腺病毒siRNA抑制RhoA基因并联合TNF-α诱导肝癌细胞凋亡的研究

目的建立RhoA基因的腺病毒siRNA系统,并联合TNF-α诱导肝癌细胞凋亡,分析RhoA在肿瘤细胞中的功能和作用。方法用已构建的RhoA干扰质粒构建RhoA的腺病毒siRNA系统,筛选重组病毒并感染HepG2细胞,应用Western blot和RT-PCR检测RhoA蛋白表达和基因表达水平。感染Ad-siRNA-RhoA腺病毒的肝癌细胞用TNF-α诱导后进行MTT以及细胞内DNA片段化检测。结果成功构建RhoA基因的siRNA腺病毒系统。用重组病毒感染肝癌细胞,RhoA蛋白表达抑制率为76.48%;RhoA基因的mRNA转录水平降低74.46%。MTT检测显示,感染腺病毒Ad-U6-control对照组以及感染腺病毒Ad-siRNA-RhoA实验组的细胞A值差异无统计学意义(F=5.41,P>0.01),即利用siRNA抑制肝癌细胞中RhoA表达,肿瘤细胞凋亡不明显。TUNEL检测显示,RhoA腺病毒siRNA联合TNF-α致肿瘤细胞凋亡作用显著。结论构建的腺病毒siRNA载体系统能抑制目的基因RhoA的表达,联合TNF-α能抑制肿瘤细胞生长和增殖并诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤基因功能的基础研究和肿瘤基因治疗打下了实验基础。     

siRNA腺病毒抑制Survivin基因表达诱导肝癌细胞凋亡

目的为改进质粒siRNA载体的不足,建立siRNA的病毒性载体系统,并探讨凋亡抑制因子Survivin基因在肝癌细胞中的作用。方法通过已建立的Survivin质粒siRNA,构建Survivin的腺病毒siRNA载体系统,筛选重组病毒并感染肝癌细胞HepG2细胞,应用Western blot和RT-PCR检测Survivin基因表达变化,用流式细胞仪观察肿瘤细胞凋亡。结果成功构建Survivin基因的腺病毒siRNA载体及重组腺病毒,感染肝癌细胞明显抑制Survivin蛋白表达,抑制率66.32%;降低Survivin基因的mRNA转录水平达72.04%;应用流式细胞仪观察肿瘤细胞凋亡明显增加。结论腺病毒siRNA载体系统可作为抑制目的基因,进而研究其功能和作用的技术平台,并为其他基因的相关研究打下基础;抑制Survivin基因表达可诱导肿瘤细胞HepG2的凋亡,为今后腺病毒siRNA载体应用于肿瘤动物实验和肿瘤基因治疗提供实验资料。     

抑制 RhoA 基因表达诱导乳腺癌细胞凋亡的实验研究

目的：探讨抑制RhoA基因表达诱导乳腺癌（ BC）细胞凋亡的作用。方法通过已建立的RhoA腺病毒载体系统,感染BC MCF -7细胞。经过细胞培养、病毒滴度等,将收集的样本分别用Western blot、RT-PCR技术检测RhoA 蛋白表达和基因表达变化;对感染Adsi RNA-RhoA的BC 细胞进行MTT检测及细胞内DNA片段化检测。结果腺病毒siRNA-RhoA感染BC细胞能明显抑制RhoA基因表达（抑制率为75．64％）,降低RhoA基因的mRNA转录水平69．44％。 MTT检测结果表明,感染腺病毒Adsi RNA-RhoA组的肿瘤细胞生长、增殖被明显抑制。 TUNEL检测显示,抑制RhoA基因表达能明显导致BC细胞凋亡。结论利用siRNA抑制BC细胞中RhoA基因表达,能诱导BC细胞凋亡。     

siRNA腺病毒体内抑制Survivin基因表达诱导裸鼠肿瘤细胞凋亡的研究

目的利用腺病毒siRNA载体介导的RNA干扰技术,在免疫缺陷鼠肝癌肿瘤动物模型中通过靶向沉默细胞凋亡因子Survivin的表达,探讨其在活体动物肿瘤组织中的作用。方法利用肝癌细胞株HepG2构建裸鼠肝癌肿瘤细胞动物模型,并按照病毒注射剂量分组,将已构建的Survivin-siRNA重组腺病毒注射入裸鼠肿瘤内,观察肿瘤生长状况并绘制肿瘤生长曲线,利用TUNEL反应测定肿瘤组织细胞内DNA的片段化观察细胞凋亡。结果注射AdsiR- NA-Survivin高、低剂量组肿瘤生长明显受到抑制,且抑制程度与注射的腺病毒浓度呈正相关;TUNEL实验表明注射AdsiRNA-Survivin高、低剂量组的肿瘤组织标本可见大量细胞核呈黄褐色、核质浓缩、细胞形态不规则的凋亡细胞。高剂量组、低剂量组、AdsiRNA-U6组、PBS组凋亡细胞数依次减少。结论腺病毒siRNA载体系统可应用于活体动物试验中;AdsiRNA-Survivin对裸鼠人肝癌移植瘤有明显抑制作用,与肿瘤感染数或浓度成正比,且能促进人肝癌肿瘤细胞的凋亡。     

靶向甲硫氨酸腺苷转移酶2A基因小干扰RNA抑制肝癌细胞生长的研究

目的研究靶向甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)2A基因的小干扰RNA(siRNA)对肝癌细胞生长和细胞凋亡的影响。方法以MAT 2A为目的基因,以产生siRNA质粒载体pSilence-2.1-U6为表达模板,细胞内转录合成4条siRNA;并构建携带荧光素酶报告基因的重组质粒载体plucA-MAT 2A。脂质体转染法将重组质粒载体plucA-MAT 2A与产生siRNA的质粒pSilence-2.1-U6共转染293 T细胞,定量检测荧光素酶活性,初步筛选出抑制荧光素酶表达的有效siRNA,然后将有效的siRNA转染Bel-7402肝癌细胞,半定量逆转录聚合酶链反应检测MAT 2A mRNA表达,并检测转染后肝癌细胞MAT的活性,进一步采用四甲基偶氮唑盐法观察siRNA对肝癌细胞生长的抑制率,用流式细胞仪检测siRNA对肝癌细胞凋亡的影响。结果所合成的4条siRNA中有2条抑制荧光素酶表达,抑制效率分别为81%和89%,并特异性抑制肝癌细胞MAT 2A表达,降低了肝癌细胞中MAT活性,抑制肝癌细胞的生长,诱导肝癌细胞凋亡。结论靶向MAT 2A基因的siRNA抑制肝癌细胞生长,诱导肝癌细胞凋亡;MAT 2A是肝癌基因治疗的一个很有希望的靶位点。     

XAF1基因在肝癌细胞凋亡中的诱导作用

背景：X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）与凋亡抑制和肿瘤细胞耐药现象密切相关。目的：研究XIAP相关因子1（XAF1）基因抑制人肝癌细胞株Bel-7404和HepG2增殖和诱导凋亡的作用。方法：以腺病毒Ad5／F35为载体,构建重组腺病毒Ad5／F35-XAF1、对照空病毒Ad5／F35-Null和报告病毒Ad5／F35-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）,分别以相同感染复数（MOI）感染人肝癌细胞株Bel-7404和HepG2,并设立空白组作为对照。作用48h后,以荧光显微镜检测Ad5／F35-EGFP的感染效率;分别以逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和蛋白质印迹法检测XAF1 mRNA和蛋白表达;以MTT法检测细胞活力;以Annexin V—FITC／PI双染法和原位末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡率。结果：Ad5／F35-EGFP感染48h后,几乎所有Bel-7404和HepG2细胞均表达EGFP。Ad5／F35-XAF1感染48h后,两种肝癌细胞中XAF1 mRNA和蛋白表达均明显增高．细胞活力呈剂量依赖性地降低,细胞凋亡率显著增加。结论：重组腺病毒Ad5／F35-XAF1在人肝癌细胞株Bel-7404和HepG2中的感染效率高,XAF1在不同的肝癌细胞株中恢复表达后,能显著抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡,有可能成为肝癌基因治疗的新靶点。     

腺病毒介导XAF1基因诱导人肝癌细胞株SMMC7721凋亡的实验研究

背景：X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）相关因子1（XAF1）是新近鉴定的肿瘤抑制基因,在许多人类恶性肿瘤中低表达甚至不表达。目的：研究Ad5/F35腺病毒介导XAF1基因诱导人肝癌细胞株SMMC7721凋亡的作用及其可能机制。方法：构建重组腺病毒Ad5/F35-XAF1、对照病毒Ad5/F35-Null和报告病毒Ad5/F35-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）,分别按不同感染复数（MOI）在同一作用时间点感染人肝癌细胞株SMMC7721。以荧光显微镜和流式细胞仪检测Ad5/F35-EGFP的感染效率;分别以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法检测XAF1mRNA和蛋白表达;以甲基噻唑基四唑（MTT）法检测细胞增殖率;以Annexin V-FITC/PI双染法和原位末端标记TUNEL法检测细胞凋亡率;以蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8和caspase-9的表达。结果：Ad5/F35-EGFP感染48h,MOI为2.0时,92%以上的SMMC7721细胞表达绿色荧光蛋白。Ad5/F35-XAF1感染48h后,SMMC7721细胞中XAF1 mRNA和蛋白表达增高,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡剂量依赖性地增多,并伴随凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8和caspase-9的裂解。结论：重组腺病毒Ad5/F35-XAF1在人肝癌细胞株SMMC7721中具有很强的感染效率,可促进XAF1基因表达,且能明显抑制人肝癌细胞增殖和诱导凋亡,此作用可能与XAF1激活了内、外源性凋亡通路有关。     

腺病毒介导的凋亡素、内皮抑素双基因对食管癌的实验研究

目的探讨携带有凋亡素(vp3、Apoptin)、内皮抑素(Endostatin)双基因的重组腺病毒载体在食管癌等多种肿瘤细胞内的表达情况及致凋亡作用,为进一步的食管癌治疗应用研究打下基础。方法将已纯化的携带凋亡素和内皮抑素基因的腺病毒Ad-vp3-IRES-sEndo-His感染食管癌细胞Eca-109、小鼠肝癌细胞Hepa1-6、结肠癌细胞LoVo提取各种细胞RNA,针对凋亡素、内皮抑素基因的表达进行RT-PCR检测,同时对感染腺病毒Ad-vp3-IRES-sEndo-His、Ad-vp3的食管癌细胞通过流式细胞仪、Hoechst33258染色等方式进行细胞凋亡率的检测。结果 RT-PCR检测显示被感染的多种肿瘤细胞均可表达凋亡素、内皮抑素基因的mRNA,Ho-echst33258染色显示被Ad-vp3-IRES-sEndo-His感染的食管癌细胞出现凋亡形态学改变,用流式细胞仪测定时段最高凋亡率达47.7%,与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)。结论携带凋亡素及内皮抑素双基因的腺病毒载体能在多种肿瘤细胞中表达,感染食管癌细胞后,能有效诱导其凋亡且其致凋亡率高于仅携带凋亡素的单基因腺病毒载体。     

可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体重组腺病毒载体的构建及其在肝癌细胞株中的表达

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）能诱导30余种人类肿瘤细胞凋亡，在抗肿瘤治疗中具有广阔应用前景。目的：构建携带可溶性TRAIL基因的复制缺陷型重组腺病毒载体，鉴定其在肝癌细胞株中的表达。方法：以重叠延伸聚合酶链反应（PCR）扩增白细胞介素（IL）-2信号肽和TRAIL膜外区融合片段，克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV，转化含复制缺陷型腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌pAdBJ5183，经细菌内同源重组产生重组腺病毒Ad-IL-2-TRAIL，以脂质体法转染HEK293细胞包装病毒，感染肝癌细胞株HepG2．荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的表达。结果：成功构建了携带可溶性TRAIL基因的复制缺陷型重组腺病毒载体。病毒感染HepG2细胞48h后，超过95％的细胞中出现绿色荧光。结论：所构建的复制缺陷型重组腺病毒Ad—IL-2-TRAIL可在肝癌细胞中高效表达可溶性TRAIL，为进一步行肿瘤TRAIL基因冶疗提供了实验依据。     

脂质体法转染人肿瘤坏死因子-α基因对裸鼠人肝癌移植瘤的抑制效应及其机制

背景：外源性肿瘤坏死因子（TNF）-α联合化疗药物对肿瘤的疗效较单独应用更佳,为肿瘤治疗提供了新的方向。目的：对裸鼠人肝癌移植瘤模型行脂质体介导的TNF-α基因瘤内转染,研究肝癌移植瘤的生长抑制情况及其机制。方法：经脂质体介导,以真核表达质粒pSVK3-TNF-α分别转染人肝癌细胞株SMMC-7721和裸鼠皮下SMMC-7721细胞移植瘤。测定SMMC-7721细胞的TNF-α浓度,甲基噻唑基四唑（MTT）法测定细胞杀伤率,流式细胞仪和原位末端标记（TUNEL）法检测细胞周期和凋亡情况。结果：TNF-α转基因治疗裸鼠人肝癌移植瘤结束第5d,移植瘤体积为（75.28±35.35）mm^3,显著低于对照组的（326.45±103.64）mm^3（P〈0.05）。TNF-α基因体外转染SMMC-7721细胞24、48、72h后,基因转染组每106个细胞的TNF-α表达量分别为（1680±187）pg、（1702±205）pg和（1650±164）pg,细胞杀伤率分别为（37.1±2.4）%、（79.4±4.3）%和（84.2±4.6）%。基因转染72h后,SMMC-7721细胞增殖指数为（30.5±3.2）%,显著低于对照组的（46.1±3.9）%（P〈0.05）;凋亡指数为（10.0±2.1）%,显著高于对照组的（2.7±0.4）%（P〈0.01）。结论：脂质体介导的TNF-α基因转染裸鼠人肝癌移植瘤可明显抑制肿瘤生长,其机制可能为影响肿瘤细胞生长周期以及诱导肿瘤细胞凋亡。     

KAI1 复制缺陷型腺病毒载体抑制人胰腺癌细胞迁移实验研究

目的 构建携带人肿瘤转移抑制基因KAI1复制缺陷型腺病毒载体并初步研究其对体外肿瘤细胞迁移的影响.方法 用Ad-EasyTM系统大肠杆菌中同源重组的方法,构建Ad-KAI1腺病毒载体,并在293细胞中包装、扩增和纯化,用其感染人胰腺癌细胞并检测KAI1的表达.结果 构建的Ad-KAI1可以高效感染人胰腺癌细胞系PANC1,并检测到感染Ad-KAI1的PANC1细胞中KAI1的高表达;同时观察到Ad-KAI1可以抑制胰腺癌细胞系PANC1的迁移.结论 携带人肿瘤转移抑制基因KAI1复制缺陷型腺病毒载体可抑制人胰腺癌细胞转移,为KAI1抗胰腺癌转移基因治疗提供依据.     

亚砷酸联合重组腺病毒Ad-IκBαM对肝细胞癌的治疗作用

目的:观察感染Ad-IκBαM对NF-κB激活的抑制及对亚砷酸诱导肝癌细胞凋亡的增强效应,探讨亚砷酸对肝癌细胞的治疗作用.方法:选择人肝癌细胞系BEL-7402和SMMC-7721,以不同浓度亚砷酸处理.制备重组腺病毒Ad-IκBαM,用来转染经和未经亚砷酸处理的肝癌细胞.MTT和TUNEL方法观察各组细胞生长及凋亡情况;应用EMSA及Western blot研究肝癌细胞核内NF-κB的激活情况和感染Ad-IκBαM对NF-κB激活的抑制效果.结果:MTT结果表明各浓度亚砷酸对肝癌细胞的作用较正常肝细胞显著(P＜0.01);Western blot和EMSA结果提示亚砷酸可明显抑制肝癌细胞生长,使细胞内NF-κB系统活化;感染重组腺病毒Ad-IκBαM的肝癌细胞后,亚砷酸引起的NF-κB的激活受到明显抑制.亚砷酸联合Ad-IκBαM或Ad-IκBα作用于肝癌细胞SMMC-7721的凋亡指数分别为66.47%和36.67%;亚砷酸联合Ad-IκBαM或Ad-IκBα作用于肝癌细胞Bel-7402的凋亡指数分别为74.5%和32.37%.结论:亚砷酸对肝癌细胞有明显的杀灭作用,同时激活了肝癌细胞内的NF-κB;应用重组腺病毒Ad-IκBαM可以有效抑制NF-κB的激活,并可明显增强亚砷酸对肝癌细胞的作用.     

小分子干扰RNA(siRNA)沉默CD147基因对脑胶质瘤细胞系SHG-44生长及凋亡的影响研究

目的探讨小分子干扰RNA(siRNA)沉默CD147基因对脑胶质瘤细胞系SHG-44生长及凋亡的影响。方法根据CD147 cDNA序列设计具有短发夹结构的两条DNA序列,与载体pSilencer4.1-CMV neo构建重组表达载体,鉴定后转染至SHG-44细胞,western blotting检测抑制效果,MTT检测细胞增殖情况,流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡情况。结构成功构建了针对CD147基因表达的干扰质粒,有效抑制了SHG-44细胞增殖,促进了SHG-44细胞凋亡。结论 CD147靶向RNA干扰重组表达载体为肝癌的基因治疗提供了可能。     

TNF-α诱导脑胶质瘤细胞凋亡过程中NF-κB、IκB活性的研究

目的探讨核转录因子-κB(NF-κB)及其抑制因子(IκB)在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导人脑胶质瘤细胞株U 251细胞凋亡过程中生物活性的变化。方法应用流式细胞仪检测TNF-α对U-251细胞生长的抑制和诱导凋亡作用。用免疫组化方法检测肿瘤细胞p65的表达,用W estern b lot检测IκB蛋白的变化。结果TNF-α可诱导U 251细胞凋亡,激活细胞中p65并诱导IκB降解;抗氧化剂二硫碳吡咯烷醇(PDTC)可抑制TNF-α诱导的IκB的降解及NF-κB的激活,增强TNF-α诱导U 251细胞的凋亡。结论TNF-α在诱导U 251细胞凋亡的过程中可激活NF-κB。抑制NF-κB活性,可增强TNF-α诱导细胞凋亡的作用。     

腺病毒介导的p16和顺铂的联合应用对胆管癌细胞系QBC939的生长抑制作用

目的研究p16基因和顺铂联合应用对胆管癌细胞的作用.方法将重组体腺病毒p16(Ad-p16)和顺铂联合作用于人胆管癌细胞QBC939,对p16基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析.结果用Ad-LacZ进行重组体腺病毒转导效率的检测,发现当MOI为100以上时,重组体腺病毒可使90%以上的培养的人胆管癌QBC939细胞被转导.用RT-PCR方法检测,在胆管癌QBC939细胞系中p16呈低表达.重组体腺病毒能介导外源基因p16在胆管癌QBC939细胞系中高效表达.重组体腺病毒介导的p16在QBC939细胞中表达,能抑制QBC939细胞的生长和集落形成.其与顺铂联合应用对QBC939细胞的生长抑制具有明显作用.并显著地抑制该肿瘤细胞的克隆形成能力.流式细胞计数证实p16能诱导QBC939细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞,顺铂能诱导QBC939细胞发生凋亡并导致细胞发生明显的G2期阻滞.结论p16基因能够增加QBC939细胞对顺铂的敏感性.     

肝癌抑制基因-1肿瘤靶向性表及其特异性抗肿瘤作用

目的 建立肝癌抑制基因-1(HCCS1)肿瘤靶向性表达载体,提高肿瘤治疗的安全性.方法 活细胞计数试剂盒测定HCCS1高表达对正常细胞和肿瘤细胞的影响,荧光素酶试验检测肿瘤特异性启动子PEG-3p在正常肝细胞和肝癌细胞中的相对转录活性,AdEasyTM系统包装并利用PCR鉴定重组腺病毒Ad-PEG-3p-HCCS1,Western blot检测重组腺病毒感染后HCCS1在正常细胞和肿瘤细胞中的表达情况,结晶紫试验和四甲基偶氮唑盐试验观察该重组腺病毒体外抗肿瘤的靶向性. 结果 HCCS1高表达对肿瘤细胞株BEL-7404和SW-620的生长抑制作用明显超过正常细胞株L02和正常人肺成纤维细胞,96 h抑制率达60%.荧光素酶试验显示,PEG-3p在BEL-7404、BEL-7405、QGY-7703中的相对转录活性分别为L02的3.9、4.7、1.5倍.成功构建了新抑癌基因HCCS1肿瘤靶向性表达的重组腺病毒Ad-PEG-3p-HCCS1,Western blot检测结果显示,在BEL7404和QGY-7703中,HCCS1表达高于在L02中的表达.结晶紫试验和四甲基偶氮唑盐试验显示,Ad-PEG-3p-HCCS1与Ad-CMV-HCCS1相比,在不降低对肿瘤抑制效果的前提下,明显降低了对正常细胞的杀伤作用. 结论 肿瘤细胞对HCCS1的生长抑制作用更为敏感,PEG-3p在肝癌细胞中也具有肿瘤特异性,Ad-PEG-3p-HCCS1可特异性地在肿瘤细胞中表达HCCS1,从而提高HCCS1基因治疗的安全性.     

TNF-α诱导脑胶质瘤细胞凋亡过程中NF-κB、IκB活性的研究

目的探讨核转录因子-κB（NF-κB）及其抑制因子（ⅠκB）在肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导人脑胶质瘤细胞株U251细胞凋亡过程中生物活性的变化。方法应用流式细胞仪检测TNF-α对U-251细胞生长的抑制和诱导凋亡作用。用免疫组化方法检测肿瘤细胞p65的表达，用Western blot检测IκB蛋白的变化。结果TNF-α可诱导U251细胞凋亡，激活细胞中p65并诱导ⅠκB降解；抗氧化剂二硫碳吡咯烷醇（PDTC）可抑制TNF-α诱导的ⅠκB的降解及NF—κB的激活，增强TNF-α诱导U251细胞的凋亡。结论TNF-α在诱导U251细胞凋亡的过程中可激活NF—κB。抑制NF—κB活性。可增强TNF-α诱导细胞凋亡的作用。     

重组腺病毒载体介导HOSM基因对肝癌细胞体外增殖的抑制作用

目的:构建含人抑瘤素M(human oncostatin M,HOSM)基因的复制缺陷型重组腺病毒载体AD-HOSM,观察其对人肝癌细胞株HepG2在体外生长抑制情况.方法:通过同源重组方法构建含HOSM基因的缺陷型重组腺病毒载体AD-HOSM,用报告基因AD-GFP检测腺病毒的对人肝癌细胞系的转染效率:人肝癌细胞株HepG2转染含HOSM基因的缺陷型腺病毒载体AD-HOSM后,用RT-PCR法检测外源HOSM基因在其中的表达;台盼蓝染色、细胞计数法检测AD-HOSM对HepG2的体外增殖抑制情况.结果:成功构建了重组腺病毒载体AD-HOSM,AD-HOSM对肝癌细胞HepG2有较高的转染效率,并且转染效率与病毒的剂量呈正相关.AD-HOSM感染HepG2细胞48h,HOSM基因在转染细胞能有效的表达.体外试验示,AD-HOSM转染的细胞的增殖却受到明显的抑制.结论:重组腺病毒介导HOSM表达能有效抑制HepG2在体外的增殖,提示重组腺病毒介导的HOSM基因治疗可能成为肝癌治疗的候选方案.     

KAI1复制缺陷型腺病毒载体抑制人胰腺癌细胞迁移实验研究

目的 构建携带人肿瘤转移抑制基因KAI1复制缺陷型腺病毒载体并初步研究其对体外肿瘤细胞迁移的影响。方法 用Ad—EasyTM系统大肠杆菌中同源重组的方法，构建Ad—KAI1腺病毒载体，并在293细胞中包装、扩增和纯化，用其感染人胰腺癌细胞并检测KAI1的表达。结果 构建的Ad—KAI1可以高效感染人胰腺癌细胞系PANCl，并检测到感染Ad-KAI1的PANCl细胞中KAI1的高表达；同时观察到Ad-KAI1可以抑制胰腺癌细胞系PANCl的迁移。结论 携带人肿瘤转移抑制基因KAI1复制缺陷型腺病毒载体可抑制人胰腺癌细胞转移，为KAI1抗胰腺癌转移基因治疗提供依据。     

可溶性人TRAIL基因表达载体的构建及其诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究

目的 构建可溶性肿瘤坏死因子（TNF）相关凋亡诱导配体TRAIL基因表达载体并研究其瞬时转染对肿瘤细胞凋亡的影响。方法 采用重叠延伸PCR法克隆含有TNF-α信号肽的人TRAIL基因，并将其连入pUCm-1载体。测序正确后克隆入表达载体pcDNA3．1中。采用Gene-Companion^TM非脂质体型聚阳离子转染试剂体外瞬时转染人膀胱癌EJ细胞，RT—PCR法检测目的基因mRNA水平的表达，Western blot检测细胞培养上清中目的基因的表达，流式细胞术检测细胞凋亡，克隆形成实验检测细胞存活。结果 成功构建了可分泌表达的人可溶性TRAIL表达载体，体外转染TRAIL的EJ细胞凋亡率均显著高于未转染细胞及转染空载体细胞的凋亡率，并明显抑制细胞存活，细胞存活率为51.34％，明显低于末转染细胞及转染空载体的细胞存活率。结论 所构建的可溶性TRAIL表达载体转染肿瘤细胞可诱导细胞凋亡及抑制肿瘤细胞的生长存活。