s、Fy~a、OK~a阴性稀有血型的多重PCR筛选技术应用

目的采用多重PCR筛选技术(PCR-ssp反应体系)同时扩增s、Fya、OKa阴性稀有血型。方法根据s、Fya、OKa血型基因核心序列设计相应引物,采用序列特异引物引导的PCR反应(PCR-SSP)体系对模版DNA进行扩增,对扩增产物进行电泳分析,根据扩增出目标片段图谱判断该稀有血型基因的存在与否,以此判断是否阴性稀有血型。结果随机抽取本站2010年6～8月参加献血的650名献血者进行筛选鉴定,未发现s、Fya、OKa阴性的稀有血型。结论该方法能在一个反应体系内同时扩增3个稀有血型,具有准确、高效的优点,可以用来进行献血人群s、Fya、OKa阴性稀有血型的筛选与建库工作。     

采用多重PCR技术筛选k、Js~b及Di~b阴性稀有血型

目的利用多重PCR筛选技术,建立一个PCR-ssp反应体系同时扩增k、Jsb、Dib阴性稀有血型。方法根据k、Jsb、Dib血型基因核心序列设计相应引物,采用序列特异引物引导的PCR反应(PCR-SSP)体系对献血者模板DNA进行扩增,对扩增产物进行电泳分析,根据是否扩增出目标片段图谱判断该稀有血型基因的存在。结果随机抽取参加献血的600例进行筛选鉴定,没有发现k、Jsb、Dib阴性的稀有血型。结论该方法能在一个反应体系内同时扩增3个稀有血型,具有准确、高效的优点,可应用于献血人群k、Jsb、Dib阴性稀有血型的筛选与建库工作。     

红细胞稀有血型筛选、建库与应用

目的:为了解决临床稀有血型供应困难的问题而从献血人群中筛选出针对高频血型抗原组表达阴性的稀有表型的稀有血型。方法:采用分子生物学和血型血清的方法筛选。通过组建多个多重PCR体系,针对Fy(a-)、Co(a-)、Yt(a-)、Di(b-)、Kp(c-)、Kp(b-)、Js(b-)、Ok(a-)稀有等位基因的检测。并在血清筛选试验中,釆用适应于高通量的微量板法和改良的抗球蛋白法。通过组建由于单个实验室通常无法同时获各类稀有表型DNA作为分子诊断的实验对照,采用定点诱变技术(SDM),通过环状诱变PCR方法,制备各种稀有表型等位基因突变点片段,以用于分子生物学方法筛选稀有血型的对照。结果:在2011-2013年期间,本站在某地参加献血者共计56120人次,共发现稀有血型15人次。其中包括极为罕见的等位稀有表型。众多新的血型等位基因和存于中国人群中的特殊遗传模式被发现。在最近2年的临床稀有血型输血应用中,共有4000ml的稀有血液被用于临床抢救与治疗。结论:稀有血型的筛选工作和初步建立具有全国规模的稀有血型信息网络系统对于解决临床的稀有血型的需求问题是一种极为有效的方式和途径,通过对筛选范围的扩大与增添对于验证稀有血型体系是极其重要的。     

汕头市RhD阴性献血者Rh血型表型分布调查

目的 了解汕头市RhD阴性献血者Rh血型抗原表型分布,进一步完善稀有血型献血者数据库,确保稀有血型患者临床输血安全.方法 对2010年7月-2011年1月16203名无偿献血者(剔除重复献血者)进行RhD阴性筛选,筛选出53名RhD阴性者进行表型分型并对结果进行分析.结果 RhD阴性占总人群的3.27‰,其中0(45....     

南阳市Rh D阴性稀有血型库的建立及临床意义

目的：建立南阳市稀有血型检索库,并探讨其临床意义。方法采用微板法对南阳市81462名无偿献血者Rh D血型抗原进行初筛检查,对血型初筛Rh D阴性标本再用3个不同批号的IgG抗-D抗体试剂进行抗人球蛋白（IAT）实验确认。初筛和确认实验均为阴性者为Rh D阴性血型。同时检查Rh D阴性者的ABO血型以及Rh血型的表现型。结果所有献血者经筛选和确认共有300名Rh D阴性血型,占0.37%,其中B型血最多,表现型以ccdee为主。将献血者的资料和检查的结果输入计算机,建立南阳地区Rh D阴性稀有血型信息库。结论 Rh D阴性稀有血型信息库为Rh D阴性患者的急救用血提供了一条绿色生命通道,对防止Rh血型不合的输血引起的急性溶血反应及Rh血型不合的妊娠引起的新生儿溶血病具有深远意义。     

浅析太原市稀有血型库的建立和应用

目的：为解决稀有血型患者临床医疗用血的供应问题，方法：对山西省太原市红十字血液中心在无偿献血人群中普查Rh血型，建立稀有血型库的工作情况进行回顾总结．结果与结论：在无偿献血人群中建立稀有血型库，能及时向稀有血型患者提供治疗用血。     

西宁地区Rh(D)阴性稀有血型库的管理、临床应用与体会

目的:建立Rh(D)阴性血型库,实施有效的管理和应用,减少稀有血液资源的浪费,合理开发利用稀有血液资源,保证临床Rh稀有血液的有效及时供给,保障人民的生命财产安全.方法:从2000年9月起对该地区所有无偿献血者的Rh血型分布状况进行筛选调查,给经筛检为Rh阴性的无偿献血者建立个人信息档案资料.结果:建立起西宁地区287人的Rh(D)阴性稀有血型库,形成了一支Rh阴性稀有血型自愿无偿献血者队伍.结论:Rh(D)阴性血型库建立,确保稀有血液资源合理开发利用,解决了稀有血液供需矛盾,2000年9月-2005年9月,共向临床发放Rh(-)血液568 U,开展Rh(-)血型的ABO异型输注4例,拒绝了6例具有不规则抗D抗体献血者今后再次献血,杜绝本地区经输注Rh(D)阴性稀有血液输血不良反应的发生,为稀有血型患者的临床用血提供了可靠保证.并为今后科学、合理的开发和利用稀有血液资源,确保临床用血的需要和安全将发挥巨大的作用.     

宿迁市无偿献血者Rh（D）阴性血型库建立及应用

目的：建立Rh（D）阴性血型库,实施有效的管理和应用,减少稀有血液资源的浪费,合理开发利用稀有血液资源,保证临床Rh稀有血液的有效及时供给,保障临床用血需求。方法：从2008年起对该地区所有无偿献血者的Rh血型分布状况进行筛选调查,给经筛检为Rh阴性的无偿献血者建立个人信息档案资料。结果：建立起宿迁地区173人的Rh（D）阴性稀有血型库,形成了一支Rh（D）阴性稀有血型自愿无偿献血者队伍。结论：Rh（D）阴性血型库建立,确保稀有血液资源合理开发利用,解决了稀有血液供需矛盾,2008年-2012年共向临床发放Rh（D）阴性血液1339．5U,为稀有血型患者的临床用血提供了可靠保证。并为今后科学、合理的开发和利用稀有血液资源,确保临床特殊用血的需要和安全奠定了基础。     

东莞市RhD（－）无偿献血者分布状况调查分析

目的：了解东莞市RhD（－）稀有血型献血者状况,为招募和保留稀有血型献血者提供数据支持。方法对献血者标本采用U型微量板法、即刻试管法、抗人球蛋白和凝聚胺试验法检测,确认RhD （－）血型。收集2009～2013年东莞市RhD（－）稀有血型献血者档案信息并进行分析。结果 RhD（－）稀有血型献血者年龄集中在20～30岁,学历多为初中、高中的年轻群体。结论针对此类人群加强RhD（－）稀有血型相关知识的宣传,建立并充分利用RhD（－）稀有血型库,不断壮大RhD（－）稀有血型固定无偿献血者队伍。     

54545例无偿献血者Rh阴性情况调查

目的为了解本地区Rh阴性者民族分布情况。方法对2002年-2005年无偿献血者进行抗-D普查,同时建立Rh阴性血型档案。结果本地区回、汉族Rh阴性献血者所占比例分别为0.33%和0.21%,与我国汉族人群中Rh阴性者比例相当,属于稀有血型。结论Rh阴性血紧缺,应建立完整档案资料并建设Rh阴性冰冻红细胞库。     

献血员HBsAg筛查的安全性和病毒变异分析

目的探讨国内血站对献血员乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）筛查的安全性和可靠性。方法收集经血站筛查HBsAg阴性的合格献血员血浆983份,用雅培Architect12000电化学发光仪定量检测HBsAg;巢式PCR扩增乙肝病毒S区、C区、X区。诊断为隐匿性乙肝病毒感染者,巢式PCR扩增病毒PreS／S区,产物直接测序并与标准病毒序列对比分析病毒株变异。结果经雅培Architect I2000复检HBsAg弱阳性率为6．5％（64／983）,HBsAg滴度中位数为0．171U／ml;60．9％（39／64）病毒两个区扩增阳性,4．0％（39／983）健康献血员为隐匿性HBV携带者;35．9％（14／39）病毒PreS／S区段扩增阳性,未发现“a”决定簇内的变异株。结论目前经血站常规检测ItBsAg为阴性的合格血液用敏感性更高的试剂仍能检测出HBsAg及HBV DNA。     

新乡地区无偿献血者ABO和Rh血型抗原分布调查

目的调查新乡地区汉族无偿献血者红细胞血型系统ABO和Rh抗原的分布情况,保证临床合理计划供血。方法用血型群体遗传学研究方法,随机选择新乡市地区无血缘关系的汉族无偿献血者12000名,进行ABO、Rh血型系统的表现型及基因频率分布调查分析。结果ABO血型表现型频率顺序B>O>A>AB,基因频率q>r>p;12000名无偿献血者检出RhD阴性40人,占0.33%,且Rh(-)以Ccdee和ccdee为多见。Rh血型表现型以CCDee和CcDEe多见,基因组合体频率CDe最高。结论新乡地区汉族人群ABO和Rh等主要血型系统抗原分布与北方汉族人群的分布基本相符,对建立稀有血型档案,保证临床合理计划用血及应急供血,具有重要的临床意义。     

人类血小板抗原-1系统基因分型方法的建立及初步应用

目的建立人类血小板抗原-1系统的基因分型方法,并对本地区献血小板者进行血小板抗原-1基因分型。方法以人类基因组DNA为模板,设计特异性引物,扩增目的基因,用琼脂糖凝胶电泳观察;同时将PCR产物纯化后进行测序,将其结果进行同源性比较;再用已建立的方法对本地区的献血小板者进行人类血小板抗原-1基因分型。结果成功建立了人类血小板抗原-1基因分型方法;本地区的HPA-1a、HPA-1b基因频率分别为97.7%、2.3%。结论构建的人类血小板抗原系统-1基因分型方法结果准确,操作简单,为建立血小板血型库奠定基础。     

疟原虫核酸检测技术建立及在献血员筛查应用的研究

目的建立血液中疟原虫检测的核酸技术，探讨应用于献血员筛查的效果。方法根据红细胞内期疟原虫ssurRNA编码基因序列，设计合成三条扩增引物。将5份待检血样混合，采用蛋白酶K消化裂解法制备模板，在同一反应体系中扩增恶性疟原虫和间日疟原虫DNA，诊断鉴别恶性疟和间日疟。与厚血膜镜检法比较评价其灵敏度及特异性。结果将3份恶性疟原虫及10份间日疟原虫感染者的血样随机混入5000份无偿献血者血样中，每5份为一个检测单元，采用PCR方法从感染血样中扩增出分别为436bp和341bp的恶性疟原虫及间日疟原虫特异性的DNA片段，并经序列测定证实扩增片段的正确性；10份间日疟患者血样以及3份恶性疟患者血样均被检出，献血者血样PCR检测结果均为阴性，结果与厚血膜方法完全一致。结论所建立的疟原虫核酸检测技术灵敏度高、特异性好，且可以批量处理，提高了检测的效率，能有效降低疟原虫的输血传播，具有很好的推广使用价值。     

扩增潜伏HIV-1 DNA序列实验方法的优化

目的对PCR扩增潜伏HIV-1DNA序列的实验方法进行优化。方法收集30例经高效抗逆转录病毒治疗（HAART）6~12个月的HIV-1感染者抗凝血标本,分别从外周血单个核细胞（PBMC）和高度纯化的CD4＋T细胞提取基因组DNA,巢式PCR扩增HIV-1env的C2-V5区,电泳检测扩增产物并进行DNA序列测定。结果同一患者PBMC纯化CD4＋T细胞标本扩增HIV-1env基因C2-V5区的效率（93.3%）明显高于直接从PBMC标本扩增该目的片段的效率（10.0%）。结论 PBMC纯化CD4＋T细胞后,再提取基因组DNA进行巢式PCR扩增,可提高扩增潜伏HIV-1DNA序列的效率。     

丙型肝炎病毒Core基因重组表达载体Pet32a-Core的构建

目的扩增丙型肝炎病毒核心区（HCV-Core）基因，并构建HCV-Core基因的重组表达载体。方法设计合成HCVCore基因全长引物，提取丙型肝炎患者血清中的HCVRNA，应用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）扩增c区基因片段，用限制性内切酶BamH1和SaL1双酶切后，连接到Pet32a表达载体中，并转化到BL21大肠杆菌中：然后PCR和双酶切鉴定转化茵落。结果扩增得到目的基因长度约600bp，经测序证实为HCV-Core基因，表明HCV-Core基因重组表达载体Pet32a-Core构建成功。结论成功构建HCV-Core基因表达载体Pet32a-Core，为下一步Core蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备奠定基础。     

Molecular basis of weak D and DEL in Han population in Anhui Province, China

Background  Rh blood group system is the most complex and immunogenetic blood group system. Prevalent RHD alleles varied in different populations. The purpose of this study is to determine the molecular basis of weak D and DEL phenotype in Anhui Chinese Han population.

Methods  The D antigen was determined with IgM monoclonal anti-D conformed to the guidelines for donor testing in China. Weak D samples were identified by an indirect antiglobulin test. DEL phenotype was determined by adsorption and elution test. All the RHD 10 exons were screened by PCR with sequence-specific priming or sequenced for the first-time donors who typed weak D, DEL or D negative by serologic test.

Results  Of all the 30 799 blood donors, 155 blood samples were found D negative with IgM anti-D; 34 blood samples were found D positive by indirect antiglobulin test or absorption elution test. RHD alleles were identified by nucleotide sequencing. Total 4 RHD alleles were found including two new. One hundred and twenty of 155 (77.4%) of the serologically D negative samples lacked the RHD gene. One D negative was RHD(615del2). Thirty-two of 155 (20.6%) carried RHD(K409K) among them one carrying 1227G>A and 845G>A. Two of 155 (1.3%) was weak D type 15.

Conclusions  In this study at the molecular level, all DEL phenotype is RHD(K409K); weak D type 15 is the prevalent weak D allele in Anhui Chinese Han population. Additionally, an improved more efficient method was adopted to amplify all the RHD exons in one PCR program. Our study added to the understanding of molecular mechanisms underlying D antigen expression in Anhui Han population and provided useful information for adopting suitable genotyping strategies in routine use.     

应用PCR-RFLP技术进行ABO基因分型研究

目的建立PCR-RFLP技术鉴定ABO血型基因型的方法。方法应用PCR技术扩增ABO基因第六外显子上分别包含258位核苷酸和700位核苷酸的两个DNA片段，分别用KpnI和AluI酶解PCR扩增产物，电泳分离鉴定ABO血型基因型，同时对上述两种PCR扩增的DNA片段进行序列测定。结果用PCR-RFLP技术鉴定的ABO基因分型结果与PCR扩增产物的序列测定结果完全符合，可鉴定出AA、AB、AO、BB、BO、OO等6种ABO血型基因型。结论PCR-RFLP技术操作简便，重复性和稳定性好，可作为鉴定ABO血型基因型的可行方法。     

蚊媒体内登革病毒的快速分型检测

目的：建立一种用于蚊媒体内登革病毒(DEN)快速检测和分型的实验方法。方法：利用标记地高辛(Dig)的登革病毒通用引物进行RT-PCR扩增蚊媒体内的病毒RNA，然后以反向斑点杂交法检测病毒扩增片段并进行分型。结果：RT-PCR可扩增出预期的DEN基因片段，杂交检测和分型结果特异，易于判断，可测出3pg的病毒RNA。结论：该方法灵敏、特异、稳定性好，可用于登革病毒分型及混合感染的检测，4h左右即可获得结果，为早期快速诊断蚊媒体内的登革病毒提供了一种可靠方法。