根癌农杆菌介导的怀地黄遗传转化研究

目的研究适于怀地黄Rehmannia glutinosa遗传转化的激素质量浓度和潮霉素质量浓度。方法以地黄无菌苗叶片为外植体,以根癌农杆菌介导的叶盘法进行转化,分析了潮霉素和乙酰丁香酮(AS)对抗性愈伤诱导率和再生芽分化效率的影响。结果潮霉素的质量浓度对抗性愈伤和抗性芽的产生影响很大,影响抗性愈伤诱导的临界质量浓度为9 mg/L,影响抗性芽分化的临界质量浓度为6 mg/L,适宜于进行地黄遗传转化的质量浓度为12 mg/L。侵染培养基和共培养培养基中添加100μmol/L的AS可以极显著提高转化效率。PCR扩增和β-葡萄糖苷酶(GUS)染色结果表明,外源基因成功整合到地黄基因组中。结论建立了有效的怀地黄稳定遗传转化再生体系,为地黄的分子生药学研究和遗传改良奠定基础。     

根癌农杆菌对枳壳遗传转化的影响因素

目的：建立一套根癌农杆菌转化枳壳的有效方法,为枳壳新品种选育、引入外源基因奠定基础。方法：以枳壳实生苗的上胚轴为材料,农杆菌菌株为ＥＨＡ１０１,含质粒载体ＰＧＡ４８２ＧＧ,质粒上插入了ＧＵＳ,ＮＰＴⅡ基因。结果：２０ｄ苗龄的外植体转化再生率较高;其感染前先进行２ｄ预培养,对转化有一定促进作用;外植体与农杆菌共培养时间以２～３ｄ为宜;乙酰丁香酮能较大提高转化效率,转化再生频率达２７．５％;外植体与农杆菌共培养后延迟２ｄ选择,抗性芽发生率有所提高。结论：通过探讨根癌农杆菌对枳壳遗传转化的影响因素,获得较高的转化再生频率,建立了有效的转化再生系统。     

四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅰ.根癌农杆菌介导的转基因菘蓝

目的：将外源半夏凝集素基因（PTA）转入四倍体菘蓝以获得鳞翅目昆虫抗性。方法：构建了以CaMV 35S为启动子，新霉素磷酸转移酶（Npt-Ⅱ）为选择标记，带有半夏凝集素基因PTA的pCAMB I A2200植物双元表达载体，应用根癌农杆菌EHA 105遗传转化四倍体菘蓝。结果：菘 外植体植株再生率达到95％以上，转化率有10％。结论：建立了以6－BA和NAA为主要激素组合的四倍体菘蓝离体分化再生系统和农杆菌介导的转化系统。     

农杆菌介导几丁质酶及β-1，3-葡聚糖酶基因转化半夏的研究

目的:将木霉来源的内切几丁质酶以及β-1,3-葡聚糖酶基因片段转入半夏,使其获得抗真菌感染的特性.方法:以半夏外植体为受体,潮霉素磷酸转移酶Hpt为筛选标记,采用农杆菌介导法将内切几丁质酶基因ech42、葡聚糖酶基因gluc78以及2种基因的组合pcAMBIA(ech42+gluc78)进行遗传转化获得转化再生植株,通过PCR,RT-PCR检测转化结果.结果:经PCR,RT-PCR检测,表明3种外源基因已成功转化半夏,并在转录水平得到表达.连续多代的PCR追踪检测证实外源基因已遗传至T5代.结论:带有ech42,gluc78,pCAMBIA(ech42+gluc78)表达载体的根癌农杆菌可以分别转化半夏,并表达出相应的RNA,进行稳定遗传.     

农杆菌介导枳壳转化系统的建立及PCR鉴定

目的：建立农杆菌介导的枳壳转化体系。方法：以枳壳实生苗上胚轴为转化体外植体，农杆菌Ti质粒上插入了外源目的基因--柑桔衰退病病毒外壳蛋白基因（CTV-cp），转化植株用GUS（β-葡萄苷酸酶）染色及PCR进行鉴定。结果：枳壳转化试验中，20d苗龄的外植体转化再生率较高；外植体与农杆菌共培养时间以2-3d为宜；乙酰丁香酮能较大提高转化效率，转化再生频率为27.5％。转化获得的抗性植株中，GUS反应呈阳性所占比例为70.0％。PCR分析证实外源目的基因已速合到枳壳转化株的核基因组中。结论：成功地建立了农杆菌介导的枳壳转化系统，为利用基因工程的手段进行枳壳的抗病育种奠定了基础。     

农杆菌介导鱼腥草遗传转化的主要影响因素

目的：研究鱼腥草遗传转化的影响因素,以提高转化效率,获得转基因植株。方法：通过分析GUS报告基因的瞬时表达和外植体愈伤分化情况比较菌株质粒组合、菌液浓度、侵染时间、预培养时间、共培养时间、抗生素种类和浓度等因素对转化的影响,应用PCR和Southern blot技术鉴定转基因植株基因组中的外源基因。结果：菌液浓度A600为0.3、26℃侵染15min条件下侵染,添加乙酰丁香酮有利于转化,适宜的预培养时间和共培养时间与菌株/质粒组合有关,农杆菌LBA4404/pBI121优于EHA105/pCAMBIA1305.2组合。经条件优化,转化外植体的GUS染色阳性率在60%～80%之间,经鉴定外源基因已整合到转基因鱼腥草基因组中。结论：通过影响因素的优化研究,获得了鱼腥草转基因植株,为培育鱼腥草基因工程新品种奠定了基础。     

根癌农杆菌对云南红豆杉原生质体的转化

本文介绍了根癌农杆菌T—DNA对云南红豆杉原生质体的转化，分析了转化系的紫杉醇合成能力。实验以生长20d的云南红豆杉幼茎诱导的淡黄色愈伤组织为材料，经酶解可分离出大量有活力的原生质体。在由B5无机盐、KM有机成分、3．0mg／L2，4-D、0．1mg／LKT和0．45mol／L果糖组成的培养基中培养1周后，原生质体再生细胞持续分裂形成细胞团。根癌农杆菌对原生质体的转化能力与原生质体生长状态及菌株相关。虽然刚分离的或已再生细胞壁的原生质体不能被根癌农杆菌转化，但由10个以上细胞组成的原生质体克隆和根癌农杆菌B6S3菌株共培养后可实现T—DNA转化，高压纸电泳检测转化系具有冠瘿碱的合成，转化率约为5％。HPLC证实转化系具有合成紫杉醇的能力，但不同转化系中紫杉醇含量变异很大，最高含量为0．076％，是对照愈伤组织的6倍，表明T—DNA的插入改变了培养细胞对紫杉醇的合成。获得的高产转化系细胞生长比对照低，但继代培养中其生长和紫杉醇积累基本保持稳定。尽管转化系合成紫杉醇能力远未达到商业化生产的要求，但研究通过T—DNA对原生质体的转化而实现插入诱变，可以为分离高产紫杉醇优良细胞系提供单细胞筛选系统。     

根癌农杆菌对云南红豆杉原生质体的转化

本文介绍了根癌农杆菌T-DNA对云南红豆杉原生质体的转化,分析了转化系的紫杉醇合成能力。实验以生长20 d的云南红豆杉幼茎诱导的淡黄色愈伤组织为材料,经酶解可分离出大量有活力的原生质体。在由B5无机盐、KM有机成分、3.0 mg/L 2,4-D、0.1mg/L KT和0.45 mol/L果糖组成的培养基中培养1周后,原生质体再生细胞持续分裂形成细胞团。根癌农杆菌对原生质体的转化能力与原生质体生长状态及菌株相关。虽然刚分离的或已再生细胞壁的原生质体不能被根癌农杆菌转化,但由10个以上细胞组成的原生质体克隆和根癌农杆菌B6S3菌株共培养后可实现T-DNA转化,高压纸电泳检测转化系具有冠瘿碱的合成,转化率约为5％。HPLC证实转化系具有合成紫杉醇的能力,但不同转化系中紫杉醇含量变异很大,最高含量为0.076％,是对照愈伤组织的6倍,表明T-DNA的插入改变了培养细胞对紫杉醇的合成。获得的高产转化系细胞生长比对照低,但继代培养中其生长和紫杉醇积累基本保持稳定。尽管转化系合成紫杉醇能力远未达到商业化生产的要求,但研究通过T-DNA对原生质体的转化而实现插入诱变,可以为分离高产紫杉醇优良细胞系提供单细胞筛选系统。     

农杆菌介导的抗菌肽基因转化阳春砂愈伤组织的研究

目的确定遗传转化条件,将抗菌肽CN基因转入阳春砂愈伤组织。方法以阳春砂愈伤组织为受体材料,以农杆菌EHA105/pCAMBIA1305.2-CN工程细胞介导抗菌肽CN基因转化阳春砂,设计正交实验,通过分析gus报告基因的瞬时表达比较转化影响因素,并对目的基因CN进行PCR检测。结果农杆菌浓度、侵染时间、共培养温度、共培养时间及乙酰丁香酮浓度对转化率的影响有显著差异性。阳春砂愈伤组织遗传转化的最佳条件组合是:农杆菌浓度为OD600=0.5,侵染时间10 min,共培养温度24℃,共培养时间4 d,共培养培养基添加乙酰丁香酮200μmol.L-1。gus基因瞬时表达呈阳性的愈伤组织DNA经目的基因CN的PCR检测可见清晰的目的条带。结论建立了农杆菌介导的阳春砂愈伤组织的转化条件,目的基因CN已转入阳春砂愈伤组织。     

巴戟天离体再生及农杆菌介导的遗传转化

目的 :在巴戟天离体再生的基础上 ,建立一套根癌农杆菌转化的有效方法 ,为巴戟天新品种选育、引入外源目的基因奠定基础。方法 :以巴戟天带节茎为材料 ,农杆菌菌株为EHA101,含有质粒载体pGA482GG ,质粒上插入了GUS、NPTⅡ基因。结果 :MT基本培养基附加BA 1mg·L^-1,外植体出芽率最高 (97.8%) ,BA浓度升高 ,出芽率下降。外植体在培养基上的接种方式 ,以竖放为好 ,出芽所需的时间短且出芽率高。根的诱导 ,以MT附加 0.2～0.5mg·L^-1NAA效果较好 ,生根率可达 80.0%以上。巴戟天带节茎进行遗传转化 ,卡那霉素作为选择试剂 ,浓度为 50mg·L^-1。头孢霉素用作抑菌剂 ,浓度为 300mg·L^-1。经感染的外植体 ,在选择培养基上筛选 1.5个月后 ,抗性芽发生率为 14.8% ,GUS基因表达检测结果 ,抗性植株中 ,GUS反应呈阳性所占比例为 22.2%。结论 :通过探讨巴戟天的离体培养及根癌农杆菌介导的遗传转化 ,获得了较高的离体再生频率 ,建立了有效的遗传转化系统。     

半夏凝集素蛋白与半夏毒针晶毒性的相关性研究

目的:研究半夏凝集素蛋白与半夏毒针晶毒性的相关性,揭示半夏产生毒性的机制。方法:采用大鼠腹腔炎症模型,以腹腔渗出液中PGE2含量为指标,研究半夏凝集素致炎作用的量-毒、时-毒曲线;采用家兔眼结膜刺激模型,以眼结膜的病理切片观察半夏凝集素与半夏毒针晶刺激性的相关性。结果:半夏凝集素可引起大鼠腹腔渗出液中PGE2、蛋白含量显著提高,呈剂量依赖性;半夏凝集素可显著加重半夏毒针晶对家兔眼结膜的刺激性,且随着半夏凝集浓度的升高,刺激性显著增强,但单给药半夏凝集素对家兔眼结膜无刺激性。结论:半夏凝集素蛋白具强烈的致炎作用。半夏产生强烈炎症刺激的机制是半夏刺入机体,凝集素蛋白随针晶进入机体组织,诱导炎症反应发生而产生刺激性。     

UPLC测定半夏中胡芦巴碱的含量

目的:采用超高效液相(UPLC)及亲水作用色谱法(HILIC,hydrophilic interaction chromatography)测定半夏中胡芦巴碱的含量,建立半夏药材质量评价方法.方法:半夏细粉经50％的甲醇超声提取后,采用ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)进行胡芦巴碱含量的测定,流动相为乙腈-10 mmol·L-1醋酸铵(80∶20),流速0.4 mL· min -1,检测波长265 nm,进样量10 μL.结果:盐酸胡芦巴碱在1.125 ～72 nmol·mL-1线性关系良好(r =0.999 6,n=7),平均回收率为99.7％( RSD l.4％).结论:该方法专属性强、重复性好、稳定、可控,可作为半夏药材质量控制的方法.     

半夏人工种茎质量标准的研究

目的:制定半夏人工种茎的质量分级标准。方法:对组培快繁获得的成熟半夏人工种茎进行百粒重、含水量、发芽率、生活力、单粒径、净度等指标的测定和外观形态的观察,使用SPSS统计软件,分析出划分人工种茎等级的主要指标和参考指标,并制定半夏人工种茎质量分级标准。结果:生活力和发芽率是半夏人工种茎质量分级标准的主要指标,百粒重和直径大小是质量分级标准的重要参考指标。结论:1级半夏人工种茎的百粒重不低于10 g,含水量70%~80%,发芽率不低于80%,生活力不低于85%,单粒径不低于0.7 cm,净度不低于80%;2级人工种茎百粒重8~10 g,含水量70%~80%,发芽率60%~80%,生活力70%~85%,单粒径0.3~0.7 cm,净度75%~80%;含水量70%~80%且其他指标达不到2级人工种茎标准的为3级人工种茎。     

半夏种质资源遗传多样性的SRAP分析

目的:利用SRAP标记技术对全国不同产地和表型的半夏居群进行了遗传多样性分析.方法:从80对引物中筛选出14对合适的引物进行半夏不同居群的SRAP分析,用SPSS 16.0软件分析,建立Jaccard相关系数矩阵,构建遗传树系图.结果:14对SRAP引物共扩增出171条带,多态位点百分率为15.8%,35个半夏居群中表型先于产地聚类在一起.结论:SRAP标记适合于半夏的DNA遗传多样性分析;在半夏种质资源划分上产地较表型更为重要.     

半夏块茎腐烂病病原鉴定和药效比较

目的:研究半夏块茎腐烂病的病原和控制该病害的发生,为半夏栽培提供依据。方法:分离鉴定采用柯赫氏法则,菌丝生长条件采用2因子饱和D-最优设计,室内药效比较采用菌丝生长速率法。结果:形态学观察和致病性测定表明,引起半夏块茎腐烂病的病原物为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum;F.oxysporum菌丝生长的适宜温度为15~30℃,最适温度为21.9℃,适宜pH为6~8,最适pH7.2;室内药效比较表明,70%甲基托布津和58%甲霜灵锰锌对F.oxysporum菌丝生长的抑制效果最好,EC50分别为0.002 7,0.066 2 g.L-1。结论:明确了半夏块茎腐烂病病原,为该病害的防治提供了依据。     

栽培及野生半夏丛枝菌根研究

目的:研究贵州地区栽培及野生半夏丛枝菌根及丛枝菌根真菌.方法:通过染色镜检法观察栽培及野生半夏根系,通过湿筛-蔗糖离心法分离半夏根围土壤中丛枝菌根真菌孢子,并对照Schenck & Pérez及一些近期分类文献的描述,鉴定到种.结果:半夏具有典型从枝菌根结构,从贵州省6个野生及栽培半夏根围土壤采集地中共分离到隶属3属的21种丛枝菌根真菌孢子,鉴定到种的有隶属3属的7种,其中球囊霉属5种,巨孢囊霉属1种,盾巨孢囊霉属1种,分别是摩西球囊霉、根内球囊霉、沙漠球囊霉、黑色球囊霉、聚丛球囊霉、白色巨孢囊霉、粟色盾巨孢囊霉.其中粟色盾巨孢囊霉为我国新纪录种,且为毕节地区栽培半夏的优势种.结论:贵州省野生及栽培半夏中丛枝菌根真菌具有丰富多样性,孢子种类、优势种均差异较大,如白色球囊霉仅出现于栽培半夏根围土壤中,黑色球囊霉仅出现于野生半夏根围土壤中,而摩西球囊霉和根内球囊霉在2种土壤中均有出现,且毕节地区半夏根围土壤中有专属性较强的丛枝菌根真菌,可为栽培半夏退化提供新的研究思路.     

半夏试管小块茎发育过程中相关基因差异表达的研究

目的:分析半夏试管块茎形成过程中总mRNA差异表达的变化规律,为研究半夏试管块茎形成的分子机制提供了信息.方法:利用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR),分离和克隆半夏试管小块茎发育的相关基因片段.结果和结论:分离到了15个半夏试管小块茎发育过程中特异表达的cDNA片段,在GenBank中进行同源性比较发现6个没有同源序列与之匹配,推测为新的cDNA片断;3个片段推导的氨基酸序列分别与真核生物启动子,MADS-box蛋白和乙烯信号转导因子有高度同源性.半定量RT-PCR进一步证实它们存在,并在半夏块茎形成不同天数高度特异表达.     

三因素条件下AM真菌对半夏侵染率和入药品质的影响

目的:模拟土壤AM真菌关键影响因子,探索AM真菌对半夏根部侵染率和入药质量影响,筛选半夏、AM真菌和土壤环境的最佳组合.方法:设置3因素3水平正交试验,全苗期和成熟期测定半夏AM真菌侵染率,收获期测定半夏块茎水分、水溶性浸出物和入药成分.结果与结论:半夏成熟期90mg.kg-1栽培基质速效磷(P)含量,30％含水量,与EM混合接种时,AM侵染率为最大.各因素对半夏药材水分含量的影响作用大小为菌剂＞P营养＞水分,对半夏水溶性浸出物含量的影响作用大小为水分＞菌剂＞P营养,对半夏块茎琥珀酸和生物碱含量的影响作用大小均为菌剂＞P营养＞水分.30,90mg kg-1的低P条件,接种AM真菌可显著提高AM真菌的侵染率,提高半夏块茎入药质量,但EM和GM混合接种对提高AM真菌侵染率和入药质量的作用上更具有优势性.     

外源Ca2+对高温胁迫下半夏光合参数及有效成分积累的影响

目的：研究叶喷施钙盐对高温胁迫下半夏的光合参数及3种有效成分积累的影响。方法：待半夏株高10 cm左右时,高温处理并喷施不同浓度的CaCl₂溶液,18 d后测定半夏叶片叶绿素含量、光合作用参数及叶绿素荧光参数,并测定了块茎中鸟苷、腺苷及多糖的含量。结果：与对照相比,喷施Ca²⁺明显提高了叶绿素含量和叶绿素a/b;6 mmol·L^-1Ca²⁺处理显著提高了叶片的净光合速率（P_n）、蒸腾作用（T_r）和气孔限制值（L_s）,降低了胞间CO₂浓度（C_i）;随Ca²⁺浓度的升高,叶片最大光能转换效率（F_v/F_m）、实际光合效率（Yield）和光化学猝灭系数（qP）呈先升后降的趋势,初始荧光（F_o）及非光化学猝灭系数（NPQ）呈先降后升趋势;半夏块茎的干重及其中的鸟苷、多糖含量随Ca²⁺浓度的升高呈现先升后降趋势,腺苷含量则随之升高而升高;当Ca²⁺浓度为6 mmol·L^-1时,块茎的干重、鸟苷及多糖含量最高。结论：叶面喷钙缓解了高温对半夏叶片光合作用的抑制以及对PSⅡ系统的损伤,从而提高半夏的产量。     

光质对半夏生长及其药材品质的影响

以半夏为材料,采用蒽酮-浓硫酸法、考马斯亮蓝法、反相高效液相色谱法、反电位滴定法、酸性染料比色法等测量半夏在不同光质处理下的叶绿素含量、可溶性还原糖、可溶性蛋白、鸟苷、琥珀酸、生物碱等含量变化。得到结果为黄光可以促进半夏生长发育,促进块茎可溶性还原糖、总糖、生物碱及琥珀酸的合成,而蓝光促进块茎可溶性蛋白及鸟苷的合成;红、黄光提高叶绿素a,b含量,蓝光降低叶绿素a,b含量;白膜透过的光谱最均匀也最有利于叶绿素a 的合成;单光膜中,蓝膜与黄膜较有利于叶绿素a 的合成,而绿膜和红膜相对有利于叶绿素b的合成。红光下半夏的珠芽形成数最多,繁殖系数最大,说明在半夏的人工栽培中可以利用红光提高半夏的生产产量。