紫茎泽兰处理鸡柔嫩艾美耳球虫后差异基因筛选和分析

为获得紫茎泽兰处理鸡柔嫩艾美耳球虫后差异基因,将0.5%紫茎泽兰提取液作用于鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化过程,采用抑制消减杂交技术（SSH）筛选处理后卵囊的差异表达基因,通过GO和COG功能预测分析,并采用实时荧光定量PCR验证差异表达的基因。结果显示,采用SSH成功构建了紫茎泽兰处理前后鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊的cDNA消减文库,获得86条ESTs序列,经拼接和聚类后得到31条独立基因（Unigenes）,其中有23个基因有功能注释,8个基因没有功能注释,另外有4个基因没有同源性匹配。为进一步验证文库的特异性,从中随机选取3个差异表达基因,运用实时荧光定量PCR技术验证表面抗原13、3-羟酰辅酶A脱氢酶和细胞色素P450基因在紫茎泽兰处理前后的表达差异,结果显示,3个基因在经紫茎泽兰处理的鸡球虫孢子化卵囊中的表达量明显低于未处理组,说明紫茎泽兰对柔嫩艾美耳球虫卵囊具有一定的活性抑制作用。本试验获取了紫茎泽兰作用柔嫩艾美耳球虫卵囊的主要调控基因,为将紫茎泽兰研发成环境杀虫剂奠定了良好的理论基础,也可为球虫致弱疫苗或基因缺失疫苗的靶标筛选研究提供参考。     

不同发育期两种艾美耳球虫在鸡消化道内的分布

对柔嫩艾美耳球虫Eimeria teenlla和巨型艾美耳球虫Eimeria maxima的卵囊、孢子囊和子孢子在鸡消化道和粪便中的分布情况进行了研究。口服接种柔嫩艾美耳球虫卵囊第1小时后,盲肠内孢子囊数为3.4×10~8、以后则逐渐减少;而子孢子数增加且直到接种后第12小时仍保持一个高水平。其它肠段只有少量的孢子囊和子孢子。在接种巨型艾美耳球虫卵囊后的第2小时,主要在空肠内发现有大量的子孢子。研究发现,柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫的绝大多数子孢子分别寄居在盲肠和空肠内,表明每种球虫子孢子侵袭部位的特异性在侵袭发生前就确定了。     

球抗预防鸡柔嫩艾美耳球虫病效果的观察

采用接种孢子化柔嫩艾美耳球虫卵囊的方法,复制鸡球虫病,观察并计算球抗对柔嫩艾美耳球虫病鸡的存活率、相对增重率、血便记分、盲肠病变记分和卵囊值的影响,并求出球抗的抗球虫指数.结果发现球抗能提高球虫病鸡的存活率和相对增重率,减少血便记分和盲肠内容物卵囊数,减轻盲肠病变.表明球抗对鸡柔嫩艾美耳球虫病有一定的预防作用.     

柔嫩艾美耳球虫对禽流感疫苗的免疫增强作用研究

为了研究柔嫩艾美耳球虫对雏鸡免疫禽流感疫苗的免疫增强作用,试验将7日龄AA肉鸡随机分为4组,每组20只,1组试验鸡皮下注射柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,同时免疫禽流感H5亚型灭活疫苗;2组试验鸡皮下注射柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,同时免疫磷酸盐缓冲液;3组试验鸡皮下注射磷酸盐缓冲液,同时免疫禽流感H5亚型灭活疫苗;4组试验鸡皮下注射磷酸盐缓冲液,同时免疫磷酸盐缓冲液。在免疫后第7,14,21,28天,各组随机取5只鸡采血、称重,采集胸腺、脾脏、法氏囊,计算免疫器官指数,采用血凝抑制试验检测血清中禽流感抗体效价。结果表明:各组试验鸡的平均体重差异不明显,柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊与禽流感灭活疫苗共免疫不会影响试验鸡的日增重;柔嫩艾美耳球虫与禽流感疫苗联合免疫可以促进雏鸡免疫器官的生长发育,提高雏鸡免疫器官指数和禽流感抗体效价。说明柔嫩艾美耳球虫可以调节机体对疫苗的免疫反应,促进雏鸡的体液免疫应答。     

一种无外源菌DNA污染的鸡球虫卵囊的制备方法

为了获得无鸡肠道和粪便细菌DNA污染的鸡球虫卵囊,试验采用实验室制备的无微生物污染的水配制相关试剂,对柔嫩艾美耳球虫卵囊采用漂浮纯化、灭菌处理和外源菌DNA去除等方法,获得高纯度的柔嫩艾美耳球虫卵囊;提取卵囊的基因组DNA,用细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增并进行序列分析,以鉴定该卵囊是否被外源菌DNA污染。结果表明:提取的柔嫩艾美耳球虫卵囊基因组DNA经PCR方法检测外源DNA呈阴性。说明用此方法制备的柔嫩艾美耳球虫卵囊无外源菌DNA污染,可用于制备高纯度的无外源菌DNA污染的鸡球虫卵囊。     

鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因的原核表达及动物免疫试验

为了研究鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因原核表达重组蛋白的免疫效力,分析其在鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染中对鸡平均增重、抗球虫指数(ACI)、减少盲肠病变和卵囊数量中的作用,从柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊中提取总RNA作为模板,用RT-PCR扩增出SO7基因片段,再应用DNA重组技术将SO7基因克隆到原核表达载体pET32a(+)中并用IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果显示,pET32a(+)-SO7表达的目的蛋白约为40ku,主要以包涵体形式存在。用纯化的重组蛋白进行动物免疫试验显示,SO7重组蛋白在鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染中有较好的免疫保护作用,能够显著提高鸡柔嫩艾美耳球虫感染鸡的平均增重和抗球虫指数(ACI),对减少盲肠病变和卵囊数量也有部分作用。     

温度对球虫消杀剂抑制鸡球虫卵囊孢子化的影响

为探讨温度对球虫消杀剂抑制鸡球虫卵囊孢子化的影响,试验以7%氨水作为对照组,设置1:50、1:100、1:150的球虫消杀剂溶液组,同时设置生理盐水对照组.各处理液分别在4℃和20℃下与柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊在体外相互作用6、12和24h,然后用2.5%重铬酸钾溶液培养处理后的球虫卵囊,观察其孢子化率.结果表明:1:50、1:100、1:150球虫消杀剂在4℃分别处理6、12和24h的卵囊孢子化率均极显著(P<0.01)高于20℃下的对应处理组.球虫消杀剂在20℃下有更好的抑制球虫卵囊孢子化的作用.     

玉溪市一例散养土杂鸡球虫病的虫种鉴定

为了对云南省玉溪市某散养土杂鸡场一例球虫病例进行虫种鉴定，本试验通过发病情况调查、病理剖检、虫卵检查、虫卵计数、特异性引物PCR扩增、18S rRNA基因序列测序等方法进行检测分析。结果显示：病鸡盲肠粗大肿胀，肠腔内有棕黑色黏液样内容物；虫卵大小在22.922～26.621μm×17.433～19.631μm之间，每个孢子化卵囊含4个孢子囊，每个孢子囊含有2个子孢子，符合柔嫩艾美耳球虫特征；柔嫩艾美耳球虫特异性基因检测为阳性；该虫种18S rRNA基因序列与柔嫩艾美耳球虫序列的同源性最高为99.61%～99.92%，且在进化树上构成一个分支；虫卵计数卵囊数（OPG）为1.7×10⁴。试验表明该鸡场鸡群感染了柔嫩艾美耳球虫，且为中度感染；用磺胺类药物加祛湿中药治疗，疗效显著。     

饱和食盐水和次氯酸钠处理对柔嫩艾美耳球虫活力的影响

为测定饱和食盐水和次氯酸钠处理对柔嫩艾美耳球虫活力的影响,将饱和食盐水漂浮法分离的孢子化卵囊,经10%、20%、30%次氯酸钠处理10、20、30min后,孢子化卵囊以2.0×104个/羽接种14日龄雏鸡,观察接种后鸡的增重、血便、卵囊产量、肠道病变等指标。结果显示:10%～30%次氯酸钠处理10～30min对柔嫩艾美耳球虫卵囊的活力无显著性影响;在相同浓度下,卵囊总产量随着处理时间的增加而有下降趋势;饱和食盐水处理对于卵囊活力无显著性影响。     

白头翁不同提取物及复方抗鸡柔嫩艾美耳球虫研究

以存活率、相对增重率、盲肠病变记分、卵囊值和抗球虫指数为判定指标,考察白头翁不同提取物及复方对鸡柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊致病性的影响(体外试验)和抗鸡柔嫩艾美耳球虫感染效果(体内试验)。体内、体外试验结果均表明,白头翁不同提取物及复方均能提高相对增重率,降低盲肠病变计分和卵囊值。抗球虫指数(ACI)检测表明,白头翁不同提取物及复方对球虫孢子化卵囊有微弱的抑杀效果,对鸡柔嫩艾美耳球虫感染预防效果较差,不宜作为鸡柔嫩艾美耳球虫病的预防和治疗药物。     

不同地理株柔嫩艾美耳球虫对地克珠利敏感性试验

进行了3个不同地理株的柔嫩艾美耳球虫(吉林株、山东株、黑龙江株)对地克珠利饮水剂的敏感性试验.分别给予试验组鸡1×105个孢子化柔嫩艾美耳球虫卵囊,感染后饮水给予地克珠利药物治疗.结果表明,3株球虫的敏感性不同,其敏感顺序为:山东株＞黑龙江株＞吉林株.由此可见,柔嫩艾美耳球虫不同地理株间存在对地克珠利的敏感性差异.     

6种杀虫剂对鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化率及致病力的影响

为评价杀虫剂用于球虫卵囊消毒的可能性,检测了丁硫克百威、氯虫苯甲酰胺、茶核苏云菌、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、辛硫灭多威和甲基硫菌灵对柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化率的影响。结果发现,氯虫苯甲酰胺0.3μL/m L处理组球虫孢子化率为61.25%,甲氨基阿维菌素苯甲酸盐1、3μg/m L和30μg/m L处理组球虫孢子化率分别为60%、63.75%和65%,均显著低于生理盐水处理组。进一步利用氯虫苯甲酰胺(0.3μL/m L)和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(1μg/m L)处理球虫孢子化卵囊1 h和24 h并接种鸡,各处理组抗球虫指数(ACI)均在100以上,高于生理盐水处理对照组(ACI=53.5),其中以甲氨基阿维菌素苯甲酸盐处理1 h组ACI值最高,达129.7。表明氯虫苯甲酰胺和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐能显著降低柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化率及致病力,具有用于鸡球虫卵囊消毒的可能性。     

净球散对鸡球虫病的疗效试验

以１５日龄肉仔鸡为试验动物，研究了纯中药制剂净球散对鸡柔嫩艾美耳球虫病的疗效以及对卵囊孢子化影响。结果表明：在饲养中添加１％的净球散具有良好的抗球虫效果，抗球虫指数（ＡＣＩ）达到１８７。用５０％、１００％的净球散煎剂浸泡７ｄ后，再用２．５％的重铬酸钾培养３ｄ，鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化率分别为６５．４２％、６６．２３％，抑制作用明显，说明净球散是一种较理想的抗球虫中药制剂。     

鸡球虫病诊断与治疗

鸡球虫病是一种肠道寄生性原虫病,是艾美耳属的多种球虫寄生在鸡肠粘膜内而引起。其中寄生在盲肠粘膜上皮细胞内的柔嫩艾美耳球虫的致病力最强,称为盲肠球虫;另一种是侵害小肠粘膜的毒害艾美白球虫,又称小肠型球虫。通过球虫卵囊传播,鸡吞食孢子化卵囊而感染,主要危害3月龄以内的幼鸡,特别是15～45日龄的鸡最易发生,暴发时常造成大批死亡。     

柔嫩艾美耳球与鸡体的相互作用

鸡吞食柔嫩艾美耳球虫卵囊后感染，子孢子穿过绒毛上皮和固有层，进入隐窝上皮细胞，经数次无性生殖和有性生殖，形成裂殖子和配子体。大配子被小配子受精后发育成卵囊并脱落到粪便中，鸡感染球虫后，鸡体免疫系统抑制球虫的发育有三个时期：子孢子寻找穿透位点时；子孢在子绒毛上皮时；子孢子穿过固有层时。     

吉林市城区鸡球虫病的流行病学调查

通过对吉林城区具有代表性的鸡场进行鸡球虫病的感染情况调查,采集鸡新鲜粪便,用饱和盐水漂浮法收集卵囊,制片镜检,观察卵囊和孢子化卵囊的形状、颜色,测量卵囊的大小,鉴定出艾美耳属球虫3种,即柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫,其中柔嫩艾美耳球虫为优势种,其主要侵害鸡的盲肠,导致贫血、消瘦甚至死亡,发病多为15～40日龄的雏鸡,为有效预防鸡球虫病提供参考.     

柔嫩艾美耳球虫表面抗原（EtSAG）基因的分离及鉴定

利用本实验室前期获得的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）孢子化卵囊和未孢子化卵囊差异表达ESTs序列,选取编号为BW4-C03的孢子化卵囊,采用RACE技术,获得该基因全长序列。经BLAST分析,该序列与柔嫩艾美耳球虫表面抗原有72%以上的同源性,命名为EtSAG。利用荧光定量PCR（Real-time PCR）检测发现该基因在孢子化卵囊的转录拷贝数最高,且随着孢子化时间的延长,转录拷贝数逐渐增加。采用原核表达载体pET-28C表达该基因,得到的融合蛋白大小约为36 kDa,符合预期大小。经Western blot分析,该重组蛋白可被兔抗柔嫩艾美耳球虫的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。本研究结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

鸡球虫病防治

<正>1病原鸡球虫属原生动物门艾美耳科艾美耳属,鸡球虫是宿主特异性和寄生部位特异性很强的原虫。球虫卵囊须经孢子生殖,形成孢子化卵囊,方具有感染性。球虫卵囊随鸡粪排出后,在合适的温度(22～28℃)、湿度(75%)和有氧条件下,经过孢子化生殖,形成具有感染性的孢子化卵囊,孢     

柔嫩艾美耳球虫的分离鉴定与致病性测定

本实验采用单卵囊分离技术分离纯化球虫,并根据其临床病理变化、潜隐期、最短孢子化时间等指标综合判定其为柔嫩艾美耳球虫。用纯化所得球虫卵囊进行致病性试验,结果表明:该柔嫩艾美耳球虫致病力较强,半数致死量为7.52×104个/只。     

中药治疗幼隼球虫病

幼隼球虫病是由原生动物门的球虫所引起的一种寄生原虫病,病原为艾美耳属的7种球虫,其中危害最大的有两种：柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫,前者寄生于盲肠中,后者寄生于小肠黏膜中。在临床上往往是多种球虫混合感染。球虫寄生于肠上皮细胞内,球虫卵囊随病幼隼粪便排出体外,在温暖和潮湿的环境里,卵囊经1～3d发育成具有感染性的孢子化卵囊,内含成熟的子孢子。