基于lolB基因的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测病原霍乱弧菌方法的建立

基于霍乱弧菌lolB基因保守序列设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测霍乱弧菌的方法。常规PCR检测仅霍乱弧菌扩增出大小为519bp的目的片段,其他3种病原弧菌均为阴性;SYBR GreenⅠ实时定量PCR,在Tm为86.5～87℃,扩增产物的熔解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,表明该引物具有较好的特异性。SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增曲线反映了PCR的指数增长阶段和平台阶段;所制作的标准曲线在2.59×108～2.59×100拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.993,能对霍乱弧菌进行准确的定量分析。该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～5h,较传统方法敏感、操作简单、耗时短,是霍乱弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及流行病调查的有效方法。     

迟缓爱德华氏菌SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

根据克隆得到的迟缓爱德华氏菌gyrB基因序列设计并合成一对特异性引物,通用性和特异性检测结果显示所设计的引物具有良好的种间特异性和种内通用性,构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,经过反应体系优化后建立了检测迟缓爱德华氏菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法线性关系良好,在Tm为63℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.32x 39.38,相关系数为0.998,扩增效率为1.00,最低能检测到60个拷贝。应用建立的方法对人工感染的大菱鲆病样进行了检测,三个被检样品均呈阳性反应,证明该方法具有较好的适用性。实验结果表明所建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量的优点,可用于迟缓爱德华氏菌病的快速检测。     

仿刺参腐皮综合征病原灿烂弧菌RPA-Cas13a检测方法的建立

为预防和控制灿烂弧菌引发的仿刺参腐皮综合征，促进仿刺参养殖业的健康可持续发展，利用LwCas13a中特异性CRISPR RNA(crRNA)与靶RNA结合后可激活Cas13a蛋白对外源RNA分子附属切割活性的特征，结合重组酶介导的聚合酶扩增技术(RPA),建立1种针对灿烂弧菌gyrB基因的快速、灵敏、特异的定量检测方法——RPA-Cas13a。RPA-Cas13a可实现在37℃恒温下、60 min内对灿烂弧菌的快速实时检测。灵敏度测试结果显示，RPA-Cas13a检测限为550拷贝/μL(gyrB),与荧光定量PCR的检测灵敏度水平一致；特异性测试结果表明，RPA-Cas13a对创伤弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌等其他弧菌及产黑假交替单胞菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌等常见水产动物病原菌均无交叉反应，特异性较强。RPA-Cas13a方法对仿刺参体表黏液(32份)、养殖池塘水体(15份)和表层沉积物(10份)等57份环境样本的阳性检出率为8.77%,与传统荧光定量PCR方法的检出一致性高(Kappa=1.00),无统计学差异(P>0.05)。试验结果表明，灿烂弧菌的RPA-Cas13a...     

真鲷虹彩病毒实时定量PCR检测方法的建立与应用

以真鲷虹彩病毒(Red-sea bream iridovirus,RSIV)主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)的基因保守片段为靶序列,利用Primer Express 3.0软件设计定量PCR引物,建立了RSIV的SYBR Green I实时定量PCR检测方法.将RSIV MCP基因连接pMD18-T载体,构建重组质粒,经过梯度稀释后作为标准品,根据标准品拷贝数(X)与Ct值的关系绘制了标准曲线,为Ct=-3.184 1gX+40.270,相关系数R2=0.996 9.熔解曲线分析表明,定量PCR产物的Tm值为82.5℃.该方法的检测限为2.20×102拷贝/反应,对流行性造血器官坏死病毒、淋巴囊肿病毒、蛙病毒3、甲鱼虹彩病毒都没有扩增反应,具有特异性.利用该方法对84批海水鱼类(石鲽、大菱鲆、鲈鱼)进行检测,其中5批鱼样品感染RSIV,并利用标准曲线对病毒含量进行了定量分析.     

实时荧光定量PCR扩增特异性vapA基因检测杀鲑气单胞菌

为实现杀鲑气单胞菌早期快速准确定量检测,研究旨在建立杀鲑气单胞菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法。根据GenBank中杀鲑气单胞菌毒力阵列蛋白基因(vapA)保守序列设计并合成一对特异性引物,对其特异性、灵敏度、可重复性和应用性进行评价。结果显示,研究设计的引物具有良好的种间特异性,仅对杀鲑气单胞菌及其亚种有阳性扩增,与其他细菌不发生交叉反应。构建的Real-time PCR标准曲线质粒拷贝数与循环阈值呈良好的线性关系,扩增所得标准曲线分别为y=–4.8345x+42.535,相关系数R~2为0.998,最低检测限为34拷贝/μL,较常规PCR的灵敏度高出约1000倍。应用建立的方法检测人工感染的虹鳟病样,15个被检样品呈阳性反应,与细菌常规鉴定方法结果一致。研究表明,所建立的基于实时荧光定量PCR技术的杀鲑气单胞菌检测方法快速、特异、灵敏,可用于临床诊断和疫病监测。     

双重PCR在创伤弧菌(Vibrio vulnificus)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytious)快速检测中的应用

建立双重PCR方法检测海产品中的创伤弧菌(Vbrio vulnificus)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytious)。针对创伤弧菌和副溶血弧菌的gyrB基因的不同位点设计引物,前者扩增片断的大小为968bp,后者扩增片断的大小为284bp。共对三种海产品进行了创伤弧菌和副溶血弧菌的检测,结果在部分海产品中能特异性地检测到目标菌株。该方法快速,灵敏度高,特异性强。为海产品的创伤弧菌和副溶血弧菌的检测提供了有效的方法。     

鲁氏耶尔森菌qPCR快速检测方法的建立和应用

鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)是导致虹鳟(Oncorhynchus mykiss)肠炎红嘴病的病原。本研究以鲁氏耶尔森菌毒力因子rup A基因为靶标设计1对特异性引物,以含有rup A基因部分序列的重组质粒为标准品构建标准曲线,优化建立检测鲁氏耶尔森菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,并对腹腔注射鲁氏耶尔森菌菌悬液的虹鳟肝、肾、脾、血液样品进行检测。结果显示,设计的引物具有良好的种间特异性,标准曲线线性方程为y=–3.3766x+40.012(R~2=0.9958);最低检测限为57 copy/μL,较常规PCR的灵敏度高出约100倍。应用检测结果表明,本方法可准确检测被鲁氏耶尔森菌感染的虹鳟样品。研究表明,所建立的qPCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,可用于快速诊断虹鳟肠炎红嘴病早期病症及定量检测鲁氏耶尔森菌。     

鳗鲡疱疹病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

[目的]建立鳗鲡疱疹病毒（Anguillid herpesvirus, AngHV）的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR（qPCR)检测方法。[方法]利用PCR扩增出AngHV ORF49的序列,克隆至pET-32a载体,构建重组质粒pET-32a-ORF49,作为qPCR的标准品;根据ORF49序列设计引物,以梯度稀释的重组质粒为模版,进行SYBR Green Ⅰ qPCR扩增,制作标准曲线,建立AngHV的qPCR检测方法,并评价其灵敏性、特异性、重复性和应用效果。[结果]结果显示,qPCR的Ct值与标准品的拷贝数线性关系良好,且线性范围广,获得的标准曲线的相关系数（R2）达到0.999,扩增效率为100.855%;该方法特异性好,仅特异性检测AngHV,而对鲤疱疹病毒Ⅲ型（Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3）、蛙虹彩病毒（Rana grylio virus, RGV）和鳗鲡虹彩病毒（Eel iridovirus, EIV）无扩增;该方法重复性好,组内和组间变异系数均小于2%;该方法灵敏性高于普通PCR法,最低可检测到10个病毒拷贝,而普通PCR法为1000个病毒拷贝。应用分析结果表明,感染AngHV的欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）的主要组织器官内均可检测到AngHV,并且鳃、鳍和皮肤黏液内的病毒量明显高于其他组织器官;对保存的25份疑似鳗鲡“脱黏败血综合征”病料进行检测,阳性检出率为96%,而普通PCR法的阳性检出率仅为76%。[结论]本研究建立的AngHV SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于AngHV的快速和定量检测,对鳗鲡“脱黏败血综合征”的防控也具有重要意义。     

鰤鱼诺卡氏菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中蛳鱼诺卡氏菌16S-23S rRNA基因序列设计并合成一对特异性引物,经反应体系优化后建立了检测蛳鱼诺卡氏菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.998;溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰;检测灵敏度可达10 6μg/μL的DNA含量,与嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、麦氏弧菌不发生交叉反应,具有良好的特异性。应用建立的方法在蛳鱼诺卡氏菌病爆发时期,对16份鱼体组织、养殖水体、饲料等样品进行了检测,结果 7份为阳性,与细菌分离、培养检查结果 100%相符。既能检测发病鱼,又能检出未发病且已感染的病鱼,对病害的早期防控体现应用价值。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量等优点,可用于蛳鱼类致病鱼诺卡氏菌的快速检测。     

鳗鲡疱疹病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus, AngHV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,利用PCR扩增出AngHV ORF49的序列,克隆至pET-32a载体,构建重组质粒pET-32a-ORF49,作为qPCR的标准品;根据ORF49序列设计引物,以梯度稀释的质粒标准品为模板,进行SYBR GreenⅠqPCR扩增,制作标准曲线,建立AngHV的qPCR检测方法,并评价其灵敏性、特异性、重复性和应用效果。结果显示,qPCR的阈值循环数(cycle threshold value, CT)与标准品的拷贝数线性关系良好,且线性范围广,获得的标准曲线相关系数(R~2)达到0.999,扩增效率为100.855%;该方法特异性好,可特异性检测AngHV,而对鲤疱疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)、蛙虹彩病毒(Rana grylio virus, RGV)和鳗鲡虹彩病毒(Eel iridovirus, EIV)无扩增;该方法重复性强,组内和组间变异系数分别小于1%和2%;该方法灵敏性高于普通PCR法,最低可检测到10个病毒拷贝,而普通PCR法为1 000个病毒拷贝。qPCR检测发现,在感染AngHV的欧洲鳗鲡主要组织内均可检测到AngHV,并且鳃、鳍和皮肤黏液内的病毒量显著高于其他组织;对保存的25份疑似鳗鲡"脱黏败血综合征"病料进行检测,阳性检出率为96%,而普通PCR法的阳性检出率仅为76%。本研究建立的AngHV SYBR GreenⅠqPCR检测方法灵敏性高、特异性强、重复性好,可用于AngHV的快速和定量检测,对鳗鲡"脱黏败血综合征"的防控也具有重要意义。     

基于vhhP2基因的SYBR Green I实时定量PCR检测哈维氏弧菌方法的建立

根据哈维氏弧菌(Vibro harveyi)溶血素基因vhhP2的保守序列设计特异性引物, 建立了SYBR Green I实时定量PCR检测哈维氏弧菌的方法。构建含vhhP2基因的重组质粒作为标准品, 进行SYBR Green I实时定量PCR, 在Tm为60℃时, 扩增产物的熔解曲线仅有一个特异峰, 扩增所得标准曲线为y= –3.331x+37.48, 相关系数为0.998, 扩增效率为1, 最低可检测到7个拷贝。实验结果表明该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性, 对哈维氏弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。

     

杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)弹状病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种能在临床上快速、准确检测杂交鳢弹状病毒(HSHRV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,利用PCR技术扩增HSHRV-C1207 G蛋白的全长序列,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品,根据HSHRV-C1207 G蛋白的保守序列,设计合成了一对能特异性扩增143 bp片段的引物和TaqMan探针,以标准品为模板建立HSHRV的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的灵敏度、可重复性和特异性进行评价。结果显示:建立的荧光定量PCR检测方法标准曲线有较好的线性关系,相关系数(R2)为0.999,斜率为-3.290;荧光定量PCR最低可以检测到10个病毒核酸分子拷贝,而传统PCR方法最低可检测到1×103个拷贝;38个平行样品重复性实验组内变异系数为0.84%;对其他6种水产养殖常见病毒均无扩增反应。应用该方法对采集的21份患病鳢样品进行检测,其中18份为阳性,与细胞分离和电镜观察结果相同;以传统PCR方法检测同样的样品,仅13份为阳性。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,能较好的用于临床HSHRV的检测,对病毒病原定量检测与杂交鳢弹状病毒病的快速诊断具有重要意义。     

High‐throughput identification and quantification of Vagococcus salmoninarum by SYBR Green I‐based real‐time PCR combined with melting curve analysis

This work describes a primer pair and a high‐throughput SYBR Green I‐based real‐time PCR protocol combined with melting curve analysis for identification and quantification of Vagococcus salmoninarum in bacterial cultures and infected fish tissues. The 16S rRNA gene was selected for the design of the primer pair (SalF and SalR). The sensitivity and specificity of this primer pair were compared with other previously designed for conventional PCR. Although both primer pairs showed 100% specificity using pure bacterial cultures or DNA extracted from bacteria or fish tissues, the primer pairs designed in this study showed the highest sensitivity with a detection limit of 0.034 × 10⁰ amplicon copies per assay (equivalent to 2 × 10^?11 ng/µl, C_q value of 30.49 ± 1.71). The developed qPCR protocol allowed the detection of V. salmoninarum in non‐lethal and lethal fish samples with detection levels of 0.17 × 10⁰ gene copies in tissues artificially infected and 0.02 × 10⁰ in tissues of fish experimentally infected with V. salmoninarum. The high sensitivity of the developed method suggests that it could be considered as a useful tool for diagnosis of vagococcosis and the detection of V. salmoninarum in asymptomatic or carrier fish.     

刺参腐皮综合征重要病原灿烂弧菌DNA的探针制备及应用

腐皮综合征是近年来刺参养殖最重要的疾病,导致刺参大批死亡和惨重的经济损失。以其主要致病原灿烂弧菌（Vibrio splendidus）DNA为模板,PCR扩增出16s-23s间隔区序列,将该片段克隆进pMD19-T Vector,转化大肠杆菌DH5a,获得重组质粒转化菌并进行测序。根据序列、设计引物,合成177bp的地高辛标记DNA探针。该探针对灿烂弧菌的DNA呈现特异性,而对其它细菌Vibrio fluvialis、Vibrio anguillarum、Vibrio alginolyticus、Aeromonas hydrophila、Vibrio harveyi、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus的核酸均呈阴性;探针对灿烂弧菌DNA的检出极限为6.25pg, 具有较高敏感度。应用该探针对人工感染以及从青岛、烟台、威海获取的腐皮综合征发病海参和养殖水体进行斑点杂交探针检测,其检出率均为100%。研究结果表明,该探针具有良好的特异性和敏感性,可成功用于快速检测养殖刺参“腐皮综合征”重要病原灿烂弧菌。该方法应用于刺参腐皮综合征的检测尚属首次,它将为刺参腐皮综合征的快速诊断、疾病防治和养殖生产提供技术支撑和参考。     

嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的LAMP检测方法的建立

利用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）分别建立嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,AH）与温和气单胞菌（A.sobria,AS）的快速检测方法。针对嗜水气单胞菌pilin基因、温和气单胞菌zipA基因设计特异性LAMP引物。在恒温条件下利用实时浊度仪对2组引物进行特异性和灵敏度试验,并以琼脂糖凝胶电泳和核酸染料颜色变化对扩增结果进行判定。结果显示,LAMP实时浊度法能够特异地检测嗜水气单胞菌和温和气单胞菌,最低检出限分别为46 fg·mL^-1和320 fg·mL^-1,是普通PCR方法的104倍和102倍;并能应用于已知临床样品检测。该研究建立的嗜水气单胞菌与温和气单胞菌LAMP快速检测方法具有高效、特异、灵敏的特点。     

Identification and detection of Pseudomonas plecoglossicida isolates with PCR primers targeting the gyrB region

Pseudomonas plecoglossicida is the agent of bacterial haemorrhagic ascites (BHA) in freshwater fish farming in Japan. To develop a rapid identification and detection method for P. plecoglossicida, a PCR amplification technique targeting the chromosomal DNA region coding the B subunit of the DNA gyrase (gyrB) was used. The nucleotide sequences of gyrB were determined in nine isolates of P. plecoglossicida and two other Pseudomonas species. On the basis of these determined sequences and the gyrB sequences of other Pseudomonas species or fish pathogenic bacteria deposited in international nucleotide sequence databases (GenBank/EMBL/DDBJ), PCR primers PL-G1F, PL-G1R, PL-G2F and PL-G2R were designed for specific amplification of the partial gyrB of P. plecoglossicida. The specificity of these primers in amplifying the gyrB of P. plecoglossicida was verified using selected strains of related bacterial species. The nested PCR technique was used to detect P. plecoglossicida from kidney and intestine of ayu. Primer pair PL-G1F and PL-G1R was used for the external PCR, and primer pair PL-G2F and PL-G2R for the internal PCR. Of 10 ayu juveniles, expected size PCR products were observed from intestine and kidney samples in one and two specimens, respectively. The PCR technique with primers based on the gyrB sequence is thus useful for the diagnosis of BHA.