IL-18基因转染对小鼠卵巢癌OVHM细胞免疫生物学特性的影响

目的 分析转染IL-18基因后,小鼠卵巢癌OVHM细胞的IL-18 mRNA及蛋白表达、培养上清中IL-18含量、IFN-γ诱生能力等免疫生物学特性的变化,初步探讨IL-18基因转染治疗卵巢癌的应用价值.方法 将逆转录病毒携带的小鼠活性IL-18基因转染至OVHM(OVHM/IL-18),以空载体转染的OVHM(OVHM/LXSN)和野生型OVHM作为对照.分别采用RT-PCR及免疫细胞染色法检测3组细胞的IL-18 mRNA及蛋白表达;ELISA方法测定细胞培养上清中IL-18的含量、及其诱生小鼠脾细胞产生IFN-γ的能力.结果 OVHM/IL-18细胞中可检测到IL-18 mRNA及蛋白的表达,而OVHM/LXSN和野生型OVHM细胞中未见表达.OVHM/IL-18细胞可分泌IL-18,于培养24 h时达高峰(138.25 pg/mL±12.36 pg/mL),之后逐渐减弱;OVHM/LXSN和野生型OVHM细胞上清中未检测出IL-18.0VHM/IL-18细胞培养上清诱生IFN-γ的水平明显高于VHM/KXSN和野生型OVHM细胞(分别为33.84 pg/mL±2.36 pg/mL、18.80 pg/mL±1.06 pg/mL、18.43 pg/mL±2.64 pg/mL,P<0.01),VHM/LXSN与野生型OVHM细胞之间未见显著差异(P0.05).结论 IL-18基因转染可有效提高小鼠卵巢癌细胞IL-18mRNA的表达及其蛋白的合成释放、诱导小鼠脾细胞产生IFN-γ.IL-18基因转染可纠正肿瘤细胞的IL-18低表达状态,诱导IL-18的抗瘤效应,可能对抑制肿瘤生长、促进肿瘤消退有一定的应用价值.     

新型细胞因子IL-24真核表达载体的构建、表达及其对肿瘤的抑制作用

目的：构建IL-24真核表达质粒，并研究其体内外表达对肿瘤细胞的生长抑制作用。方法：采用重组DNA技术构建IL-24真核表达质粒pEGFP-C1-IL-24。用脂质体法将重组质粒及空载体外转染HIC细胞，再经激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察其表达，用MTT法检测HIC细胞的体外增殖能力，用流式细胞仪检测细胞周期与凋亡。小鼠皮下接种转染IL-24真核表达质粒或空载的B16细胞观察其体内致瘤性的变化。小鼠实体瘤模型研究基因转染对肿瘤的生长抑制作用。结果：pEGF-C1-IL-24转染HIC细胞后，LSCM可观察到其表达。IL-24基因转染的HIC细胞体外增殖能力明显受到抑制．G2-M期细胞比例增高，细胞被阻滞在G2-M期。转染IL-24的B16细胞体外致瘤率降低。与对照组相比．IL-24基因治疗组肿瘤生长明显受到抑制（P〈0.05）。结论：IL-24基因转染的肿瘤细胞体外生长受抑。瘤内注射pEGFP-C1-IL-24可抑制肿瘤生长，具有明显的抗肿瘤作用。     

转染IL-27基因的食管癌细胞在裸鼠体内的抗肿瘤作用

目的将小鼠IL-27基因转染人食管癌细胞株,研究其在裸鼠体内的抗肿瘤活性.方法以逆转录病毒为载体,将IL-27基因转染人食管癌细胞株Eca109,获得表达IL-27的阳性细胞克隆(Eca109/IL-27),用ELISA法检测细胞IL-27的分泌.将Eca109/IL-27移植裸鼠腹腔,观察瘤细胞的成瘤性和裸鼠的生存期.用RT-PCR检测IL-27基因在裸鼠体内瘤组织中的表达,用流式细胞仪检测CD204表达、细胞周期和细胞凋亡变化.结果成功建立了表达IL-27基因的人食管癌细胞株Eca109/IL-27,该细胞培养上清中IL-27含量为(137.73±7.00)pg/ml,而Eca109/LXSN和Eca109细胞培养上清中未检出IL-27(P＜0.01),但Eca109/IL-27与Eca109/LXSN和Eca109细胞周期和细胞凋亡率无明显差异(P＞0.05).将Eca109/IL-27、Eca109/LXSN 和Eca109细胞分别接种裸鼠腹腔15天后,各组裸鼠均于腹腔形成多数瘤结节,Eca109/IL-27组明显少于Eca109/LXSN 和Eca109细胞组(P＜0.05);Eca109/IL-27组裸鼠的生存期(35天时均无死亡)明显长于Eca109/LXSN 和Eca109细胞组[分别为(23.33±1.52)、(24.00±1.37)天](P＜0.01);Eca109/IL-27组肿瘤组织中有p28和EBI3亚基基因表达,而Eca109/LXSN 和Eca109细胞组瘤组织中未见表达(P＜0.01);其CD204表达水平、细胞凋亡率也明显高于接种Eca109/LXSN与Eca109细胞组(P＜0.05);G0/G1和G2/M期细胞增多,S期细胞明显减少,与接种Eca109/LXSN和Eca109细胞组比较均有显著差异(P＜0.05).结论IL-27可于体内促进肿瘤细胞凋亡,阻滞细胞周期发展,提高CD204的表达,延长生存期,发挥抗肿瘤免疫活性.     

IL-17体内外抗肿瘤作用及其机制研究

目的研究IL-17体内外抗肿瘤作用及其机制,为IL-17基因疫苗进入临床提供实验依据。方法建立稳定转染小鼠IL-17全长基因的小鼠乳腺癌细胞(4T1/IL-17)及相应的对照细胞(4T1/pcDNA3.1、4T1),MTS法检测3种细胞的体外增殖情况;流式法检测3种细胞表面MHCI、MHCⅡ、LFA-1分子表达的变化及3种细胞的凋亡情况。建立荷瘤动物模型,观察3种细胞移植瘤在小鼠体内成瘤性、生长情况及小鼠生存期的变化。接种肿瘤细胞6周后分别检测3组小鼠脾细胞CTL杀伤活性、脾细胞增殖情况。用ELISA法检测小鼠脾细胞经刺激后产生IFN-γ、IL-12的情况;流式细胞技术检测4T1/IL-17细胞接种于小鼠体内的细胞凋亡情况及肿瘤组织细胞表面MHCI、MHCⅡ、LFA-1等分子表达的变化。结果转染IL-17基因后在体外对4T1/IL-17、4T1/pcDNA3.1和4T1细胞的增殖;MHCI、MHCⅡ、LFA-1分子表达;细胞凋亡无影响。将4T1/IL-17细胞接种小鼠体内后,荷瘤小鼠的肿瘤生长速度、体积均明显小于4T1/pcDNA3.1细胞组及4T1细胞组,生存时间也明显延长(P<0.05);肿瘤细胞凋亡率明显增高(P<0.05);细胞表面MHCI、MHCⅡ、LFA-1分子表达水平显著性增高(P<0.01);CTL杀伤活性及对ConA刺激的细胞增殖反应性均明显升高(P<0.01);可产生高水平的IFN-γ、IL-12,有显著性差异(P<0.01)。结论 IL-17在体外未显示抗肿瘤作用,IL-17在小鼠体内具有明显的抗肿瘤作用,其抗肿瘤作用与促进肿瘤细胞细胞凋亡及增强机体免疫应答有关。     

MDA-7/IL-24 inhibits the growth and induces the apoptosis of human breast cancer MDA-MB-231 cell line

目的 探讨IL-24基因转染乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖抑制和促凋亡作用.方法 利用脂质体将穿梭质粒pDC316-hIL-24-EGFP瞬时转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过RT-PCR检测转染后hIL-24基因mRNA的转录,Western blot检测转染后IL-24和caspase-3蛋白的表达,MTT比色法测定细胞增殖的抑制,流式细胞仪检测细胞的凋亡和细胞周期的变化,Hoechst 33258染色检测细胞凋亡.结果 IL-24基因可在MDA-MB-231细胞中成功转录及表达.IL-2可上调MDA-MB-231细胞中caspase-3蛋白表达.IL-24基因的表达使得乳腺癌MDA-MB-231细胞出现增殖抑制.流式细胞仪检测显示MDA-MB-231细胞DNA合成受到抑制,细胞周期主要抑制在G2/M期.Hoechst 33258染色显示IL-24基因转染后MDA-MB-231细胞出现凋亡.结论 IL-24基因转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后可能通过上调caspase-3的表达而抑制细胞增殖,促进其凋亡.     

IL-27基因转染对小鼠结肠腺癌细胞生物学特性的影响

目的:获得稳定表达小鼠IL-27(mIL-27)基因的小鼠结肠腺癌细胞株(Colon26),研究IL-27基因对小鼠结肠腺癌细胞体内外生物学特性的影响。方法:通过脂质体法将pcDNA3.1( )-His(B)/mIL-27质粒转染结肠腺癌细胞,筛选建立高表达细胞株。采用Western blot、ELISA、RT-PCR法证实IL-27基因成功转染Colon26。用MTT比色法检测IL-27质粒转染后对Colon26细胞生长的影响;流式细胞术检测IL-27质粒转染后对Colon26细胞凋亡的影响;将Colon26-IL-27细胞接种于BALB/c小鼠的右侧背部皮下,观察其致瘤性。结果:Colon26-IL-27细胞可表达IL-27mRNA并分泌IL-27,IL-27的表达在体外对Colon26细胞的增殖、凋亡均无影响,而在体内则具有明显的抗瘤活性。结论:成功制备Colon26-IL-27细胞株,证明IL-27能在体内明显抑制肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存期,具有一定的抗肿瘤作用。     

IL-27基因修饰Eca109细胞的体外体内凋亡作用的研究

目的 研究IL-27基因转染人食管癌Eca109细胞株后在体外和体内对细胞凋亡的影响,从而探讨其抗肿瘤作用及其机制.方法 基因转染的方法 建立稳定表达IL-27基因的人食管癌细胞株(Eca109/IL-27),观察Eca109/IL-27细胞生长情况、移植瘤的生长情况及生存期,用流式细胞技术检测体外和体内的细胞凋亡率和Fas的表达,采用Western blot检测Survivin 的表达.结果 成功建立稳定转染的Eca109/IL-27细胞株,RT-PCR示Eca109/IL-27细胞中有mIL-27 p28和EBI3亚基基因表达,而Eca109/LXSN和Eca109细胞中未见表达(P＜0.01),IL-27基因转染不影响人食管癌细胞株的体外生长和细胞凋亡,Fas和Survivin的表达无变化(P＞0.05);但体内Eca109/IL-27移植瘤生长较Eca109和Eca109/LXSN滞后,生存时间延长(P＜0.05),肿瘤组织细胞凋亡率增高(P＜0.05),细胞表面Fas的表达增加(P＜0.05),Survivin表达降低(P＜0.05).结论 IL-27在体外不影响细胞凋亡,体内可能通过降低Survivin的表达,上调Fas的表达,诱导细胞凋亡产生抗肿瘤作用.     

mB7-1转染大鼠卵巢癌细胞诱导细胞免疫应答及体内致瘤性研究

为探讨转染mB7 1基因大鼠卵巢癌细胞系后体外诱导细胞免疫应答及其致瘤性 ,我们以逆转录病毒为载体将mB7 1基因转染入大鼠低分化卵巢上皮癌细胞株NuTu 19中 ,流式细胞仪检测mB7 1的表达。用同源淋巴细胞肿瘤细胞混合培养实验 (MTLCs)测定淋巴细胞增殖指数 ,MTT法检测细胞毒淋巴细胞的增殖及其杀瘤活性。将NuTu 19/Neu、NuTu 19/mB7 1细胞分别接种于同源大鼠Fischer344皮下 ,观察mB7 1修饰的肿瘤细胞在动物体内的致瘤性。结果显示 ,mB7 1基因成功地转染入大鼠低分化卵巢上皮癌细胞株NuTu 19,流式细胞仪测定mB7 1基因呈阳性表达。NuTu 19/mB7 1体外刺激脾淋巴细胞增殖能力明显高于对照组细胞 (P <0 0 5 )。NuTu 19/mB7 1体外诱导的CTL较对照组对NuTu 19细胞的杀伤率显著增高 (P<0 0 1)。两种细胞体外增殖能力无明显改变 ,NuTu 19/mB7 1组在Fischer344大鼠体内成瘤时间明显晚于对照组 (P <0 0 5 )。由此可见 ,mB7 1基因修饰的鼠卵巢癌细胞可体外诱导细胞免疫应答 ,接种动物后 ,实验瘤苗的致瘤性下降     

MDA-7/IL-24对乳腺癌MDA-MB-231细胞生长抑制和凋亡的影响

 摘要：目的 探讨IL-24基因转染乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖抑制和促凋亡作用。方法 利用脂质体将穿梭质粒pDC316-hIL-24-EGFP瞬时转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过RT-PCR检测转染后hIL-24基因mRNA的转录,Western blot检测转染后IL-24和Caspase-3蛋白的表达,MTT比色法测定细胞增殖的抑制, 流式细胞仪检测细胞的凋亡和细胞周期的变化,Hoechst 33258染色检测细胞的凋亡情况。结果IL-24基因可在MDA-MB-231细胞中成功转录及表达。IL-24可上调MDA-MB-231细胞中Caspase-3蛋白表达。IL-24基因的表达使得乳腺癌MDA-MB-231细胞出现增殖抑制。流式细胞仪检测显示MDA-MB-231细胞DNA 合成受到抑制,细胞周期主要抑制在G2/M期。Hoechst 33258染色显示IL-24基因转染后MDA-MB-231细胞出现凋亡。结论IL-24基因转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后能够抑制细胞增殖并促进其凋亡,其机制之一可能是上调Caspase-3的表达。     

三氧化二砷纳米粒子对直肠癌作用的实验研究

目的 探讨三氧化二砷纳米粒子在体外、体内对直肠癌的抗癌作用.方法 Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测三氧化二砷纳米粒子诱导直肠癌细胞HR8348凋亡情况;建立HR8348细胞裸鼠皮下移植瘤模型,监测给药后肿瘤体积的变化,并通过对肿瘤组织标本Ki67染色和TUNEL染色检测肿瘤细胞增殖和凋亡情况.结果 流式细胞术结果显示,4.0 μmol/L三氧化二砷纳米粒子诱导直肠癌细胞凋亡率为7.02%,高于对照组(1.76%),P＜0.05,三氧化二砷纳米粒子体外可诱导直肠癌细胞的凋亡.在体内,三氧化二砷纳米粒子可抑制HR8348裸鼠皮下移植瘤的生长,4.0 μmol/L三氧化二砷纳米粒子组增殖指数(31.61%)低于对照组(66.75%),而凋亡指数(19.21%)高于对照组(6.47%),P＜0.05.可抑制肿瘤细胞的增殖,诱导细胞凋亡.结论 在直肠癌中,三氧化二砷纳米粒子通过抑制增殖,诱导凋亡而发挥抗癌作用,是直肠癌治疗的良好药物.     

反义人端粒酶RNA对胃癌细胞生长的抑制效应

目的 探讨反义人端粒酶ＲＮＡ（ｈＴＲ）对胃癌细胞的生长抑制作用。方法 将反义ｈＴＲ真核表达载体经脂质体介导转染入胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１,体外培养及接种裸鼠观察其基因转染细胞的细胞周期、超微结构变化、生长速率及致瘤性。结果 反义ｈＴＲ在潮霉素筛选的阳性克隆中稳定表达,正义ｈＴＲ表达下调,并出现凋亡改变。基因转染细胞体外传代培养的生长速率大多减慢,在裸鼠皮下的致瘤性明显降低。荷瘤鼠存活时间延长。结论     

IL-24/MDA-7 Suppressed the Transplantation Tumor in BALB/c Mice

It is well-documented that interleukin-24 （IL-24） can induce apoptosis in a large spectrum of human cancer derived cell lines, but the effect of MDA-7/IL-24 gene transfer on mouse melanoma cells remains unknown. The eukaryotic expressing plasmid of IL-24 （pEGFP-IL-24） was constructed by DNA recombination technique. The recombination plasmid and empty vector were transfected into B16F0 cells and the expressions of IL-24 were determined by LSM, the proliferation of B16F0 cells was measured by MTT assay, and apoptosis rate and cell-cycle distribution of B16F0 cells were measured by FCM. The inhibitory effect of IL-24 gene transfection in mouse solid tumor was observed and measured. Compared with the control, the proliferation of B16F0 cells was inhibited by transfection with pEGFP-IL-24 and the G2/M phase of the transfected cells was also increased. Moreover, the percentage of mice with detectable tumor was decreased after inoculated with B16F0 cells transfected with pEGFP-IL-24. Growth rate of tumor in mouse model was significantly inhibited in IL-24 gene therapy group compared with the control. Proliferation of B16F0 cells was inhibited by pEGFP-IL-24 transfection. The intratumor injection of pEGFP-IL-24 could inhibit the growth of solid tumor in mice remarkably. Cellular ＆ Molecular Immunology.     

CCAAT增强子结合蛋白α对急性粒细胞白血病HL60细胞分化和凋亡的影响

目的 探讨CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)在体内和体外对急性粒细胞白血病HL60细胞分化和凋亡的影响及其可能机制.方法 将C/EBPα表达质粒pEGFP-C/EBPα经阳离子脂质体介导转染HL60细胞,用G418筛选出C/EBPα稳定表达细胞株为转染组;以转染pEGFP空载质粒HL60细胞为空载体组;未处理的HL60细胞为对照组.瑞氏染色观察细胞形态学变化;噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖抑制率;流式细胞术分析凋亡;RT-PCR及免疫印迹法(Western blot)检测c-myc基因的表达.20只BALB/c裸鼠按完全随机法分为3组:转染组7只、空载体组7只、对照组6只.将3组细胞分别皮下注射相应各组小鼠形成皮下瘤,20 d后处死小鼠,测量肿瘤质量及大小,TUNEL法检测皮下瘤组织细胞凋亡率.结果 筛选到C/EBPα基因稳定表达的细胞株pEGFP-C/EBPα-HL60,细胞出现明显分化.对照组、空载体组和转染组细胞的凋亡率分别为(5.4±1.4)%、(5.0±1.3)%、(21.9±4.5)%,转染组细胞的凋亡率显著高于对照组和空载体组(均P＜0.05).RT-PCR及免疫印迹显示C/EBPα明显抑制c-myc mRNA和蛋白的表达(均P＜0.05).对照组、空载体组和转染组细胞接种小鼠形成皮下瘤,其质量分别为(5.35±1.12)g、(5.12±1.31)g和(3.26±0.72)g,瘤体大小分别为(25±4)mm、(18±3)mm和(11±2)mm,转染组瘤体质量及瘤体大小明显低于对照组和空载体组(均P＜0.05).与对照组和空载体组比较,转染组皮下瘤组织细胞凋亡率明显增加(均P＜0.05).结论 C/EBPα在HL60细胞中具有促进细胞凋亡和抑制细胞增殖的能力,显示C/EBPα在急性粒细胞白血病中是一种肿瘤抑制因子.     

抑癌基因PTEN诱导人脑胶质瘤SHG—44细胞凋亡

目的 研究外源性PTEN基因对人脑胶质瘤细胞系SHG－44凋亡的影响,探讨PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖的机制。方法 以携有人PTEN基因的真核表达载体体外转染SHG－44细胞,筛选阳性转染的细胞克隆并扩增培养。以原位杂交和免疫组化染色法检测PTEN基因的表达。采用透射电镜、流式细胞仪和核DNA琼脂糖凝胶电泳,检测转染PTEN基因后SHG－44胶质细胞的凋亡。观察导入入PTEN基因对SHG－44细胞裸鼠致瘤能力的影响。结果 获得PTEN基因稳定转染的胶质瘤细胞SHG－44,并检测到PTEN基因和蛋白的表达。透射电镜下可见转染PTEN基因后细胞核染色质浓缩边集、胞浆浓缩、核碎裂及凋亡小体形成等典型的凋亡表面。流式细胞仪显示,细胞周期从G1期到S期发生抑制,并在G1期峰前出现1个明显的凋亡峰（12．9％）。细胞核DNA琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞特朋的梯状条带。转染空载体及未转染的SHG－44细胞未见的凋亡表现。转染PTEN基因后,SHG－44细胞对裸鼠瘤能力明显降低。结论 将外源必PTEN基因导入SHG－44肿瘤细胞后,可诱导细胞凋亡,这可能是PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖的重要机制之一。     

人乳头状瘤病毒16型E6E7肿瘤性转化人永生化支气管上皮细胞

目的 探讨人乳头状瘤病毒（ＨＰＶ）１６型Ｅ６Ｅ７片段对人永生化支气管上皮细胞系ＴＲ细胞的作用。方法 将Ｅ６Ｅ７片段构建入逆转录病毒载体,导入ＴＲ细胞,观察生长特性和致瘤性的改变;并用免疫沉淀（ＩＰ）－Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测ｐ２７蛋白功能及ＦＡＫ、桩蛋白数量及磷酸化状况,结果 嘌呤霉素抗药性克隆ＴＲ／Ｅ６Ｅ７有Ｅ６Ｅ７的存在和稳定表达;ＴＲ／Ｅ６Ｅ７细胞系细胞生长加快,软琼脂集落形成能力增强,     

骨髓基质细胞HS-分泌物白细胞介素-对人急性髓细胞性白血病细胞系HL-0抗凋亡的作用

目的 探讨骨髓基质细胞HS-分泌物白细胞介素-6(IL-6)急性髓细胞性白血病（AML）细胞系HL-0增殖与凋亡的影响。方法 外培养HL-60细胞与HS-5细胞,构建共培养体系,应用扫描电子显微镜、ELISA法、细胞计数试剂盒8（CCK-8）法、AnnexinV-FITC/PI 双染流式细胞术、Real-time PCR和Western blotting技术分别检测HL-60细胞增殖和凋亡的变化;将不同组的HL-60细胞分别接种于BALB/c裸鼠,观察并记录成瘤情况。结果 骨髓基质细胞HS-5分泌的IL-6能够促进HL-60细胞增殖、抑制其凋亡,并下调HL-60细胞中的促凋亡基因Bax的表达,上调抗凋亡基因Bcl-2的表达。共培养组HL-60细胞在BALB/c裸鼠中成瘤能力最强,HL-60细胞单独培养组成瘤能力最弱。结论 骨髓基质细胞HS-5促进HL-60细胞增殖、抑制其凋亡的部分作用机制是通过分泌IL-6实现的。     

VEGF基因特异性siRNA转染后对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨利用干扰RNA（RNAi）抑制血管内皮生长因子（VEGF）基因表达对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。方法：设计针对VEGF基因的小干扰RNA（siRNA）,合成DNA模板,体外转录siRNA。以脂质体转染法将双链siRNA导入MCF-7细胞后,用MTT比色法检测siRNA对MCF-7细胞增殖的影响。通过Hoechst33258染色观察MCF-7细胞的凋亡。用流式细胞术检测细胞周期的改变,RT-PCR检测VEGF mRNA表达的变化,免疫细胞化学法检测VEGF蛋白的表达。结果：所设计的两个靶位点siRNA,均能有效地抑制MCF-7细胞的增殖,诱导细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期,VEGFmRNA及其蛋白的表达明显减少;而作为阴性对照的错义序列组siRNASCR则没有上述效应。结论：体外转录合成的siRNA可抑制MCF-7细胞中VEGF基因的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。