敲低 Aurora-A 抑制 HepG2人肝癌细胞增殖并促进其凋亡

目的探讨敲低Aurora-A对HepG2人肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法设计Aurora-A短发夹RNA(shRNA)片段,构建和包装Aurora-A shRNA慢病毒载体,转染HepG2细胞,实时定量PCR检测Aurora-A mRNA表达,Westernblot法检测Aurora-A蛋白及磷酸化水平,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果成功构建Aurora-A shRNA慢病毒载体,转染后的HepG2细胞Aurora-A蛋白磷酸化水平明显降低。敲低Aurora-A后,HepG2细胞增殖显著降低,细胞凋亡率显著增加。结论敲低Aurora-A的表达抑制HepG2细胞增殖并促进其凋亡。     

敲低富含亮氨酸的三角状五肽重复结构蛋白(LRPPRC)促进激素抵抗性前列腺癌细胞凋亡

目的研究富含亮氨酸的三角状五肽重复结构蛋白(LRPPRC)对激素抵抗性前列腺癌细胞凋亡的影响。方法Western blot法检测前列腺癌DU145细胞和LNCaP细胞LRPPRC和雄激素受体(AR)蛋白水平;在DU145细胞中瞬转LRPPRC小干涉RNA(siLRPPRC);反转录PCR检测转染细胞LRPPRC mRNA水平; Western blot法检测LRPPRC蛋白水平;噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率; Hoechst33258法和流式细胞术检测细胞凋亡率;荧光素酶法检测细胞ATP水平;Western blot法检测Bcl2、 BAX和胱天蛋白酶3(caspase-3)蛋白水平。结果 LRPPRC在DU145细胞和LNCaP细胞均高表达,但DU145细胞不表达AR。敲低DU145细胞LRPPRC水平后,细胞存活率显著降低、细胞凋亡增加、 ATP水平下降、活化的caspase-3蛋白水平增高、 Bcl2蛋白水平降低。结论敲低激素抵抗性前列腺癌DU145细胞LRPPRC促进细胞凋亡。     

ENDOD1在前列腺癌组织及细胞中的表达及意义

目的:观察比较核酸内切酶结构域内含蛋白1(endonuclease domain containing1,ENDOD1)在良性前列腺增生和前列腺癌组织中的表达差异;筛选存在ENDOD1特异性低表达的前列腺癌细胞系,继而通过调控该细胞ENDOD1蛋白表达,研究其在前列腺癌细胞中的生物学功能,初步探索ENDOD1基因与前列腺癌发生、进展的联系。方法:利用免疫组化SP法检测20例良性前列腺增生和21例前列腺癌术后标本组织中ENDOD1表达情况;利用RT-qPCR和Western blot方法观察ENDOD1的mRNA和蛋白在前列腺正常上皮细胞和不同类型前列腺癌细胞中的表达差异,筛选出特异性低表达细胞系;构建pCMV-N-Flag-ENDOD1重组质粒,转染前列腺癌细胞株,过表达ENDOD1蛋白,通过MTT法测定调控前后前列腺癌细胞活力的变化,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,Transwell实验评价肿瘤细胞迁移和侵袭能力的改变。结果:免疫组化评分的方差分析结果显示ENDOD1表达与前列腺癌Gleason评分呈负性关联;RT-qPCR和Western blot实验结果表明ENDOD1在雄激素非依赖性前列腺癌细胞系PC3和DU145中存在着特异性低表达(P0.05)。同时,MTT实验显示,在DU145细胞中,过表达ENDOD1肿瘤细胞活力显著下降(P0.05);而流式细胞术检测结果表明过表达ENDOD1能够使DU145细胞周期停滞在G_0/G_1期,但细胞凋亡率无明显差异。此外,在Transwell实验中,过表达ENDOD1的DU145细胞迁移和侵袭能力明显下降(P0.05)。结论:ENDOD1在Gleason评分越高的前列腺癌中表达越低,同时在雄激素非依赖性前列腺癌细胞系存在着特异性低表达;而过表达ENDOD1能明显抑制雄激素非依赖性前列腺癌细胞的生长、迁移和侵袭能力。     

RNA干扰MAD2基因对细胞增殖的影响

目的:探讨MAD2对HepG2细胞周期的影响。方法:构建针对MAD2基因的shRNA表达载体,MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒pmad2-EGFP共转染HepG2细胞株,用Western印迹法检测shRNA的抑制效应;用MTT法测定细胞增殖率;用流式细胞仪检测细胞周期。结果:shRNA的重组质粒表达载体能明显抑制MAD2绿色荧光融合蛋白的表达。HepG2细胞转染有效干扰质粒48h后,细胞增殖抑制率达65%。有效干扰质粒引起G0/G1期和S期细胞的明显降低,G2/M期细胞增多。结论:在细胞水平,可通过RNA干扰特异性抑制MAD2基因来抑制细胞的增殖,为研究MAD2基因在细胞增殖中的作用机制奠定基础。     

雌激素受体2对前列腺癌细胞系PC-3M增殖的影响

目的： 构建带有人雌激素受体2（ESR2）全长cDNA的重组质粒pcDNA3.1-hERβ,转染人前列腺癌PC-3M细胞株,观察ESR2对细胞增殖能力的影响。 方法：RT-PCR方法从人正常卵巢组织中获取ESR2全长cDNA,利用基因重组技术与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hERβ;瞬时转染前列腺癌PC-3M细胞株,应用细胞计数、MTT法及流式细胞术检测细胞增殖能力的改变;半定量RT-PCR法及Western blotting法分别检测增殖相关基因cyclinD1和 P21Cip1 mRNA及蛋白表达。 结果：DNA测序结果显示扩增的ESR2序列与GenBank（NM_001437）所公布的序列完全一致。重组质粒pcDNA3.1-hERβ瞬时转染人PC-3M细胞48 h后,与质粒对照组相比：RT-PCR法及Western blotting法显示,ESR2基因在mRNA水平和蛋白水平的表达均明显增加;细胞计数及MTT结果发现,细胞数目减少,细胞增殖活性下降（P<0.01）;流式细胞实验显示,G0/G1期细胞比例增加（P<0.05）,S期及G2/M期细胞比例减少（P<0.05）;RT-PCR及Western blotting结果还发现cyclinD1的表达减弱,而P21Cip1的表达增强。 结论：成功构建pcDNA3.1-hERβ重组质粒;带有ESR2全长基因的重组质粒转染PC-3M细胞后,细胞的增殖活性受到抑制;RSR2可能通过影响细胞增殖相关基因cyclinD1和 P21Cip1的表达抑制细胞的增殖。     

血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)敲低抑制宫颈癌SiHa细胞增殖并促进其凋亡

目的研究慢病毒介导短发夹RNA(shRNA)沉默血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)基因对人宫颈癌Si Ha细胞增殖和凋亡的影响。方法用ANGPTL4 shRNA慢病毒感染Si Ha细胞,实时荧光定量PCR检测各组细胞ANGPTL4 mRNA水平,Western blot法检测ANGPTL4蛋白水平;MTT法和软琼脂克隆形成实验检测Si Ha细胞增殖能力;流式细胞术检测Si Ha细胞周期。藻红蛋白标记的annexin V和7-氨基放线菌素D联合染色(annexin V-PE/7-AAD)结合流式细胞术检测慢病毒感染后Si Ha细胞的凋亡。结果重组慢病毒感染Si Ha细胞后,LV3-ANGPTL4组Si Ha细胞中ANGPTL4 mRNA和蛋白表达水平降低;MTT结果显示,LV3-ANGPTL4组细胞增殖受抑制;软琼脂克隆形成实验显示,LV3-ANGPTL4组细胞克隆形成数减少;流式细胞术结果显示,LV3-ANGPTL4组G0/G1期细胞所占比例增加,细胞凋亡率增高。结论下调Si Ha细胞ANGPTL4的水平可抑制细胞增殖,使细胞周期阻滞于G0/G1期,诱导细胞凋亡。     

p53AIP1基因转染对PC-3M人前列腺癌细胞生物学特性的影响

目的观测p53调节的凋亡诱导蛋白1(p53AIP1)对PC-3M人前列腺癌细胞的增殖、细胞周期、凋亡、侵袭及迁移的影响。方法构建真核载体pDC316-p53AIP1,并进行双酶切及PCR鉴定。在LipofectamineTM2000介导下转染至体外培养的PC-3M人前列腺癌细胞系中,Western blot法检测其表达,CCK-8法检测PC-3M细胞增殖情况,流式细胞术分析PC-3M细胞周期变化和annexinV-FITC/PI结合流式细胞术凋亡情况,TranswellTM实验检测p53AIP1对细胞迁移及侵袭能力的影响。结果成功构建了pDC316-p53AIP1真核表达载体,重组质粒转染PC-3M细胞后,Western blot法检测p53AIP1在PC-3M细胞中有表达,CCK-8结果显示表达的p53AIP1能抑制PC-3M细胞增殖(P0.05),流式细胞术检测细胞周期阻滞在S/G2-M期(P0.05)且p53AIP1能促进PC-3M细胞凋亡,TranswellTM侵袭和迁移实验显示p53AIP1使细胞侵袭迁移能力均降低(P0.05)。结论p53AIP1抑制PC-3M细胞的周期、增殖、侵袭及迁移,并能促进其凋亡。     

siRNA对卵巢癌细胞周期及EGFR表达的影响

目的体外构建编码人类表皮生长因子受体（EGFR）的小干扰RNA（siRNA）的质粒表达载体,观察其对卵巢癌Skov-3细胞EGFR的特异性抑制作用及对细胞凋亡和周期的影响。方法构建pSilencer-EGFR siRNA真核基因表达载体,采用脂质体介导的方法将其转染到卵巢癌细胞株Skov-3,实验分为以下3组：空白对照组（未经转染的人卵巢癌Skov一3细胞）、非特异性转染组（转染非特异性质粒载体）及特异性转染组。用RT-PCR的方法检测mRNA水平的变化,用免疫荧光法检测EGFR蛋白水平的变化,流式细胞仪检测其对卵巢癌细胞周期及凋亡的影响。结果成功构建pSilencer—EGFR siRNA真核基因表达载体。psiRNA—EGFR质粒明显下调Skov-3细胞中EGFR的表达,阻断细胞周期在G1期,促进细胞凋亡。结论重组质粒psiRNA—EGFR能有效地抑制Skov-3细胞内EGFR的表达、抑制细胞增殖,其抑制机制可能与引起细胞周期再分布、降低S期细胞比例和促进细胞凋亡有关。     

Survivin-siRNA对前列腺癌PC-3M细胞增殖的抑制作用

目的：探讨survivin-siRNA对前列腺癌细胞株PC-3M的增殖抑制作用。 方法:构建两个针对survivin siRNA表达载体，与脂质体和空质粒两个对照组一起分别转染前列腺癌PC-3M细胞后，利用半定量RT-PCR和Western blotting分别检测细胞survivin mRNA及蛋白表达水平，MTT法测定细胞的增殖能力，流式细胞术检测细胞周期和凋亡。 结果:转染72 h后，两个实验组细胞的survivin mRNA水平是脂质体组的48%±6% (n=3)和30%±5%(n=3)，蛋白表达水平是脂质体组的38%±4%（n=3）和36%±4%（n=3）。MTT检测实验组细胞的生长速度分别是脂质体组的44.20%±2.08%(n=3)和39.20%±1.93%（n=3），流式细胞术发现实验组G1期细胞比例明显高于两个对照组，而G2期和S期细胞比例减少，细胞出现凋亡。 结论:利用survivin-siRNA可明显抑制前列腺癌PC-3M细胞的增殖，细胞受阻于G1期, 诱导细胞凋亡，为进一步进行动物体内研究奠定了基础。     

MDA-7/IL-24 inhibits the growth and induces the apoptosis of human breast cancer MDA-MB-231 cell line

目的 探讨IL-24基因转染乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖抑制和促凋亡作用.方法 利用脂质体将穿梭质粒pDC316-hIL-24-EGFP瞬时转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过RT-PCR检测转染后hIL-24基因mRNA的转录,Western blot检测转染后IL-24和caspase-3蛋白的表达,MTT比色法测定细胞增殖的抑制,流式细胞仪检测细胞的凋亡和细胞周期的变化,Hoechst 33258染色检测细胞凋亡.结果 IL-24基因可在MDA-MB-231细胞中成功转录及表达.IL-2可上调MDA-MB-231细胞中caspase-3蛋白表达.IL-24基因的表达使得乳腺癌MDA-MB-231细胞出现增殖抑制.流式细胞仪检测显示MDA-MB-231细胞DNA合成受到抑制,细胞周期主要抑制在G2/M期.Hoechst 33258染色显示IL-24基因转染后MDA-MB-231细胞出现凋亡.结论 IL-24基因转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后可能通过上调caspase-3的表达而抑制细胞增殖,促进其凋亡.     

STAT3短发夹RNA表达载体的构建及对SiHa细胞增殖和凋亡的作用

目的:探讨信号转导子与转录激活子3短发夹RNA(shRNA)真核表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的作用.方法:根据siRNA设计原则, 结合pSilencer2.1-U6-neo质粒特点, 针对STAT3基因设计并合成两条寡聚DNA片段, 退火后克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒, 脂质体法将重组质粒转染人宫颈癌SiHa细胞.RT-PCR和Western blot检测SiHa细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平;MTT法和流式细胞术(FCM)检测细胞的增殖和凋亡.结果:成功构建了STAT3基因shRNA真核表达载体, 转染人宫颈癌SiHa细胞.细胞STAT3蛋白及mRNA表达下降;同时SiHa细胞增殖能力下降, 细胞凋亡增加.结论:构建的STAT3基因shRNA真核表达载体能够通过下调STAT3基因表达, 抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖能力, 诱导细胞凋亡.     

增殖细胞核抗原短发夹状RNA对人骨肉瘤细胞生长的影响

目的构建增殖细胞核抗原(PCNA)短发夹状RNA表达载体,检测其对人骨肉瘤细胞PCNA表达、细胞增殖及细胞凋亡的影响。方法体外构建PCNAshRNA表达载体pSilence2.1neo-PCNA,转染人骨肉瘤细胞系MG63,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测转染前后PCNAmRNA表达,免疫组织化学(SP)法检测转染前后PCNA蛋白的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法及克隆形成试验检测细胞增殖活性,3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)细胞掺入试验检测细胞DNA合成,流式细胞仪检测细胞周期分布,吖啶橙染色法检测细胞凋亡情况。结果pSilence2.1neo-PCNA载体转染能显著抑制PCNAmRNA及蛋白的表达,转染后mRNA表达抑制率为80.51%、增殖指数值为空白组的25.68%。转染组48h细胞增殖抑制率为61.78%,转染组3H-TdR掺入率明显低于空白组(P<0.01)。细胞周期分析显示,siRNA转染组G0G1期细胞含量显著增加,而S期细胞含量显著减低。转染组凋亡率为16.54%。结论pSilence2.1neo-PCNA可显著抑制MG63细胞PCNA的表达及细胞增殖活性,促进细胞凋亡。     

MDR1基因沉默增强三尖杉酯碱诱导的HT9细胞凋亡

目的: 探讨靶向P-糖蛋白(又称多药耐药蛋白1,MDR1)基因的shRNA对三尖杉酯碱诱导人耐三尖杉酯碱的前髓细胞白血病HT9细胞凋亡的影响。方法: 构建MDR1 基因特异的shRNA表达载体pSilencer 3.1-H1 neo-MDR1,稳定电转染HT9细胞,实时荧光定量PCR分析MDR1 mRNA的表达,Western blotting检测细胞MDR1蛋白表达,MTT法检测细胞活力,经三尖杉酯碱处理后琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞DNA片段化,激光共聚焦观察细胞形态变化,流式细胞术检测细胞周期变化。结果: 成功构建了shRNA表达载体pSilencer 3.1-H1 neo-MDR1,稳定转染后,HT9细胞MDR1 mRNA和蛋白表达均显著降低, HT9细胞三尖杉酯碱的 IC₅₀由(1.184±0.130)mg/L降至(0.711±0.010)mg/L。与HT9细胞相比,经三尖杉酯碱处理后稳定转染细胞HT9/sh-3.1-1的DNA ladder更明显,激光共聚焦显微镜下可见形态不规则的碎片状或梅花状等典型的细胞凋亡形态;细胞的S期细胞增多,并出现明显的凋亡峰。结论: shRNA表达载体pSilencer 3.1-H1 neo-MDR1能够稳定、持久地抑制MDR1 基因,并有效增强三尖杉酯碱诱导的HT9细胞凋亡。     

miRNA let-7a1真核表达载体的构建及对肺癌细胞增殖的影响

目的： 构建miRNA let-7a1真核表达载体,研究其在肺癌A549细胞株的表达及对A549细胞增殖的影响。方法：以人肺癌细胞A549的总RNA为模板,RT-PCR扩增miRNA pre-let-7a1基因序列, 将miRNA pre-let-7a1基因克隆到真核表达载体pSilencerTM4.1-CMV neo中,构建成pSilencerTM 4.1-let-7a1重组体。将pSilencerTM 4.1-let-7a1表达载体瞬时转染肺癌A549细胞,RT-PCR法检测miRNA let-7a1在转录水平的表达。根据miRBase Targets数据库,查hsa-let-7a1靶序列,构建 let-7a1靶序列-报道基因融合质粒pMIR-report-let-7a1T,与pSilencerTM 4.1-let-7a1表达载体共转染A549细胞,通过荧光素酶活性检测pSilencerTM 4.1-let-7a1质粒对其靶序列的作用。MTT法检测pSilencerTM 4.1-let-7a1转染A549细胞后,对细胞增殖的影响。结果：pSilencerTM 4.1-let-7a1真核表达栽体和let-7a1靶序列-报道基因融合质粒经酶切及测序鉴定正确。pSilencerTM 4.1-let-7a1转染 A549细胞后,经RT-PCR证明能有效表达miRNA let-7a1。 pSilencerTM 4.1-let-7a1 质粒和pMIR-report-let-7a1T质粒共转染A549细胞后,通过报告基因检测,相对荧光素酶活性明显降低,表明pSilencerTM 4.1-let-7a1转染A549细胞后,可表达let-7a1并具有生物学活性。MTT检测结果显示：pSilencerTM 4.1-let-7a1 转染后的A549活细胞数目明显减少。结论：成功构建了真核表达载体pSilencerTM 4.1-let-7a1,转染肺腺癌A549细胞后能有效表达,miRNA let-7a1基因过表达抑制A549细胞的增殖。     

慢病毒介导的RWDD3沉默对人胶质瘤U251细胞增殖和侵袭的影响

目的:探讨沉默RWDD3表达对人胶质瘤U251细胞生物学特征的影响。方法:构建靶向RWDD3的shRNA重组慢病毒并转染U251细胞,通过real-time PCR和Western blot在mRNA及蛋白水平鉴定转染结果。MTT法检测转染后细胞的细胞活力;平板克隆实验检测克隆形成能力;Brd U实验检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡的改变。结果:real-time PCR和Western blot结果均表明成功建立稳定沉默RWDD3的U251细胞株。与空白对照组及阴性对照组比较,转染RWDD3-shRNA组的细胞活力和克隆形成能力降低;侵袭及迁移能力均下降,穿膜细胞数明显减少;细胞周期进展被抑制,阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率增高(P0.05)。结论:RWDD3在胶质瘤细胞增殖和侵袭过程中发挥重要作用,提示RWDD3有望成为人脑胶质瘤基因治疗的候选靶点。     

敲低错配修复基因hMLH1可导致人胚肾细胞株293t的微卫星不稳定

 目的：探讨人胚胎肾细胞株293t中错配修复基因hMLH1的表达量与微卫星稳定性的关系。方法：构建针对hMLH1 基因的shRNA 表达载体,并干扰293t细胞hMLH1的表达,评价敲低hMLH1前后293t细胞微卫星状态的变化。结果：干扰组293t细胞相比对照组hMLH1表达明显敲低,微卫星状态由稳定变为不稳定。结论：293t细胞的hMLH1表达量与其微卫星状态密切相关,敲低hMLH1可导致293t细胞的微卫星不稳定。     

C-erbB2基因shRNA表达质粒对结肠癌细胞生物学行为的影响

目的:观察C-erbB2基因shRNA表达质粒对结肠癌HT-29细胞生长抑制、细胞周期和凋亡的影响。方法:用MTT法及流式细胞仪分别检测pGenesil-erbB2实验组(PEG)、转染试剂对照组(TRCG)、阴性质粒对照组(NPCG)细胞对结肠癌细胞生长曲线、细胞周期及细胞凋亡率的影响。结果:pGenesil-erbB2实验组、转染试剂对照组、阴性质粒对照组的生长抑制率分别为39.65%、7.23%、8.05%,实验组明显高于其他两组(P<0.01);pGenesil-erbB2实验组、转染试剂对照组、阴性质粒对照组的G0/G1期细胞分别占74.93%、67.19%、68.05%,实验组明显高于其他两组(P<0.05);S期细胞分别占7.81%、14.02%、13.70%,实验组明显低于其他两组(P<0.05);pGenesil-erbB2实验组、转染试剂对照组、阴性质粒对照组的凋亡率分别为19.21%、3.13%、4.08%,实验组明显高于其他两组(P<0.01)。结论:C-erbB2基因siRNA重组质粒可以明显抑制结肠癌细胞的生长;可以将细胞周期阻滞于G0/G1期;可以明显增加结肠癌细胞的发生凋亡;说明C-erbB2基因在结肠癌的发生和发展中也起到非常重要的作用。     

RNA干扰沉默HIF-1α基因对宫颈癌HeLa细胞定植和侵袭的影响

目的探讨HIF-1α基因短发夹干扰RNA(shRNA)低氧条件下对宫颈癌HeLa细胞定植和侵袭能力的作用。方法针对HIF-1α基因设计并合成2条寡聚DNA片段,退火后将其克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒中,构建shRNA真核表达质粒,脂质体转染人宫颈癌细胞株HeLa细胞。低氧培养后,应用Western blot和定量PCR法检测HIF-1α蛋白及mRNA表达水平;用软琼脂克隆形成实验和体外侵袭实验检测HeLa细胞的定植和侵袭能力。结果成功构建的HIF-1αshRNA真核表达载体转染宫颈癌HeLa细胞,低氧条件下HeLa细胞的HIF-1α蛋白及mRNA表达下降;同时细胞在软琼脂中克隆形成数和穿透Matrigel膜的细胞数减少。结论HIF-1α的shRNA真核表达载体在低氧条件下可抑制宫颈癌细胞的定植和侵袭能力。