多头带绦虫六钩蚴Tm45W基因的克隆表达与免疫原性分析

为分析多头带绦虫Tm45W重组蛋白的免疫原性,利用RT-PCR技术首次从激活的多头带绦虫六钩蚴中扩增出多头带绦虫Tm45W基因。将扩增产物重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建pET32a-Tm45W表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白;表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析后,将纯化的Tm45W重组蛋白免疫小鼠,用ELISA检测其血清抗体。结果显示,Tm45W基因全长为813bp,其开放阅读框为765bp,编码255个氨基酸,与多头带绦虫新疆株多头蚴45m基因(序列号:EU326106)的部分序列同源性为90.60%;表达的重组蛋白大小为45ku,与脑多头蚴病羊血清的免疫印迹分析呈阳性反应;小鼠免疫后第1周血清中即可检测到抗Tm45W蛋白的特异性抗体,并于免疫后第35天达到高峰。结果表明Tm45W重组蛋白具有较好的反应活性,能引起机体较强的体液免疫反应。     

多头带绦虫黏着蛋白TmAdh1基因的克隆及原核表达

为研究多头带绦虫黏着蛋白TmAdh1的功能,利用PCR分别以多头带绦虫基因组DNA和cDNA为模板扩增TmAdh1的基因组序列和cDNA序列,并利用生物信息学软件对该基因进行预测分析。将TmAdh1基因片段连接至原核表达载体pGEX4T-1进行原核表达,并利用Western-blot分析该蛋白的抗原性。结果显示,TmAdh1的基因组序列长1 848bp,由2个内含子和3个外显子组成,其开放阅读框的长度为402bp,编码133个氨基酸残基。预测分析表明,TmAdh1蛋白含有1个N端信号肽序列、1个纤连蛋白三型(FnⅢ)结构域、1个糖基化位点和8个线性B细胞抗原表位。在原核系统成功表达了约40ku的重组蛋白TmAdh1,用其免疫小鼠制备超免疫血清。Western-blot试验表明,重组蛋白TmAdh1可以与免疫小鼠血清反应。以上研究结果表明,多头带绦虫TmAdh1基因是带科绦虫宿主保护性抗原的同源基因,可作为脑多头蚴病疫苗的候选分子。     

多头带绦虫Tm16基因的克隆表达与免疫原性分析

为分析多头带绦虫Tm16重组蛋白的免疫原性,利用RT-PCR技术从激活的多头带绦虫六钩蚴中扩增Tm16基因,将扩增产物亚克隆入pET32a(+)载体中,构建pET32a-Tm16表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白;表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析后,将纯化的Tm16重组蛋白免疫小鼠,用ELISA检测其血清抗体。结果显示,多头带绦虫Tm16基因序列长569bp,包括1个399bp的开放阅读框,与已报道的Tm16基因(序列号:EF672036)的序列同源性为99.8%。表达的重组蛋白大小约为30.69ku,与脑多头蚴病羊血清的免疫印迹分析呈阳性反应;小鼠免疫1周后血清中即可检测到抗Tm16蛋白的特异性抗体,并于免疫后第5周达到高峰。结果表明Tm16重组蛋白具有较好的免疫原性,可作为脑多头蚴病疫苗的候选抗原。     

多头带绦虫TPx基因片段的克隆及原核表达

从自然感染的病羊脑内采集多头蚴原头节,提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增多头带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TmTPx)基因片段,PCR产物连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α后测序,发现克隆到的TmTPx基因片段开放阅读框为453 bp,编码150个氨基酸.对TmTPx基因片段进行限制性酶切后连接到表达载体pGEx-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-TmTPx,转化大肠杆菌DH5a后筛选阳性克隆,经限制性酶切分析、PCR及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21,以IPTG进行诱导表达,用SDS-PAGE分析表达产物.结果显示,成功表达了大小约为43 ku的融合蛋白.对表达产物纯化后免疫家兔,采集血清用ELISA测定抗体效价,发现兔抗TmTPx重组蛋白的抗体能够与多头蚴原头节抗原发生特异性反应,说明该重组蛋白具有较好的免疫原性.     

应用TmAdh3重组蛋白建立绵羊脑多头蚴病间接ELISA诊断方法的研究

为评价多头带绦虫TmAdh3重组蛋白作为脑多头蚴病诊断抗原的潜力,根据多头带绦虫TmAdh3基因组序列,人工优化合成TmAdh3基因ORF序列并连接至表达载体pGEX-4T-1,转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,利用Western-blot分析纯化的重组蛋白的反应原性,优化检测条件,建立脑多头蚴病间接ELISA诊断方法并进行评价。结果显示,成功表达了分子质量大小为39.0 ku的重组蛋白rTmAdh3。间接ELISA检测的最适反应条件为：5.00μg/m L重组蛋白rTmAdh3在4℃包被过夜;1∶100稀释血清在37℃孵育30min;1∶10 000稀释的HRP标记的酶标二抗在37℃孵育45 min,底物避光显色10 min。应用建立的方法可检测到人工感染脑多头蚴后第3～8周的绵羊血清;对40份自然感染脑多头蚴的绵羊（剖检确认脑部有包囊）血清的阳性检出率为22.5%(9/40)。与细粒棘球蚴感染绵羊血清和细粒棘球蚴Eg95免疫绵羊血清交叉反应率为5%(4/80)。结果表明,本研究建立的以TmAdh3重组蛋白作为检测抗原的间接ELISA诊断方法可用于绵羊脑多头蚴感染早期的筛选。     

猪带绦虫TS61抗原基因的克隆及表达分析

以PCR扩增猪带绦虫TS61抗原基因 ,与载体 pUC18连接后进行测序 ;并构建了该基因的pGEX 1λT原核表达载体 ,制备了其原核表达产物 ,进行浓度梯度SDS PAGE和免疫印迹分析 ;对该基因的碱基序列及其编码蛋白进行了同源性比较。结果表明 ,猪带绦虫TS61抗原基因含 893对碱基 ,编码含 70个氨基酸残基的多肽 ,分子质量为 8.0ku ,等电点为4.19。在基因库和欧洲分子生物学实验室数据库中均未发现该基因的同源序列。重组质粒在大肠埃希氏菌中表达的融合蛋白分子质量为 3 4ku ,该蛋白抗原能被兔抗猪囊尾蚴超免疫血清所识别。     

猪带绦虫Ddi1-like蛋白的真核表达及其抗血清的制备

为了对DNA损伤诱导蛋白1(Ddi1-like)基因功能进行研究,本研究参考GeneDB中猪带绦虫基因组注释信息,通过设计5′和3′端特异性引物,利用cDNA末端快速扩增法(RACE)获得全长cDNA,并在毕赤酵母GS115中进行诱导表达;将纯化后的Ddi1-like重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗血清。结果,成功利用RACE获得Ddi1-like基因的全长cDNA序列;在真核表达系统中,绦虫上的Ddi1-like重组蛋白获得表达;SDS-PAGE和Western-blot分析表明,获得重组蛋白即为Ddi1-like蛋白;免疫后获得抗血清,其效价达到1∶12 800。上述结果为后续研究Ddi1-like蛋白的酶切活性研究提供了基础。     

杜氏利什曼原虫NH36基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

应用RT-PCR技术扩增并克隆杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)NH36编码基因,经鉴定及序列分析,构建其原核重组表达载体,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting鉴定其表达产物。结果显示,获得的NH36开放阅读框为945 bp,编码314个氨基酸残基,与GenBank上发表的国际标准株NH36编码基因序列以及氨基酸序列同源性分别为88.57%(837/945)和89.17%(280/314)。表达蛋白为36 ku,经1 mol/L IPTG诱导6 h后的表达量最高;薄层扫描显示表达的蛋白占菌体蛋白总量的57%;该蛋白可被抗杜氏利什曼原虫的多克隆抗体血清识别。     

鸡myostatin基因成熟区段DNA的克隆及其在甲醇酵母中的融合表达

根据GenBank中鸡myostatin(AF019621)成熟区段的cDNA序列设计了1对引物,利用PCR技术扩增了萧山鸡myostatin的成熟区段,构建了重组真核表达载体myostatin-pPIC9K,并在甲醇酵母中融合表达了myostatin蛋白。结果发现,萧山鸡myostatin基因存在2处碱基变异:T204→C204(编码的氨基酸没有变),C205→T205(编码的氨基酸由Pro变成Ser),从而产生了1个EspⅠ或Bpu1102Ⅰ限制性内切酶酶切位点。核苷酸序列同源性分析表明,myostatin基因成熟区段DNA在不同物种间具有高度的保守性。SDS-PAGE鉴定结果表明,表达的目的蛋白(26 ku)具有生物学活性。     

柔嫩艾美耳球虫SSADH基因的克隆原核表达与序列分析

为研究柔嫩艾美耳球虫琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)的生物学功能,参考已公布的柔嫩艾美耳球虫SSADH(EtSSADH)的基因序列设计特异性引物,运用RT-PCR方法扩增EtSSADH基因序列,将扩增产物克隆入pGEX-4T-1载体进行诱导表达。同时,利用在线软件对该基因编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示,EtSSADH基因的ORF序列长1896 bp,编码631个氨基酸;该编码蛋白主要定位于线粒体,不含信号肽,无跨膜结构域;将EtSSADH与不同物种SSADH氨基酸序列进行比对,发现该蛋白氨基酸序列之间具有较强的保守性。诱导表达后获得分子质量约91.18 ku的重组蛋白。EtSSADH基因的成功克隆与表达为该酶的功能研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫SSADH基因的克隆原核表达与序列分析

为研究柔嫩艾美耳球虫琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)的生物学功能,参考已公布的柔嫩艾美耳球虫SSADH(Et SSADH)的基因序列设计特异性引物,运用RT-PCR方法扩增Et SSADH基因序列,将扩增产物克隆入p GEX-4T-1载体进行诱导表达。同时,利用在线软件对该基因编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示,Et SSADH基因的ORF序列长1 896 bp,编码631个氨基酸;该编码蛋白主要定位于线粒体,不含信号肽,无跨膜结构域;将Et SSADH与不同物种SSADH氨基酸序列进行比对,发现该蛋白的氨基酸序列之间具有较强的保守性。诱导表达后获得分子质量约91.18 ku的重组蛋白。Et SSADH基因的成功克隆与表达为该酶的功能研究奠定了基础。     

猪带绦虫cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基(PKA-C)基因的鉴定及表达

为鉴定猪带绦虫cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基基因(Ts PKA-C),分析其作为诊断抗原的可行性,利用猪带绦虫基因组和转录组数据设计猪带绦虫Ts PKA-C特异引物,以猪带绦虫成虫总RNA为模板,通过RT-PCR扩增Ts PKA-C基因的完整ORF,并通过生物信息学分析进行鉴定。构建p ET-30a(+)-Ts PKA-C重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明,Ts PKA-C的ORF由1 032个核苷酸组成,编码343个氨基酸残基,与细粒棘球蚴和多房棘球蚴氨基酸序列的一致性分别达78.7%和98.0%;Ts PKA-C具有蛋白激酶A的结构域及其催化亚基特征性活性位点,且存在9个潜在的线性B淋巴细胞抗原表位。Ts PKA-C基因的表达产物主要以包涵体形式存在,且可与猪囊尾蚴病阳性血清发生反应,在42 ku处产生特异条带。本研究克隆并鉴定了Ts PKA-C基因,其表达产物可被猪囊尾蚴病阳性血清所识别。     

多房棘球蚴主要卵抗原p40-1的原核表达、多克隆抗体制备及其组织定位

初步确定MEAp40-1的基因特征及其组织分布特征。根据WormBase数据库中多房棘球蚴MEAp40-1序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术扩增MEAp40-1编码基因并构建重组表达质粒pET-28a-MEAp40-1,IPTG诱导表达并用His-Ni亲和层析柱纯化,制备多克隆抗体。通过间接ELISA方法检测多克隆抗体效价,应用免疫荧光技术定位MEAp40-1在原头蚴中的分布。通过生物信息学分析发现,多房棘球绦虫表达3种不同的MEAp40(MEAp40-1～3),分别分布在不同染色体上。系统进化树显示,每个多房棘球绦虫MEAp40基因与其相应的细粒棘球绦虫的同源基因组成一支。多房棘球绦虫MEAp40-1编码基因全长945 bp,编码314个氨基酸。7种绦虫的MEAp40-1蛋白很保守,均存在α晶体结构域,并且位于该结构域中的协同分子伴侣结合位点也非常保守。MEAp40-1重组蛋白大小约为37 ku,其多克隆抗体效价可达1∶409 600,可识别虫体中的MEAp40-1天然蛋白。MEAp40-1蛋白主要分布在多房棘球蚴后端,而头节、囊壁等其他部位均未见表达。结合以上研究结果,推测MEAp40-1蛋白在绦虫中的生物学功能保守,可能与多房棘球绦虫原头蚴的发育有关。     

弓形虫烯醇化酶2基因的原核表达与鉴定

为深入研究弓形虫烯醇化酶的生物学功能,根据已发表的eno2基因序列设计引物,通过RTPCR方法扩增弓形虫RH株的eno2基因。将eno2克隆到载体pET-28a(+)中后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达并优化表达条件,SDS-PAGE分析表达情况,并通过Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定其免疫活性。结果显示,eno2基因全长1 353bp,编码444个氨基酸,与GenBank中登录的弓形虫烯醇化酶基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列的同源性均高达99.8%,与其他物种的烯醇化酶的同源性较低。在pH7.5、28℃和IPTG终浓度0.1mmol/L条件下,重组蛋白ENO2得到高效可溶性表达,分子质量约为55ku。Western-blot结果显示,重组蛋白能被感染弓形虫的犬阳性血清识别,说明ENO2具有较好的反应原性,可以作为血清学诊断抗原。IFA表明,NO2在弓形虫的细胞质和细胞核中均有分布。结果表明,本研究成功获得了可溶性、具有良好免疫活性的弓形虫重组蛋白ENO2,为深入研究其生物学功能奠定了基础。     

马麝朊蛋白基因的克隆与原核表达

为了解马麝朊蛋白基因的结构特征和其细胞型朊蛋白的性质,应用分子克隆和DNA重组技术进行了马麝朊蛋白基因的克隆、序列分析及其原核表达.序列分析表明,马麝朊蛋白基因编码区是包含在单一外显子内的完整开放阅读框,全长为771 bp,与马鹿、白尾鹿以及乳牛和绵羊朊蛋白基因相比,核苷酸序列和推导氨基酸序列的同源性分别为97.3%～98.1%和97.7%～98.8%,说明朊蛋白基因在同科和不同科的反刍动物间是保守的;成功构建了马麝重组朊蛋白(85～233 aa)原核表达栽体pGEX-MuPrP(85～233),并转化E.coli BL21(DE3),获得重组表达菌E.coli GST-MuPrP(85～233),该重组菌可产生预期大小约为42.4ku的融合蛋白GST-MuPrP(85～233),在优化表达条件下,可产生占细菌总蛋白量30%以上的融合蛋白,免疫印迹检测显示表达蛋白可与抗牛单克隆抗体4C11反应,表明该基因的各氨基酸突变并未影响其单抗4C11的识别表位.     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白D15基因的原核表达及其表达产物的免疫原性

根据GenBank中登录的副猪嗜血杆菌(HPS)D15基因鸟枪序列(登录号:NZ_ABKM01000005)设计1对特异性引物,以HPS5型SP毒株DNA为模板,通过PCR方法扩增了D15基因。将其进行T-A克隆,构建pMD18D15质粒并进行序列测定和分析。结果表明,D15基因含有一个2418bp的开放阅读框,编码805个氨基酸,与D15基因参考序列的同源性为99.9%。该HPSD15基因的推导氨基酸序列具有典型Omp85蛋白家族的拓扑结构特征。以pMD18D15质粒为模板,用PCR方法扩增HPSD15基因,并将其克隆到pET-28a(+)中,构建pETD15原核表达质粒,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)后,用IPTG诱导重组菌,并用SDS-PAGE和Western-blot检测诱导物。结果表明,pETD15重组表达质粒在大肠杆菌中实现了高效表达,融合蛋白的分子质量约为94ku,融合蛋白能被HPS阳性血清识别,提示该融合蛋白具有反应原性。昆明小鼠和豚鼠免疫试验结果表明,D15重组蛋白具有一定的诱导免疫保护反应的能力。     

猪带绦虫烯醇化酶基因的原核表达及鉴定

为了探索猪带绦虫烯醇化酶基因的生物学功能,以猪带绦虫幼虫cDNA为模板,PCR扩增获得烯醇化酶基因的ORF,并将其克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒。经IPTG诱导表达后,纯化表达产物,采用免疫印迹法分析表达产物的免疫反应性,并测定它与纤溶酶原的结合特性及酶活力。结果显示,该基因的ORF大小为1 302bp,表达大小约为53ku的重组蛋白;表达产物可被猪囊尾蚴病阳性血清识别;该重组蛋白具有纤溶酶原结合特性及酶活力。据此推测,猪带绦虫烯醇化酶可能在寄生虫入侵宿主过程中发挥作用,有作为药物靶标或疫苗候选分子的潜力。     

扩展莫尼茨绦虫烯醇化酶基因的克隆及其组织表达差异分析

为了探索烯醇化酶基因在扩展莫尼茨绦虫生长发育中的作用,通过基因质粒文库克隆分析了扩展莫尼茨绦虫烯醇化酶基因mRNA的全长序列,同时应用SYBRGreenreal-timeRT-PCR方法检测了该基因在虫体4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节的组织表达差异。序列分析结果表明,该基因全长1691bp,编码445个氨基酸,蛋白的理论分子质量为48.94ku,等电点为5.56,是含有螺旋和不规则卷曲较多的疏水性蛋白。相似性分析结果显示,其基因表达产物与肝片吸虫氨基酸的相似性达74.8%,属于磷酸丙糖异构酶磷酸盐结合蛋白家族。Real-timeRT-PCR结果表明烯醇化酶基因在虫体各发育阶段的表达丰度差异显著,其从高到低依次为成节、幼节、孕节和头节。据此推测该烯醇化酶基因在虫体寄生过程中对细胞内物质的代谢与能量的产生起关键作用。     

禽致病性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_JS09裂解酶的表达及其活性分析

为研究禽致病性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_JS09编码的裂解酶对宿主大肠杆菌的裂解作用,克隆表达了禽致病性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_JS09的裂解酶,并检测了裂解酶的菌体内外裂解活性。利用PCR扩增了禽致病性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_JS09裂解酶基因(Lysin基因),构建了重组表达质粒pET-32a(+)-LysJS09,测序验证后转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。在37℃IPTG浓度为1.0mmol/L诱导4h表达效果最好。重组融合蛋白LysJS09在BL21(DE3)中获得了高表达,在N端具有His标签,其分子质量约为38.9ku。重组融合蛋白以分泌型方式表达,经His-trap HP(GE)亲和层析柱纯化后获得的重组蛋白LysJS09的纯度为97%。裂解活性试验表明,该裂解酶单独使用和加入EDTA(0.1mol/L)均无体外酶活性;但菌体内裂解试验表明,表达的裂解酶对宿主菌具有一定的裂解作用。     

猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族基因的克隆与序列分析

为了研究猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因家族的结构特征及编码蛋白的功能,根据GeneDB中获得的2条cDNA序列设计引物,以猪囊尾蚴总RNA为模板进行RT-PCR,获得猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族(TsoStefin和TsoCystatin)基因的完整开放阅读框序列,并进行生物信息学分析。结果表明,所获得的2条序列均含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂特征性的结构域。TsoStefin由98个氨基酸残基组成,不含二硫键和糖基化位点,为细胞内蛋白;TsoCystatin由274个氨基酸残基构成,含有1个糖基化位点和2个相似的结构域,第1~18位氨基酸残基组成信号肽,属分泌型蛋白。系统发育树显示,TsoStefin是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族1的成员,TsoCystatin属家族2的成员,与部分绦虫的亲缘关系较近。从上述结果推测,所获得的2条基因均属于猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族基因。