原代大鼠脑微血管内皮细胞培养方法的改进

<正>血脑脊液屏障(blood brain barrier,BBB)是机体的内部屏障之一,由介于血循环与脑实质间的软脑膜、脉络丛的脑毛细血管壁和包于壁外的胶质膜所组成,是中枢神经系统的重要解剖结构基础[1]。血脑脊液屏障主要是由脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)和周细胞构成,星形胶质足突包绕毛细血管的外周,覆盖其95%~99%的表面积。其中,血管内皮细胞是构成血脑脊液屏障的关键组织细胞位     

Olig基因在少突胶质细胞的发生和中枢神经系统损伤修复中的作用

中枢神经系统（central nervous system,CNS）主要由神经元和神经胶质细胞组成,其中神经胶质细胞包括少突胶质细胞（oligodendrocyte,OLs）、小胶质细胞和星形胶质细胞等。OLs在CNS内包绕神经元轴突形成髓鞘,使得有髓神经纤维传导神经冲动的速度和效率得到极大提高^[1]。在多发性硬化症（multiple sclerosis,MS）、创伤性脊髓损伤、少突胶质细胞瘤等一些CNS     

体外血脑屏障模型的建立及发展

1885年德国人Paul Ehrlich第一次证明了脑血管的通透性与非神经性血管不同,其后的研究者们相继认识到血和脑之间有屏障存在,并称之为血-脑屏障(blood-brain barrier,BBB).血脑屏障是一个以脑微血管内皮细胞(brain micro-vascular endothelial cell,BMEC)、星形胶质细胞(Astrocyte)和周细胞(Pericyte)共同构成的结构的和功能的屏障,它调节分子进出大脑以维持神经的微环境.脑微血管内皮细胞以细胞间的紧密连接(tight junction,TJ)为主要特征、缺少窗口结构、低胞饮作用、无Weible-Palade小体,这些其他血管内皮细胞所不具备的特征,使其成为BBB的主要结构基础,也是BBB的功能基础,可以保护大脑不被血液内的微生物和毒素的伤害.     

海洛因成瘾大鼠脑血脑屏障超微结构的变化

目的：建立海洛因成瘾大鼠模型,电镜下观察其脑组织中血脑屏障及其周围胶质细胞的超微结构变化。方法：采用递增法给大鼠皮下注射海洛因人为建立海洛因成瘾动物模型,设对照组和模型组,取两组大鼠多部位脑组织作电镜观察。结果：海洛因成瘾大鼠脑内各取材部位在电镜下都能观察到血脑屏障(BBB)通透性增加的一系列超微结构变化,如毛细血管内皮细胞变薄、内皮细胞内吞饮小泡明显增多、内皮细胞间紧密连接破坏等。BBB毛细血管基膜外星形胶质细胞足板水肿,毛细血管周围星形胶质细胞也水肿。结论：海洛因成瘾大鼠脑组织广泛性出现BBB通透性增加的超微结构变化,BBB周围星形胶质细胞水肿,这些改变影响脑细胞与外周之间的物质交换和信息交流,最后引起脑细胞损害,此作用应是海洛因致脑损害的病理机制之一。     

水通道蛋白4基因敲除对老年小鼠行为和脑形态变化的影响

目的：观察AQP4基因敲除（AQP4^-/-）对老年小鼠行为学和脑形态学变化的影响,揭示AQP4在脑老化中的作用。方法：58只CD-1小鼠按基因型与月龄分为4组：年轻（2~3个月龄）AQP4-/-组、老年（17~19个月龄）AQP4^-/-组、年轻AQP4^+/+组和老年AQP4^+/+组。采用开场试验测定小鼠运动量和探究行为,脑切片进行神经元特异性染色（甲苯胺蓝染色、NeuN染色）、星形胶质细胞特异性染色（GFAP染色）和小胶质细胞特异性染色（Iba-1染色）,观察并计数皮层和海马神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞的形态和数量。结果：与年轻小鼠比较,老年AQP4^+/+和AQP4^-/-小鼠在开场试验的总活动距离分别减少41.2%和44.1%（P<0.05）,各组小鼠在中心区域的活动距离和滞留时间无差异;老年AQP4^+/+和AQP4^-/-小鼠皮层神经元密度分别降低19.6%和15.8%（P<0.05）,各组间CA1区神经元胞体层厚度无差异;老年AQP4^+/+和AQP4^-/-小鼠海马CA3区星形胶质细胞密度分别增加57.7%和64.3%（P<0.001）,各组间星形胶质细胞的总面积无显著差异;老年AQP4^+/+和AQP4^-/-小鼠海马CA3区小胶质细胞的面积分别增加46.9%和52.0%（P<0.01）,各组间小胶质细胞密度无显著变化。与AQP4^+/+小鼠相比,AQP4^-/-小鼠在海马CA3区星形胶质细胞总面积明显减小,年轻小鼠减小18.0%（P<0.01）,老年小鼠减小23.6%（P<0.01）,其余指标均无显著差异。结论：AQP4可能影响小鼠星形胶质细胞形态及与星形胶质细胞相关的神经功能,对神经元、小胶质细胞的形态和部分相关神经行为无明显影响,AQP4基因敲除对小鼠脑老化过程发生的脑形态和神经行为变化无显著影响。     

大鼠C6脑胶质瘤血-瘤屏障的HRP示踪电镜研究

目的 研究C6脑胶质瘤不同区域BBB的通透性改变及超微结构特征.方法 运用中晚期SD大鼠C6脑胶质瘤动物模型,以肿瘤中心、肿瘤边缘、邻近肿瘤脑组织(BAT)、远隔肿瘤脑组织(BDT)和正常脑组织(NBT)为研究热点区,采用外源性辣根过氧化物酶(HRP)酶组化光镜、示踪透射电镜观察脑血管内皮细胞(BMECs)紧密连接(TJs)和胞饮的改变.结果 光镜观察肿瘤区HRP在血管腔及管壁周围弥散存在,而非肿瘤区则呈线状排列于血管内皮腔面;电镜示HRP在肿瘤中心与边缘部充填并通过BMECs之TJs至血管腔外-脑间质裂隙内,BAT有HRP渗出至局部基底膜(BM),而NBT和BDT则完全封闭于血管腔内;肿瘤BMECs胞浆内吞饮囊泡数显著高于非肿瘤组(P＜0.05),但两者几乎均无充填HRP的囊泡(P＞0.05).结论 TJs开放是C6脑胶质瘤血-瘤屏障(BTB)通透性增高的结构基础和物质血管外渗的主要途径,胞饮作用甚微;C6胶质瘤诱导的屏障功能破坏随肿瘤距离的增加而减弱.     

人参总皂苷调控中风后巢内细胞对神经干细胞的作用

目的:中风是一种严重危害人类健康的疾病,神经干细胞能够促进中枢神经系统功能的修复。神经干细胞的增殖、分化、迁移需要干细胞niche的调控,前期实验发现人参总皂苷可以显著增加中风后神经干细胞的数量。体外模拟神经干细胞niche内星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞对神经干细胞的影响,以研究人参总皂苷是否能作用于星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞而促进中风后神经干细胞的分化,修复脑损伤?将脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经干细胞共培养,观察模拟神经干细胞niche内复杂微环境条件下,人参总皂苷能否使脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞分泌的VEGF增多,从而促进中风损伤的神经干细胞分化。方法:取1-3d的新生SD大鼠,分离培养星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞。取孕16d SD大鼠,分离培养神经干细胞。利用Transwell装置,将神经干细胞、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞共培养。制备神经干细胞缺氧6h的脑中风模型。用含1μg/ml的人参总皂苷培养基作用1d,设置空白对照组。MAP-2标记成熟神经元,GFAP标记星形胶质细胞。用细胞免疫荧光化学染色检测缺氧6h神经干细胞分化后的MAP-2和GFAP阳性细胞比例,ELISA检测人参总皂苷对星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞共培养上清中VEGF含量的影响。结果:与脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞共培养条件下,与空白对照组比较,人参总皂苷可显著增加MAP-2阳性细胞比例(P<0.01);人参总皂苷作用于星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞48h可显著上调VEGF表达(P<0.01)。结论:人参总皂苷作用于脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞可增加中风后神经干细胞向神经元定向分化并促进其成熟,可能与人参总皂苷调控脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞VEGF分泌,改善神经干细胞niche微环境有关。     

胶原和微载体基质在脑星形胶质细胞培养中的应用

目的：研究脑星形胶质细胞在用一定量胶原、微载体基质制备的细胞培养环境中微载体上的贴壁分布,探讨胶原、微载体基质及其浓度与细胞生长的关系,并筛选出最佳技术参数。 方法：以乳化的微小球形颗粒载体为基质,用一定浓度胶原、微载体基质制备细胞培养微载体环境,对大鼠脑星形胶质细胞进行囊化高密度长期培养。结果：细胞贴壁率与胶原、微载体培养环境中胶原浓度有关,不同浓度胶原包埋微载体培养环境条件对细胞生长影响不同。在胶原、微载体基质培养环境下培养7 d后,脑星形胶质细胞密度由2×10⁵/15 mm平皿达到18×10⁵/15 mm平皿,培养6个月后达到40×10⁵/15 mm平皿,在该培养条件下所能达到的细胞最大密度明显高于常规培养,并以很高的细胞存活率维持更长时间。此时微载体量为4 g•L^-1,胶原溶液与微载体的比例为1∶3。 结论：在合适的培养条件下,细胞能维持在有限体积培养液中高密度长期生长。     

海洛因成瘾致大鼠脑损伤机制的探讨

目的:从形态学上研究海洛因成瘾致大鼠脑损伤的机制.方法:采用递增法人为建立海洛因成瘾动物模型,设对照组和模型组,取2组大白鼠前额皮质、海马、下丘脑等部位脑组织做电镜观察.结果:海洛因成瘾大白鼠脑内多部位神经元胞体、轴突、树突都出现变性、胀亡、凋亡等超微病理结构改变;星形胶质细胞增生肥大,亦可见退变星形胶质细胞;广泛性出现血脑屏障(BBB)通透性增加的超微结构变化,BBB周围星形胶质细胞水肿.对照组电镜超微结构影像正常.结论:海洛因成瘾可通过直接损害神经元、星形胶质细胞以及BBB的通透性改变等方面损伤脑组织.     

大鼠脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型的建立

[目的]建立大鼠脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型。[方法]采用原代培养脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养方法建立血脑屏障体外模型。[结果]星形胶质细胞与脑微血管内皮细胞共培养可提高血脑屏障特异性酶——γ-谷胺酰胺转肽酶、碱性磷酸酶的表达,提高脑微血管内皮细胞跨细胞间电阻。[结论]成功建立脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型,而且较单层内皮细胞模型更接近在体状态。     

脑皮质星形细胞在1,25-(OH)2D3限定培养中表达NGF

目的：研究原代中枢神经胶质细胞在1,25-二羟维生素D₃［1,25-(OH)₂D₃］化学限定培养中神经生长因子（NGF）基因转录及表达。方法：用新生乳鼠脑皮质制备星形胶质细胞,采用浓度0、10_-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11及10^-12 mol•L^-1 1,25-(OH)₂D₃化学限定无血清培养液培养后,RT-PCR法检测NGF mRNA转录,双向夹心-ELISA检测NGF。 结果：1,25-(OH)₂D₃化学限定无血清原代培养的神经胶质细胞在1,25-(OH)₂D₃作用下可分泌NGF,实验中1,25-(OH)₂D₃有效浓度范围10^-11~10_-7mol•L^-1;1,25-(OH)₂D₃培养6 h后开始检测到mRNA的表达,12 h时表达最高,36 h后检测不到NGF mRNA的表达;而NGF蛋白的ELISA反应持续时间大于48 h。结论：星形神经胶质细胞的NGF基因可被甾体激素1,25-(OH)₂D₃激活并转录表达。     

血脑屏障结构功能及体外模型的研究进展

<正>血管与脑、脊髓细胞外液之间存在的一个调节界面,即脑屏障。由血脑屏障(BBB)、血一脑脊液屏障(BCSFB)和脑脊液一脑屏障共同组成。脑屏障仅允许必需的代谢物质进入,阻止和移除不需要的代谢产物或毒性物质^([1]),使中枢神经系统能够在脑外环境不断动态变化的情况下,保持神经组织的正常活动及内环境的稳定([1]),使中枢神经系统能够在脑外环境不断动态变化的情况下,保持神经组织的正常活动及内环境的稳定^([2])。3个屏障中,BBB最为重要。BBB是血液和CNS之间物质交换的基础并具有精密的解剖结构,其完整性无论是在生理还是病理情况下都是极其重要的。BBB具有诸多重要作用,包括为脑部必需营养物质提供运输通道,调节代谢产物的流出,限制离子和液体在血液与脑之间的运输等。     

基于微流控技术的肺芯片体外模型构建的研究进展

<正>微流控技术是一种精确控制和操控微尺度流体，以在微纳米尺度空间中对流体进行操控为主要特征的生物技术^[1,2]，微流控芯片(microfluidic chip)可以构建各种微环境，实现多种细胞间共同培养，为细胞生长提供一种与人体高度近似的环境^[3,4]，如肺芯片^[5,6]、血管芯片^[7]、肠芯片^[8]、肝芯片^[9]、肌肉芯片^[10]等。芯片上的器官(organs-on-a-chip,OOC)是指使用3D培养技术对干细胞进行分化诱导进而形成类似于目标器官或组织的技术^[11]，相比于广泛使用的Transwell方法^[12]，它不需要使用专门设计的流动腔来模拟流体剪切力等生理特征，可以取代动物实验模型，降低药物开发成本，为药物递送和毒性筛选提供更好的平台^[13]。     

非编码RNA网络在肺动脉高压中的作用及机制

<正>肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)是慢性低氧性肺部疾病的常见并发症,是世界范围内最常见的死亡和致残原因之一^[1]。肺血管重塑是PH最重要的病理特征^[2],在重塑过程中,大小肺动脉都会发生明显的结构改变,包括肺血管内皮细胞(pulmonary vascular endothelial cells,PVECs)增殖和纤维化,肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)迁移,外膜或血管周围炎症和纤维化^[3]。PH的患病率在儿童和成人中均不断增加且其致残率和致死率均很高,     

血脑屏障体外模型的建立与评价

血脑屏障由脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞（astrocyte,As）足突、基底膜及周皮细胞组成.脑微血管内皮细胞是BBB主要结构基础,As对维持BBB的完整性起重要作用].本研究采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）与小鼠As共培养构建BBB体外模型,并对其形态及屏障功能进行鉴定,以期成为体外研究物质（包括药物）经BBB通透的一种简便而可靠的工具.     

星形胶质细胞的活化机制及功能研究

星形胶质细胞与神经元之间存在复杂的相互作用,以维持神经系统内环境的稳定.近年随着膜片钳及分子生物学技术的应用,人们发现星形胶质细胞表面不仅具有电压依赖的Na^＋、K^＋及Ca^2＋通道,而且分布着许多神经递质、神经肽、激素及神经营养因子受体[1],并能合成及分泌多种神经活性物质,在维持神经元内外环境、免疫调节及信号转导等方面具有重要作用,与中枢神经系统（central nervous system,CNS）疾病密切相关,因此星形胶质细胞对神经元生存起重要作用[2～4].在病理条件下,星形胶质细胞从静息状态快速向活化状态转变,其活化具有瀑布效应,活化的星形胶质细胞对神经元起保护或毒性作用,从而发挥“双刃”效应.进一步探讨星形胶质细胞的活化机制及功能,对认识脑的奥秘具有重要意义.     

诱导脂肪干细胞成内皮分化的研究进展

<正>慢性难愈创面影响着全球数百万危及生命的个体,可能导致截肢和严重的疾病^[1]。微血管病变所致的局部组织缺血微循环障碍是创面难愈的主要原因之一^[2]。国内外学者应用内皮细胞治疗缺血性疾病已取得一定的疗效,但由于内皮细胞难以获取且为终末细胞,无法在体外大量扩增而受到限制^[3]。近年来,血管组织工程的发展为缺血性疾病的治疗提供了新的思路。     

反应性星形胶质细胞在中枢神经系统疾病中的作用

星形胶质细胞在促进突触形成和功能维持、调节中枢神经系统(CNS)血流、支持和滋养神经细胞、维持内环境稳态和血脑屏障功能等方面均具有重要作用.其中,反应性星形胶质细胞(RAS)在CNS免疫反应、神经退行性疾病中发挥重要作用.根据产生条件和生理功能不同,RAS可分为A1型和A2型,不同亚型的RAS在不同CNS疾病发生发展过...     

高原反应的脑病理与水通道蛋白-4(AQP4)的相关性实验研究

目的研究高原反应的脑病理变化及发病机制.方法Wistar大白鼠56只,分正常对照和实验组,实验组进入模拟5 000 m高原环境饲养,取4、24、48 h、3 d、2、4周各组各时相点动物活杀取脑作光、电镜一般形态学观察,硝酸镧示踪血管通透性观察,水通道蛋白(AQP4)和mRNA光、电镜免疫组化和原位杂交,GLU(glutamate,谷氨酸),GABA(gamm-aminobutyric,γ氨基丁酸)含量检测.结果光、电镜观察显示实验组早期(4～72 h)脑毛细血管内皮细胞出现吞饮泡增多、线粒体肿胀、紧密连接松弛、胶质足肿胀以及(24、48 h)硝酸镧漏出血管腔等病理改变,神经细胞无明显病理变化;免疫组化和原位杂交显示AQP4在血管内皮细胞、胶质纤维阳性表达,AQP4 mRNA在毛细血管内皮细胞核和胶质细胞核呈阳性表达,二者的表达情况在实验组早期增高.结论BBB病变是动物进入高原出现较早的病理变化;早期胶质细胞肿胀可能是一种保护性调节;AQP4 mRNA的表达变化可能是调节BBB通透性并维持水平衡的分子机制.     

星形胶质细胞对中枢神经损伤再生的影响

中枢神经系统 (CNS)损伤后的常见反应之一是反应性胶质增生 (reactivegliosis) ,表现为星形胶质细胞数目增加 ,细胞较正常时出现更多的胶质丝和突起 ,代谢活动亦增强。星形胶质细胞及其突起可以包围受损和变性的神经元 ,最终导致胶质瘢痕 (glialscar)的形成[1] 。以往认为胶质瘢痕对哺乳动物神经系统损伤后轴突再生起严重障碍作用 ,但目前医学界对此提出许多不同的见解。本文对星形胶质细胞与CNS损伤修复关系作一综述。1　胶质瘢痕的产生促使胶质瘢痕产生的因素很多 ,可能有 :①创伤刺激脑实质中的小胶质细胞 ,促使其分泌白介素 1(IL 1…