内皮素3对小鼠黑色素沉着相关基因表达的影响

试验旨在探究内皮素3（endothelin 3，EDN3）在不同毛囊时期小鼠皮肤中是否存在差异表达及其对黑色素细胞黑色素沉着相关基因表达的影响。通过RT-PCR技术对EDN3、EDNRB在不同毛囊时期小鼠皮肤的表达情况进行定量分析发现，EDN3和EDNRB在小鼠不同毛囊时期皮肤样品中均有表达，在毛囊生长初期和中期小鼠皮肤中EDN3 mRNA表达量是末期的2.18倍（P < 0.05）和1.15倍（P > 0.05），毛囊生长初期和中期EDNRB mRNA表达量是末期的16.8倍（P < 0.01）和9.9倍（P < 0.01）。为了进一步揭示EDN3在黑色素细胞色素沉着中的重要作用，通过细胞转染技术使小鼠黑色素细胞过表达EDN3并测定其黑色素含量及色素沉着相关基因的表达水平发现，与空载组相比，体外转染EDN3的黑色素细胞黑色素含量明显增加。此外，MITF mRNA显著降低（P < 0.05）；TYR、TYRP2、EDNRB、c-Kit和EDN1 mRNA显著升高2.04倍（P < 0.05）、1.44倍（P < 0.05）、1.41倍（P < 0.05）、5.21倍（P < 0.01）和3.27倍（P < 0.01）。MITF蛋白水平显著降低（P < 0.05），TYR、TYRP2、EDNRB和c-Kit蛋白水平显著升高1.48倍（P < 0.01）、4.61倍（P < 0.01）、1.27倍（P < 0.05）和2.64倍（P < 0.01）。综上所述，EDN3在不同毛囊时期小鼠皮肤中均可有效表达，且表达量存在显著差异。黑色素细胞中过量表达EDN3，使色素沉着相关基因的表达量及黑色素含量增加。     

过表达miR-193b对黑色素细胞中MITF和TYR表达的影响

旨在探讨miR-193b对黑色素生成关键基因MITF和TYR表达的影响,进而说明miR-193b对黑色素形成的影响。本研究通过细胞转染技术,在绵羊黑色素细胞中过表达miR-193b,检测黑色素细胞中黑色素含量的变化,采用实时荧光定量PCR和Western blot分别对转染细胞中MITF和TYR mRNA和蛋白表达水平进行测定。结果显示:过表达miR-193b的黑色素细胞,黑色素含量明显减少;MITF mRNA和TYR mRNA表达均显著降低(P0.01),分别降低0.233倍和0.198倍;MITF和TYR蛋白表达量也显著降低(P0.01),分别降低0.232倍和0.321倍。本研究表明,过表达miR-193b使黑色素细胞中MITF和TYR表达量降低而间接影响黑色素生成。     

IFN-γ对羊驼皮肤黑色素细胞增殖和黑色素合成的影响

旨在研究IFN-γ对黑色素细胞增殖及黑色素合成的影响。不同浓度IFN-γ(0.0、0.5、2.0、8.0、16.0、32.0、64.0ng·mL-1)分别处理羊驼皮肤黑色素细胞24、48和72h。MTT法检测黑色素细胞活力,紫外分光光度法检测黑色素含量,qRT-PCR检测MC1R、TYR、TYRP1、MITF、DCT及NOS2mRNA水平的变化。结果显示,24h黑色素细胞活力受到抑制,72h细胞活力恢复且黑色素合成增强;IFN-γ可促进黑色素含量的增加,以32.0ng·mL-1 IFN-γ增加极显著。TYRP1、MITF、DCT、NOS2mRNA相对表达量显著增加(P0.05),MC1R、TYR mRNA相对表达量增加不显著(P0.05)。IFN-γ可促进黑色素细胞树突增长,可能有助于黑色素的转运;IFN-γ诱导黑色素的合成,可能与黑色素细胞中NOS2和MITF的高表达有关,可能通过NO/cGMP/PKG介导的信号通路合成黑色素。     

SOX5影响小鼠皮肤黑色素细胞MITF-M表达和黑色素生成

旨在探讨SOX5在小鼠皮肤毛色中的作用。本研究随机选取出生后12d的C57BL/6品系黑色、棕色、灰色小鼠各3只,采用实时荧光定量PCR、Western blotting和免疫组织化学方法对SOX5在黑色、棕色和灰色小鼠皮肤中的表达差异进行分析;并构建SOX5真核表达载体;运用体外转染的方法,转染小鼠黑色素细胞并检测与色素形成相关基因的表达水平,同时测定黑色素含量。结果表明:1)SOX5在不同毛色小鼠皮肤中均有表达,SOX5在黑色和灰色小鼠皮肤中mRNA和蛋白相对表达量高于棕色小鼠皮肤,均差异极显著(P0.01);且其主要表达部位为毛囊外根鞘。2)转染组与空载组相比,MITF-M、TYR、TYRP1、TYRP2、PMEL、OA1表达量均显著(P0.05)或极显著(P0.01)升高,黑色素含量也极显著增加(P0.01)。3)过表达MITF-M对SOX5存在负反馈作用。综上表明,SOX5通过调控MITF-M影响色素的生成进而参与毛色的形成。     

不同毛色牦牛皮肤组织学观察及MC1R基因功能验证

旨在阐明不同毛色牦牛皮肤组织形态学特点及MC1R调控黑色素合成的可能分子机制。采集大通牦牛(黑褐色)和天祝白牦牛(白色)各6头的背部皮肤组织,用甲苯胺蓝染色法分别对不同毛色牦牛皮肤组织进行染色,观察黑色素和成熟黑色素细胞的含量差异及分布特征,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MC1R在不同毛色牦牛皮肤中的表达差异。B16小鼠黑色素瘤细胞中转染shRNA MC1R干扰载体后,应用qRT-PCR和Western blot检测转染效率,分析比较各组中与毛色相关基因(Agouti、MITF、TYR)的表达差异性,利用酶标仪检测不同时间点黑色素产量。结果表明,两种毛色牦牛的表皮和毛囊周围均分布着大量的黑色素细胞,但天祝白牦牛仅在表皮基底层和毛根处检测到少量黑色素,而大通牦牛表皮层和毛囊处产生大量黑色素。与大通牦牛相比,天祝白牦牛皮肤中MC1R表达量极显著降低(P0.01)。在成功抑制MC1R的B16细胞中,TYR表达量极显著降低(P0.01),MITF表达量显著降低(P0.05),而Agouti表达量未发生显著变化(P0.05);同时黑色素含量减少。综上表明,黑色素大量沉积与MC1R高表达是导致牦牛毛色差异的原因。将shRNA MC1R载体成功转染B16小鼠黑色素瘤细胞后,MC1R的抑制情况与下游调控基因TYR表达一致,进而降低黑色素含量,说明MC1R对黑色素的合成及毛色形成起重要的调控作用。     

CDK5对羊驼皮肤黑色素细胞TYR和MITF mRNA表达的调节

为了证实CDK5是否参与羊驼毛色的形成,本研究主要对CDK5在羊驼黑色素细胞中调节TYR和MI TF的表达进行了研究.本研究首先采用免疫组织化学方法检测CDK5在羊驼皮肤黑色素细胞中的定位,再通过脂质体将CDK5转染于羊驼皮肤黑色素细胞,之后通过Western blot和qRT-PCR的方法检测转染后黑色素细胞中CDK5蛋白、TYR和MITF mRNA的表达.免疫组化结果显示CDK5位于黑色素细胞的胞质和细胞核内;Western blot结果显示转染组黑色素细胞中CDK5蛋白表达量明显高于对照组;qRT-PCR结果显示CDK5可下调MITF的表达,同时上调TYR的表达,转染组黑色素细胞中MITF和TYR mRNA的表达水平分别是对照组细胞的0.264 9和3.931 3倍.结果揭示CDK5可能通过调节黑色素细胞核中TYR和MITF mRNA的表达,从而参与调控羊驼毛色形成.     

α-黑素细胞刺激素对泰和乌骨鸡皮肤黑色素细胞增殖及黑色素合成的影响

旨在研究α-黑色素细胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)对泰和乌骨鸡皮肤黑色素细胞增殖和黑色素生成的影响,初步探讨α-MSH调控泰和乌骨鸡黑色素合成的机制。利用体外培养的乌骨鸡皮肤黑色素细胞,观察不同质量浓度α-MSH(0、2.5、5、10 mg/L)及其拮抗剂([D-Trp7,Ala8,D-Phe10]α-MSH(6-11)-amide,D-AD-MSH)处理后黑色素细胞增殖、黑素皮质素受体1(melanocortin 1receptor,MC1R)基因表达、酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)活性、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量和黑色素含量的变化。结果表明,不同质量浓度的α-MSH对细胞有促增殖的作用,2.5mg/Lα-MSH处理组细胞的增殖率极显著高于不添加α-MSH的对照组(P0.01)。α-MSH剂量依赖性地提高MC1R基因表达。2.5mg/Lα-MSH处理组细胞cAMP的含量显著高于对照组(P0.05),其他处理组之间差异不显著(P0.05)。不同浓度的α-MSH处理均极显著提高细胞TYR活性(P0.01或P0.05)。与对照组相比,2.5mg/Lα-MSH极显著提高皮肤黑色素细胞的黑色素含量(P0.01),5、10.0mg/Lα-MSH具有提高黑色素细胞黑色素含量的趋势(P0.05)。α-MSH拮抗剂D-A-D-MSH预处理乌骨鸡皮肤黑色素细胞显著抑制α-MSH对黑色素细胞MC1R基因表达、cAMP含量、TYR活性和黑色素含量的上调作用(P0.05)。α-MSH能促进泰和乌骨鸡皮肤黑色素细胞增殖,提高MC1R基因表达、cAMP含量以及TYR活性并进而促进黑色素合成。     

小鼠黑色素细胞沉默及过表达色素上皮衍生因子对黑色素合成的影响

旨在研究色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)与黑色素合成调控因子之间的互作关系，探索PEDF对黑色素细胞活力和黑色素合成的调控作用，为研究动物毛色形成机制提供基础。本研究将PEDF siRNA及PEDF过表达载体分别转染小鼠黑色素细胞，对黑色素细胞活力、黑色素含量进行检测，采用qRT-PCR、Western blotting及细胞免疫荧光对PEDF、Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表达和定位进行检测。黑色素细胞PEDF沉默后，黑色素细胞的细胞活力增强，黑色素含量增加，Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的mRNA和蛋白表达量升高；黑色素细胞PEDF过表达后，黑色素细胞活力减弱，黑色素含量减少，Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的mRNA和蛋白表达量降低。细胞免疫荧光结果显示：PEDF、Wnt1、MITF、β-catenin表达于黑色素细胞的细胞质；Wnt3α表达于黑色素细胞的细胞质和细胞膜。本研究证实：PEDF使黑色素细胞活力减弱，可通过下调促黑色素生成相关的因子Wnt1、W...     

黑色素沉积相关基因在丝羽乌骨鸡和余干乌骨鸡胸肌和腿肌中的表达分析

试验旨在分析黑色素相关基因在丝羽乌骨鸡和余干乌骨鸡中的差异表达。试验测定丝羽乌骨鸡和余干乌骨鸡2～17周龄胸肌和腿肌肉色亮度值，比较黑色素相关基因TYR、TYRP1、PMEL和MITF在两种乌骨鸡胸肌和腿肌的差异表达量。结果显示：2周龄时余干乌骨鸡胸、腿肌和丝羽乌骨鸡胸肌肉色亮度值显著小于其他周龄（P<0.05），余干乌骨鸡6周龄胸、腿肌亮度值显著大于6周龄丝羽乌骨鸡（P<0.05）,17周龄时丝羽乌骨鸡腿肌亮度值显著大于余17周龄干乌骨鸡（P<0.05）;4个基因在2种乌骨鸡2～17周龄的胸肌和腿肌中相对表达量的变化趋势基本一致，2周龄时表达量较高，随后呈现下降趋势。同时黑色素相关基因表达量存在品种效应，2周龄时TYR和TYRP1基因在丝羽乌骨鸡腿肌中表达量较高，17周龄时MITF基因在余干乌骨鸡腿肌中表达量较高。TYR、TYRP1、PMEL和MITF 4个基因在2种乌骨鸡胸肌和腿肌中表达均呈现显著正相关（P<0.05）;4个基因表达与2种乌骨鸡肉色亮度值显著负相关（P<0.05），且对黑色素沉积呈现正调控作用。研究表明，在乌色度选种时可以将TYR、TY...     

酪氨酸酶转运对黑色素生成影响研究进展

哺乳动物毛色的形成依赖于黑色素细胞中黑色素数量及分布比例,酪氨酸酶类(TYR/TYRP1)的转运及其活性是黑色素合成的关键。衔接蛋白(AP-1/3)和溶酶体相关细胞器生物合成复合物(BLOC-1,2,3)将TYR/TYRP1从早期核内体转运至黑素小体,若TYR/TYRP1无法转运至黑素小体中,黑色素合成则会受到抑制。ATP7A将铜离子转移到TYR/TYRP1,从而激活TYR/TYRP1活性,ATP7A的减少同样会使黑色素细胞中黑色素合成量减少。关注这些复合物在转运TYR/TYRP1的作用及影响其活性的因素,可以从不同的角度解析黑色素合成机理,以此为基础探索哺乳动物毛色的淡化机制,以期为阐明人类黑色素合成障碍的相关疾病提供理论依据。     

Nkx2-5基因的克隆及其与黑色素细胞黑色素生成相关性的研究

本实验旨在探究Nkx2-5基因在小鼠黑色素细胞中是否表达,同时通过生物信息学的方法预测其是否与调控黑色素生成的基因有相互作用。结果表明:转录因子Nkx2-5在小鼠黑色素细胞中表达,其编码的蛋白作为转录因子与下游基因作用的主要位点在144~196位氨基酸残基处,且其在黑色素生成中的关键基因MITF、TYR、TYRP1、TYRP2的启动子中都有作用位点,同时Nkx2-5蛋白与对神经嵴分化有重要影响的Hand1、Hand2存在相互作用,故可以推测转录因子Nkx2-5在黑色素细胞的黑色素生成中发挥着重要的作用,进而为从分子水平解释动物被毛白化的发病机理提供新的思路。     

AGRP基因在山羊组织表达及其对黑色素生成的作用机制

为了阐明AGRP基因在山羊皮肤表达模式以及对黑色素生成的作用机制。本研究通过qRT-PCR法检测AGRP基因在3只酉州乌羊不同组织和3只板角山羊皮肤组织表达情况。同时,通过体外试验分析不同浓度外源性AGRP蛋白对黑色素细胞影响,利用EdU法检测细胞活力、环磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)试剂盒检测cAMP活性、并检测其对真黑色素含量和黑素生成相关基因黑素皮质素1型受体(melanocortin 1 receptor,MC1R)、酪蛋白酶(tyrosinase,TYR)、酪蛋白酶相关蛋白酶1(tyrosinase related protein 1,TYRP1)、多巴色素互变异构酶(dopachrome tautomerase,DCT) mRNA表达的影响。结果表明,AGRP基因在酉州乌羊组织均有表达,其中在垂体中表达最高,与其他组织相比差异显著(P<0.05);板角山羊与酉州乌羊皮肤中AGRP表达量差异极显著(P<0.05)。添加不同浓度AGRP蛋白对黑色素生成和黑色素细胞增殖影响不显著(P>0.05);随着AGRP浓...     

RNAi对羊驼黑色素细胞中MC1R表达量及黑色素合成的影响

旨在研究RNAi对羊驼黑色素细胞中MC1R表达量及黑色素合成的影响。合成3对MC1RsiRNA,将MC1RsiRNA瞬时转染羊驼黑色素细胞,qRT-PCR法检测MC1R mRNA表达量,细胞免疫组化技术对MC1R进行定位,利用吸光度值检测黑色素细胞中黑色素的合成量。结果显示,siRNA2组和siRNA3组的MC1R mRNA相对表达量极显著低于空白对照组(P0.01),siRNA1组和阴性对照组与空白对照组相比差异不显著(P0.05),siRNA2、siRNA3两组的黑色素合成量低于空白对照组,差异极显著(P0.01)。将MC1RsiRNA成功转染到羊驼黑色素细胞中,筛选出有效MC1RsiRNA,MC1R的抑制情况与黑色素合成量一致,说明黑色素细胞中MC1R对黑色素的合成具有调控作用,其作用机制需进一步研究。     

miR-186-5p与α-MSH互作对绵羊黑素细胞黑色素生成的影响

黑色素合成受多种基因和miRNAs的调控,为了研究miR-186-5p与α-MSH协同作用对绵羊黑素细胞黑色素生成的影响。本研究在绵羊黑素细胞中转染miR-186-5p表达载体,同时添加α-MSH,通过实时荧光PCR (quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测MITF、TYR、TYRP1和TYRP2 4种可能与之相关的基因表达情况;利用免疫组化检测MITF蛋白在黑素细胞中的表达和亚细胞定位;通过分光光度法测定黑色素含量变化;利用划痕试验测定细胞迁移情况,试验分为miR-186-5p转染组、miR-186-5p+α-MSH互作组和对照组,每组3个重复。结果显示,miR-186-5p能够抑制绵羊黑素细胞中MITF、TYR、TYRP1和TYRP2的表达,并最终抑制黑色素的生成。而添加α-MSH能缓解miR-186-5p对MITF、TYR、TYRP1和TYRP2表达的抑制作用,进而在一定程度上恢复黑色素的含量。另外,miR-186-5p还能抑制细胞分裂,并阻碍细胞的迁移,而α-MSH无法抵消miR-186-5p产生的这种负面影响。上述结果表明,在绵羊黑素细胞中,miR-186-5p和α-MSH均参与调控黑色素合成途径,其中,miR-186-5p主要起负调控作用,而α-MSH主要参与相关位点的正调控,并能部分恢复miR-186-5p导致的黑色素含量下降。值得注意的是,miR-186-5p还参与调控细胞的增殖和迁移,而α-MSH不参与相关调控。     

黑色素细胞中过量表达lpa-miR-nov-66对TYRP2的影响

本研究旨在探讨lpa-miR-nov-66对黑色素生成相关基因TYRP2的影响。采用细胞转染技术,在羊驼黑色素细胞中过表达lpa-miR-nov-66,运用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术和免疫印迹法(western blotting)技术分别检测转染lpa-miR-nov-66后黑色素细胞内TYRP2在mRNA和蛋白水平的表达差异。RT-PCR结果显示:TYRP2的部分片段扩增,扩增片段长度为151 bp。qRT-PCR和免疫印迹(western blotting)结果显示:与对照组相比,实验组TYRP2在mRNA表达水平显著降低,降低0.44倍;蛋白表达水平也显著降低,降低0.78倍。结果表明,lpa-miR-nov-66可以影响TYRP2的表达,可能参与了动物毛色的形成过程。     

内皮素受体B在不同毛色羊驼皮肤中的表达与定位

研究内皮素受体B(endothelin recepter B,EDNRB)在羊驼皮肤中的表达与定位,以及在不同毛色中的差异比较,探讨其在羊驼毛色形成中的作用及其相关机制。以不同毛色的成年羊驼为研究对象,用RT-PCR法检测EDNRB基因在不同毛色皮肤中的表达,并使用实时荧光定量PCR技术分析不同毛色羊驼皮肤EDNRB基因的相对表达量,采用Western blot法和免疫组织化学法对EDNRB在羊驼皮肤中的表达进行定位和半定量分析。荧光定量PCR结果显示棕色羊驼中EDNRB基因的相对表达量是白色羊驼的2.1651倍;Western blot结果显示EDNRB蛋白在棕色组的表达显著高于白毛组(P0.05);免疫组化试验结果显示,EDNRB在羊驼皮肤的毛乳头、毛根鞘及表皮细胞中均有表达,且在棕色皮肤组织中显著表达(P0.05)。试验结果提示,EDNRB与羊驼黑色素细胞的活动密切相关,并参与了羊驼毛色和肤色的形成。     

内皮素-1(ET-1)对羊驼皮肤黑素细胞增殖和黑素生成的影响

旨在研究内皮素-1 (Endothelin-1,ET-1)对羊驼皮肤黑素细胞(Melanocyte,MC)增殖和黑素合成的影响.本研究中,体外培养正常羊驼皮肤黑素细胞,观察不同浓度ET-1(0、0.1、1、10、100 nmol·L-1)对羊驼皮肤黑素细胞增殖、黑素含量、内皮素受体B(Endothelin recepter B,EDNRB)基因、酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)基因、酪氨酸相关蛋白-1(Tyrosinase related protein 1,TRP-1)基因和表皮黑皮素1受体(Melanocortin 1 receptor,MC1R)基因表达量的影响.结果表明,ET-1处理羊驼皮肤黑素细胞3d后,羊驼皮肤黑素细胞增多,黑素含量、EDNRB、TRP-1和TYR基因表达量都明显增加(P＜0.05),以10 nmol·L-1组最为显著.ET-1能诱导羊驼皮肤黑素细胞增殖、树突增长,诱导EDNRB、TYR和TRP-1基因表达量增高,使黑素合成增加；同时诱导MC1R基因表达量增高,从而通过α-MSH信号通路对羊驼黑色素的生成产生影响.