usher综合征1B型(USH1B),包括感觉神经性听力损伤及年龄依赖性视网膜色素变性(RP),但其分子机制尚不清楚。为了研究该基因在内耳及视网膜发育中的具体分子作用机制,利用Cloning free CRISPR/Cas9基因编辑技术构建斑马鱼myo7ab基因敲除品系。首先,通过分析软件筛选出该基因的敲除位点,利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增该基因的向导DNA(gDNA),再以gDNA为模板转录得到向导RNA(gRNA),将gRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼1细胞期胚胎中;随后,进行基因编辑的有效性检测。研究结果表明,CRISPR/Cas9系统对该基因的敲除有效。对其进行进一步筛选,成功获得斑马鱼myo7ab基因敲除突变品系,这为研究该基因在内耳及视网膜发育过程中的作用奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系

蛋白激酶D1 (protein kinase D1, PKD1;也称作PRKD1)是蛋白激酶家族成员之一,该家族由3种结构相关的应激激活酶组成,可调节机体多种生物学功能,主要涉及细胞增殖、分化、凋亡、免疫调节、心脏收缩、血管生成和癌症等,其中PRKD1与心脏肥大、收缩和缺血再灌注损伤的底物磷酸化有关。相关研究报道,先天性心脏病患者存在PRKD1基因突变,但其在心脏中的特异性功能和分子机制并未阐明。为了便于后期研究PRKD1基因在人类早期心脏发育的作用机制,本文拟利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系。首先,通过生物信息学网站筛选出两个最佳的基因敲除靶位点,合成相应靶位点的单链向导RNA (single guide RNA,sg RNA)和引物;然后,将两个靶位点的sg RNA进行体外转录,并将其与Cas9蛋白混合后共同注射到斑马鱼的1-细胞期;最后,对基因敲除后的F0、F1、F2及F3代斑马鱼的胚胎和成鱼进行有效性鉴定及表型观察。结果显示,靶位点附近出现了不同程度的碱基缺失;成功构建了F1代能够稳定遗传的prkd1基因敲除的3个亚系;与野生型相比, F3代纯合子...     

斑马鱼gpr98基因敲除试验模型的构建

gpr98基因突变与多种疾病相关,该基因在人类和斑马鱼中高度保守。建立斑马鱼gpr98基因突变体稳定系,可为阐释gpr98基因功能提供良好的动物模型和研究基础。本文利用CRISPR/Cas9基因敲除技术在斑马鱼gpr98基因2号外显子上选取两个相距42bp的靶位点,分别体外合成sgRNA,并与Cas9 mRNA一起共注射至斑马鱼胚胎单细胞期的胚胎内。随机挑选发育72h胚胎提取基因组DNA进行PCR分析,结果表明:除了有野生型DNA带外,部分胚胎有一条比野生型DNA小的带;进一步将F0代阳性个体与野生型的斑马鱼杂交,对杂交后代进行基因型分析,并成功筛选到缺失48bp(Δ48bp)的稳定遗传突变的gpr98基因敲除斑马鱼模型。该试验模型的构建为研究gpr98基因在心血管以及骨骼等组织器官的发育及相关疾病发生中的作用奠定了重要基础。     

基于新的CRISPR/Cas9技术实现斑马鱼LHX9基因的快速编辑及对F0突变体性腺发育的初筛

目的:CRISPR/Cas9系统在斑马鱼的反向遗传学中的到了广泛应用,但突变基因的表型观察往往需要在突变鱼系的F1中进行,费时较长。LHX9作为LIM家族的一种转录因子,在胚胎早期的泌尿生殖嵴中有广泛分布;且LHX9基因敲除的小鼠存在性腺发育不良。本研究拟通过一种新的CRISPR/Cas9基因编辑技术,采用四条sgRNA对LHX9基因进行VASA转基因斑马鱼的基因敲除,以观察该基因缺陷对斑马鱼性腺发育的影响。方法:利用新的CRISPR/Cas9技术,设计四条针对斑马鱼LHX9基因3号外显子的20bp的sgRNA,通过非克隆体外转录得到靶位点的四条sgRNA。将以上靶位点的四条sgRNA与Cas9核酸酶蛋白同时注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内,利用PCR鉴定突变型类型和突变比例。通过对LHX9基因突变体的VASA转基因斑马鱼进行荧光观察,发现LHX9基因缺陷的斑马鱼性腺发育的情况。结果:靶向Exon 3的四条sgRNA可成功编辑斑马鱼LHX9基因,敲除效率高达82%,Sanger测序发现产生10种不同的移码突变类型。通过该方法对VASA转基因斑马鱼的LHX9基因进行编辑,发现LHX9基因突变导致dph6的的斑马鱼原始生殖细胞增殖和迁移受到影响。结论:基于4条sgRNA注射的CRISPR/Cas9技术,可以快速地产生具有突变表型的G0斑马鱼,具有应用潜力。LHX9基因敲除导致原始生殖细胞的发育和迁移受到影响,提示该基因参与了斑马鱼早期性腺的发育。     

应用CRISPR/Cas9技术制备Ace2基因敲除小鼠模型及基因型的鉴定

本研究旨在应用CRISPR/Cas9技术高效构建Ace2 (angiotensin-converting enzyme 2)基因敲除小鼠模型,并繁殖、鉴定及验证Ace2基因敲除小鼠。通过构建靶向敲除Ace2基因的载体,体外将Cas9 mRNA和向导RNA (guide RNA, gRNA)显微注射到小鼠受精卵中,通过PCR和TA克隆测序对小鼠Ace2基因的第3至18号外显子删除情况进行检测和鉴定,繁育Ace2基因敲除小鼠并利用qRT-PCR和Western blot方法验证获得的Ace2~(-/Y)小鼠主要脏器中Ace2 mRNA和蛋白表达情况。结果显示,顺利构建表达gRNA载体并体外转录,成功将有活性的gRNA和Cas9 mRNA直接注射入受精卵,获得6只阳性F0代初建鼠,PCR和基因测序鉴定表明成功删除了小鼠Ace2基因的第3至18号外显子;F0代鼠与野生型鼠回交,得到3只阳性F1代鼠,再与野生型鼠相交配得到的后代为F2代,在F2代中选择Ace2~(-/+)雌性杂合子鼠与野生型鼠交配,获得F3代Ace2~(-/Y)雄性纯合子小鼠。qRTPCR和Western blot结果表明,F3代Ace2~(-/Y)小鼠肾脏和肺中未检测到Ace2 mRNA和蛋白表达。本方法通过CRISPR/Cas9技术成功制备了Ace2基因敲除小鼠模型,为进一步研究Ace2基因功能奠定了基础。     

斑马鱼adgrf3a基因敲除品系的构建

adgrf3a基因编码的ADGRF3A蛋白是黏附类G蛋白偶联受体（aGPCRs）家族的一员,主要在受精后5 d的胚胎以及成年斑马鱼的头部和性腺中表达。它含有一个GPS蛋白水解位点和7个跨膜结构域,与G蛋白相互作用行使其功能。斑马鱼是研究早期发育和成体内生理和病理的重要模式生物。为了研究adgrf3a在斑马鱼早期发育中的作用,我们利用CRISPR-Cas9技术构建了adgrf3a基因敲除斑马鱼品系。首先,通过分析软件筛选出该基因的敲除位点,利用聚合酶链式反应扩增该基因的向导DNA(sgDNA),再以sgDNA为模板进行体外转录得到向导RNA(sgRNA)并纯化回收,将纯化后的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼1细胞期胚胎中,得到F0代嵌合体。随后,对斑马鱼胚胎进行基因编辑的有效性检测,结果表明,注射的胚胎出现了碱基缺失的现象,即sgRNA有效,将剩余胚胎培养至成鱼。将嵌合体与野生型斑马鱼杂交所得的F1代斑马鱼进行基因型鉴定,筛选adgrf3a突变杂合子,并对其adgrf3a突变位点进行Sanger测序,建立能够稳定遗传的adgrf3a基因杂合突变品系。之后,adgrf3a突变杂合子...     

CRISPR/Cas9技术在斑马鱼基因修饰中的应用

CRISPR/Cas9系统的应用促进了基因编辑技术的快速发展,现已成功地在不同模式生物中实现了高效的基因修饰,包括DNA序列的点突变、大片段删除以及外源基因的定向插入等。现就CRISPR/Cas9系统在斑马鱼模式动物中建立基因敲除和敲入品系的最新研究进展作一综述。     

CRISPR/Cas9介导的斑马鱼基因敲入技术研究进展

规律性成簇间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced palindromic repeats,CRISPR)及相关蛋白组成的CRISPR/Cas9系统作为细菌和古细菌一种适应性免疫防御体系,近年被用于多个物种的精准基因编辑。作为重要的脊椎动物发育生物学模式生物,斑马鱼具有发育快、易饲养、繁殖力强和胚胎透明易观察等众多优点,因此以斑马鱼为模型也开展了许多基于基因编辑的相关研究。相较于基因敲除高效的随机突变,精准基因敲入(knock-in,KI)的低效率一直是斑马鱼基因编辑领域的短板。本文综述了在斑马鱼中使用CRISPR/Cas9系统进行基因敲入的相关研究进展,为优化精准敲入效率以及建立斑马鱼疾病模型等方面提供借鉴。     

甲基转移酶set9缺失的斑马鱼低氧耐受能力增强

为了研究鱼类的甲基转移酶set9 [SET domain containing (lysine methyltransferase) 9, 也称作set7/setd7]在低氧耐受中的功能, 以斑马鱼(Danio rerio)作为模式生物, 利用CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9)基因编辑技术, 在斑马鱼set9基因的第一个外显子上设计了Cas9的靶位点, 对其进行基因敲除, 获得了缺失8个碱基的set9基因敲除的斑马鱼品系。对受精后3d的斑马鱼幼鱼和3月龄的斑马鱼成鱼进行低氧胁迫处理, 比较了野生型及set9基因敲除的斑马鱼的低氧耐受能力; 并对低氧胁迫处理后的3月龄的野生型及set9基因敲除的斑马鱼成鱼的脑组织取材、固定并进行TUNEL染色。结果显示: set9基因敲除的斑马鱼与野生型相比, 其低氧耐受能力显著增强, 脑组织中的细胞凋亡水平显著减少。研究为进一步揭示鱼类甲基转移酶set9在低氧耐受中的功能和分子机制提供了线索, 并为培育耐低氧鱼类新品种提供了候选靶标。     

利用猪单个胚胎建立高效快速的CRISPR/Cas9打靶位点检测方法

基因工程猪可作为动物模型研究人类疾病,也是异种器官移植最合适的供体.CRISPR/Cas9系统是高效特异的基因编辑工具.因此本文通过显微注射的方式将sg RNA和Cas9 m RNA注射入单细胞期的孤雌胚胎中,待其发育为囊胚后检测打靶效率.T7EN1酶切和TA克隆测序结果表明,本研究可以在猪的孤雌胚胎中同时实现3个基因(B2M,CIITA,GGTA1或者LDLR,LEP,LEPR)的高效敲除(敲除率分别为62.5%和50%),为使用CRISPR/Cas9系统高效、快速和经济地建立多基因修饰的猪模型提供了基础.     

利用CRISPR/Cas9技术构建PERV敲除的PK15细胞系

[目的]利用CRISPR/Cas9技术对猪内源性逆转录病毒(PERV)进行编码区的大片段敲除,获得PERV敲除的阳性PK15单克隆细胞系。[方法]通过对巴马小型猪基因组进行高通量测序,获得PERV高度保守序列,再根据CRISPR/Cas9的构建原理,设计2个gRNA,并将其同时整合入含有PB转座子的可表达Cas9蛋白的载体中,即PB-CAG-2×gRNA-Cas9载体。然后以电转方式将打靶载体转入PK15细胞中,并通过药物(G418)筛选方法筛出单细胞克隆。通过PCR鉴定,挑出阳性克隆,并将其传代扩大获得细胞系。[结果]酶切、测序验证了载体PB-CAG-2×gRNA-Cas9的正确性,PCR结果显示7株单克隆细胞系均有约3600bp的PERV大片段敲除。[结论]构建了PERV敲除的基因打靶载体PB-CAG-2×gRNA-Cas9,并利用该载体成功打靶获得了7株PERV大片段敲除的PK15细胞系。     

斑马鱼tbx2b调控心脏房室间隔发育的功能研究*

tbx2是早期心脏发育的关键基因。为进一步探究其对房室间隔(AVC)发育的影响,研究利用CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术,成功构建了斑马鱼tbx2b突变体。通过T7E1酶切对其F₀进行敲除效率检测,结果显示平均敲除效率约为57.5%。F₁进一步筛选获得tbx2b杂合突变体,测序结果显示突变类型为11 bp碱基缺失的移码突变。tbx2b杂合子内交获得纯合子,tbx2b纯合突变体在5 dpf死亡并出现早期心脏环化异常表型。斑马鱼整胚原位杂交实验显示在3 dpf tbx2b纯合突变体中, 心脏腔室分化特异性标志基因nppa、nppb表达上调并异位表达在AVC,而AVC发育关键基因has2的表达消失。高效构建tbx2b突变体并初探其对下游基因的影响,为后续深入研究tbx2b对心脏AVC发育的作用奠定了基础,同时加深了人们对早期心脏调控网络的认识。     

应用SSA报告载体提高ZFN和CRISPR/Cas9对猪IGF2基因的打靶效率

IGF2(Insulin-like growth factor 2)基因作为最复杂多样的生长因子之一,对猪胎儿发育以及出生后生长发育和肌肉生成起着非常重要的作用。通过基因组编辑技术对我国本地猪种的IGF2基因作精确的遗传修饰,对于提高本地猪种的瘦肉率具有重要的育种意义。文章在蓝塘猪胎儿成纤维细胞(Porcine fetal fibroblasts, PEF)中检测了锌指核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFN)和CRISPR/Cas9对IGF2基因的打靶效率,结果表明CRISPR/Cas9对IGF2基因的切割效率最高可达9.2%,显著高于ZFN的切割效率(<1%),但两者均未达到作为体细胞核移植(Somatic nuclear transfer, SCNT)供体细胞所需的打靶效率。应用SSA (Single-strand annealing)报告载体筛选技术来富集IGF2基因被ZFN和CRISPR/Cas9修饰过的PEF细胞,结果表明,该技术可使CRISPR/Cas9的打靶效率提高5倍左右,对ZFN的打靶效率具有更大的增强作用。     

应用CRISPR/Cas9技术构建miR-362敲除的95-D肺癌细胞株

目的:运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立miR-362基因敲除的95-D肺癌细胞株,并研究miR-362在肿瘤中的调控作用。方法:针对人源miR-362基因序列设计gRNA,构建px330-gRNA载体;T7E1 assay确定gRNA的有效性。分别扩增miR-362上下游同源臂序列构建donor载体。利用脂质体将CRISPR系统和donor载体共转至人肺癌细胞系95-D,通过同源重组方法将筛选标志基因整合至基因组中,通过流式分选以及q PCR方法检测筛选出的细胞中miR-362表达水平。利用Transwell分析miR-362对细胞运动能力的影响。结果:与95-D细胞相比,95-D-Knock Down细胞中miR-362表达水平显著降低,且迁移侵袭能力分别下降了53.1%(P=0.000 6)和48.3%(P=0.000 2)。结论:利用CRISPR/Cas9系统成功构建了miR-362基因敲除的95-D细胞,miR-362可促进细胞的运动能力,为后续研究miR-362在肿瘤中的作用机制和功能奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9技术产生肌肉特异表达Cas9的小鼠胚胎

目的通过CRISPR/Cas9技术获得肌肉特异性表达Cas9蛋白小鼠胚胎,为建立肌肉特异表达Cas9小鼠动物模型奠定基础。方法设计小鼠Rosa26位点sgRNA并通过体外酶切验证活性,同时使用同源重组构建肌肉特异性同源打靶载体;通过显微注射将Rosa26sgRNA与Cas9蛋白注射到小鼠胚胎,通过PCR及测序检测胚胎的编辑情况,同时移植到假孕母鼠体内,待其生产;将同源打靶载体与Rosa26sgRNA和Cas9一起注射到小鼠胚胎,通过PCR检测整合情况。结果体外酶切实验表明,体外转录的sgRNA与Cas9蛋白联合可对靶位点产生编辑作用;成功构建了肌肉特异性同源打靶载体Donor-SP-px459;通过原核注射获得Rosa26基因编辑胚胎,经移植获得Rosa26基因编辑小鼠;注射同源打靶载体后,成功获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶小鼠胚胎。结论利用CRISPR/Cas9技术,成功获得Rosa26基因编辑胚胎和小鼠,并获得了肌肉特异性表达Cas9蛋白小鼠胚胎,为利用基因打靶构建肌肉特异表达Cas9的小鼠动物模型奠定基础。     

家蚕BmRpt4基因在翅膀发育中的功能研究

【目的】研究分析编码蛋白酶体调控复合物亚基基因BmRpt4(Regulatoryparticletriple-A ATPase4,BGIBMGA010794)在家蚕翅膀发育过程中的功能。【方法】利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,将BmRpt4的gRNAs和Cas9mRNA直接注射到家蚕胚胎中,观察G0代家蚕个体雏翅率,并分析雏翅个体中BmRpt4基因突变情况。【结果】经统计,对照组G0代家蚕个体均表现为正常翅,而实验组注射BmRpt4的gRNAs和Cas9 mRNA后,G0代约66.7%家蚕个体表现出小翅表型。在分子水平上对小翅表型个体进行检测,发现BmRpt4基因在两个gRNA及其之间位置均有不同长度片段的缺失或者插入,说明在这些突变个体中BmRpt4基因被不同程度的敲除,从而其功能缺失,导致出现小翅表型。【结论】该研究结果表明编码蛋白酶体调控亚基的BmRpt4基因在家蚕翅膀发育中具有重要作用,为蛋白酶体在生物组织器官发育中调控作用研究提供重要实验依据。