小麦叶片蛋白质组分析中高丰度蛋白Rubisco酶的快速去除方法研究

【目的】建立一种小麦叶片蛋白质组分析时去除全蛋白提取物中高丰度蛋白Rubisco酶的方法,为富集低丰度蛋白,提高双向电泳灵敏度提供技术支持。【方法】采用分离技术,以铭贤169小麦苗期叶片为材料,使用不同浓度(1,2,5,10 mmol/L)的肌醇六磷酸钠,结合二水氯化钙在不同温度(4,20,37℃)去除小麦叶片蛋白中的Rubi-sco酶,筛选去除小麦叶片蛋白Rubisco酶的最佳条件,并采用一维凝胶电泳(1-DE)、Western blot方法检测去除Rubisco酶的有效性,用二维凝胶电泳(2-DE)评估该方法对样品在二维凝胶上分辨率的影响。【结果】在37℃条件下,采用10 mmol/L肌醇六磷酸钠结合10 mmol/L的二水氯化钙去除小麦叶片蛋白中的Rubisco酶,可以获得较好的去除效果。在上述条件下作用10 min,小麦叶片水溶性蛋白提取物中超过80%的Rubisco酶得以沉淀去除,二维电泳图谱上有更多的低丰度蛋白点显现,且水平条纹明显减少,分辨率有所提高。【结论】得到了一种用于小麦叶片蛋白质组分析时去除高丰度蛋白Rubisco酶的方法,该方法具有快速、高效、成本低的特点。     

仿刺参7个盐度相关基因在低盐胁迫下的表达模式

从仿刺参Apostichopus japonicus低盐转录组数据库中选取肌腱蛋白-R1 (TN-R1）、肌腱蛋白-R2(TN-R2)、乙酰胆碱受体亚基α-3(CHRNA3）、脂肪酸结合蛋白6(FABP6)、单羧酸转运蛋白2(SLC16A7)、纤维胶凝蛋白1 (Fcn1)、黑素转铁蛋白(Mfi2)共7个盐度调节相关基因, 利用 qRT-PCR 技术分析这7个基因在低盐胁迫下不同组织中的表达水平及表达丰度。结果表明TN-R1基因在仿刺参体腔液中表达水平最高,呼吸树次之,肠表达较低;TN-R2基因在仿刺参体腔液中表达水平最高,在肠中表达较低,呼吸树中不表达。SLC16A7、FABP6、Fcn1、CHRNA3和Mfi2均在体腔液中表达最高。Mfi2基因在体腔液中明显上调表达,在呼吸树组织和肠组织中下调表达,且与对照组均呈显著性差异。Fcn1在体腔液中的表达量在胁迫后1.5 h达到最高,为对照组的669倍,在胁迫48 h之前均呈明显上调。低盐胁迫下这7个基因表达丰度的变化,说明这些基因或作为功能基因直接参与机体的盐度适应的代谢调节,或作为调控基因调节盐度相关功能蛋白的表达和活性来提高仿刺参对低盐胁迫的耐受能力。上述结果表明仿刺参的盐度适应过程是一个需要多基因参与的应激反应信号转导网络,为仿刺参盐度调节适应机制的研究奠定基础。     

两种生态型蚯蚓体腔液蛋白质组分的分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术对两种不同生态类型的微小双胸蚓(Bimastus parvus)和威廉环毛蚓(Pheretima guillelmi)体腔液进行了分离比较研究。不同生态类型的蚯蚓体腔液蛋白质电泳区带数目和相对迁移率存在很大的差异。形成体腔液蛋白质组分的差异性可能与蚯蚓生态适应性有关。     

刺槐根系可溶性蛋白SDS-PAGE分离方法的改进

在利用常规SDS-PAGE方法分离刺槐根系可溶性蛋白的过程中,将样品处理液中的SDS、β-巯基乙醇、丙三醇的含量均增加50%。这样改进后的方法得到了分离效果明显较常规方法好的电泳图谱。经分析得出:常规SDS-PAGE方法中样品处理液的SDS和β-巯基乙醇浓度不足以充分溶解刺槐根系中的可溶性蛋白,丙三醇的浓度也不足以将样品很好地沉聚于点样槽底部。该试验为植物组织可溶性蛋白的SDS-PAGE分离提供了一套效果较好的参考方法。     

绵羊卵泡液高丰度白蛋白去除方法的比较

比较了2种试剂盒去除绵羊卵泡液中高丰度白蛋白的效果。结果表明:Pierce~(TM) Albumin Depletion Kit去除高丰度白蛋白的效率高,但特异性不好;ProteoExtract~ Albumin/IgG Removal Kit对高丰度白蛋白的去除效率不如前者,且不能有效去除绵羊的Ig G,但其去除ALB的特异性要好于前者;经两种试剂盒处理样品的2-DE电泳分离图谱显示白蛋白区域显色程度和面积均比绵羊卵泡液原液样品的小,但Pierce~(TM)试剂盒对大分子低丰度蛋白质的回收效率低,而ProteoExtract~对小分子低丰度蛋白质的回收率低;经Pierce~(TM)试剂盒处理后样品的蛋白质图谱中可检出点的数量更多。     

绵羊卵泡液高丰度白蛋白去除方法的比较

比较了2种试剂盒去除绵羊卵泡液中高丰度白蛋白的效果。结果表明:Pierce^(TM) Albumin Depletion Kit去除高丰度白蛋白的效率高,但特异性不好;ProteoExtract(TM) Albumin Depletion Kit去除高丰度白蛋白的效率高,但特异性不好;ProteoExtract^ Albumin/IgG Removal Kit对高丰度白蛋白的去除效率不如前者,且不能有效去除绵羊的Ig G,但其去除ALB的特异性要好于前者;经两种试剂盒处理样品的2-DE电泳分离图谱显示白蛋白区域显色程度和面积均比绵羊卵泡液原液样品的小,但Pierce Albumin/IgG Removal Kit对高丰度白蛋白的去除效率不如前者,且不能有效去除绵羊的Ig G,但其去除ALB的特异性要好于前者;经两种试剂盒处理样品的2-DE电泳分离图谱显示白蛋白区域显色程度和面积均比绵羊卵泡液原液样品的小,但Pierce^(TM)试剂盒对大分子低丰度蛋白质的回收效率低,而ProteoExtract(TM)试剂盒对大分子低丰度蛋白质的回收效率低,而ProteoExtract^对小分子低丰度蛋白质的回收率低;经Pierce对小分子低丰度蛋白质的回收率低;经Pierce^(TM)试剂盒处理后样品的蛋白质图谱中可检出点的数量更多。     

PEG分级法检测绿竹叶片双向电泳中的低丰度蛋白

蛋白质组学研究的关键问题之一是双向电泳(2-DE)中低丰度蛋白的分析,主要是因为相关高丰度蛋白的存在,导致IPG胶条无法吸胀低丰度蛋白,使得低丰度蛋白在2-DE中很难被检测出来。利用梯度浓度的PEG4000沉淀方法来富集绿竹叶片中不同丰度的蛋白质,从而使得低丰度蛋白在凝胶中显现出来。在PEG分级法和传统的全蛋白提取法的2-DE比较中,发现采用PEG分级沉淀法提取的蛋白质的数量以及类别明显增加,高丰度蛋白主要富集在8%和16%的PEG浓度组分中,使得其他组分中的低丰度蛋白与高丰度蛋白组分分别进行2-DE分析。经过对图像和数据的比较、分析,PEG分级法得到的5个组分蛋白点总数超过了1032个,大约是传统蛋白提取方法制备蛋白样品的3倍。     

仿刺参不同组织液的抗菌活性

采用平板菌落计数法测定仿刺参Apostichopus japonicus体腔液、体腔液上清液、体腔细胞悬液和体壁内皮组织匀浆液对哈氏弧菌Vibrio harveyi的抑制作用,并对健康仿刺参与感染后仿刺参的体壁内皮组织匀浆液的抑菌作用进行了比较;采用乙醇沉淀、离心等方法从仿刺参体壁内皮组织中粗提得到一种水溶性成分,测定了该成分对哈氏弧菌、白色葡萄球菌Staphylococcus albus和迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda的抑菌活性,并初步研究了该成分的基本性质。结果表明：仿刺参体壁内皮组织匀浆液对哈氏弧菌的抑制效果显著,体腔液、体腔液上清液、体腔细胞悬液对哈氏弧菌的抑制效果不显著;感染状态下,仿刺参体壁内皮组织匀浆液的抑菌作用与健康状态相比有所降低。提取的水溶性成分对哈氏弧菌、白色葡萄球菌和迟钝爱德华氏菌均有明显的抑制作用;该成分的茚三酮反应呈阳性,其中蛋白质的质量分数为17.48%;该成分经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到5个蛋白条带,相对分子质量大约为55 300、46 100、34 700、19 500和14 500,初步认为其含有肽类抗菌活性物质。     

适于双向电泳分析的番茄叶片总蛋白提取方法的优化

比较了三氯乙酸(TCA)、酚和十二烷基硫酸钠(SDS)3种提取方法在所获番茄叶片总蛋白产量及其在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率等方面的区别,并对3种蛋白溶解液以及超声处理在蛋白质溶解中的作用进行了分析探讨。结果表明,TCA提取法最佳,该方法提取番茄叶片总蛋白的得率最高、所获蛋白在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中形成条带数目最多,最清晰;酚法次之;SDS法最差。由离液剂和去污剂组成的蛋白溶解液复溶蛋白沉淀所获蛋白产量显著高于Tris-NaCl溶解液。还原剂和两性电解质以及超声处理显著增进蛋白质的溶解,提高蛋白产量。采用TCA提取法获得蛋白沉淀,再以溶解液Ⅱ(7 mol/L尿素,2 mol/L硫尿,2%CHAPS,2%SB3-10,65 mmol/L DTT,0.2%两性电解质)溶解,结合超声助溶的方法体系可以获得高得率和高电泳分辨率的番茄叶片总蛋白样品,该方法适用于双向电泳分析等下游操作。     

肽文库富集荷斯坦奶牛血浆和血清中低丰度蛋白的效果研究

【目的】获取牛血浆和血清蛋白质组中低丰度蛋白的表达信息。【方法】采用肽文库试剂盒ProteoMiner富集荷斯坦奶牛的血浆和血清,运用二维凝胶电泳结合液相色谱串联质谱方法,分析富集前后血浆和血清中蛋白的变化。【结果】牛血浆和血清经ProteoMiner试剂盒富集,白蛋白含量显著下调(血浆和血清的差异显著水平分别为P=0.02和P=0.01),载脂蛋白E显著增加(血浆和血清的差异显著水平分别为P=0.02和P=0.01)。【结论】该法在降低牛血浆和血清中高丰度蛋白的同时有效富集了低丰度蛋白,有利于血浆和血清中低丰度蛋白质组的研究。     

大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒（WDSV）辅助基因orfA和orfC多抗的制备及初步应用

【目的】制备大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA和orfC的多克隆抗体,并用其检测酵母和肿瘤细胞中目的蛋白的表达。【方法】以WDSV基因组序列为模板,PCR扩增WDSV orfA和orfC基因,分别构建其原核表达载体,转化Rosseta（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白后,采用皮下多点注射结合耳静脉加强免疫的方法免疫新西兰白兔,制备抗orfA和抗orfC的多克隆抗体,用Western blot法检测抗体的特异性。用制备的多克隆抗体检测orfA和orfC融合蛋白在酵母和HeLa299、SPC-A-1肿瘤细胞中的表达。【结果】PCR扩增获得了WDSV orfA和orfC基因。成功构建了orfA和orfC基因的原核表达载体并进行了诱导表达,orfA和orfC重组融合蛋白以包涵体形式存在;采用皮下注射结合耳静脉加强免疫有效地提高了抗体效价,成功制备得到了兔抗orfA和兔抗orfC血清,抗体效价达1∶8 000～1∶10 000;通过Western blot法,利用上述抗血清分别检测到了原核表达的目的蛋白及酵母和肿瘤细胞中表达的目的蛋白。【结论】制备得到的抗orfA和抗orfC多克隆抗体具有很好的特异性,能够用于原核表达、酵母和肿瘤细胞中表达的目的蛋白的Western blot检测。     

双荧光噬菌体蛋白芯片检测系统的研究

对双荧光噬菌体蛋白芯片技术的检测性能进行验证,旨在获得一种新的、灵敏度高的蛋白质检测手段。将提纯后的展示GAGE7蛋白(肺癌肿瘤标志物)的T7噬菌体蛋白点到芯片上,将1份肺癌病人血清稀释到1∶100,1∶500,1∶2000,1∶5000,1∶10000,1∶50000,分别用6张相同的蛋白芯片进行筛查,用激光共聚焦扫描仪检测芯片上的荧光信号,分析Cy5/Cy3信号强度和血清稀释度的相关性。同时应用ci-ELISA技术在相同试验条件下进行对比试验。结果表明,Cy5/Cy3信号均与血清稀释度呈良好线性关系,与ELISA法所得结果相符,并且在微量检测能力上要优于ELISA技术。因此,双荧光噬菌体蛋白芯片技术可以对生物样品中某微量蛋白的含量进行准确检测,具有高通量、微型化的特点,是检测生物样品中蛋白质的理想工具。     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白对棉铃虫活性分析

利用已克隆的5种Bt Cry基因Cry2Ab4、Cry1Ia8、Cry1Ie1、Cry1Ca7、Cry1Cb2和1种野生菌株HD-73(Cry1Ac)表达的6种Bt Cry杀虫晶体蛋白,对棉铃虫进行生物活性分析,并将Cry1Ac杀虫晶体蛋白分别与其它5种Cry蛋白按1:1的比例组合,对棉铃虫进行生物活性测定。结果表明,单独使用Cry1Ac时对棉铃虫活性最高,LC50为3.16μg·mL-1,其次为Cry2Ab4。Cry1Ac与Cry2Ab4组合对棉铃虫也有较高的活性,LC50为48.70μg·mL-1,该组合对棉铃虫的共毒系数为1.21,有相加作用。Cry1Ac与这5种蛋白的组合对棉铃虫都有较高的毒力。     

小麦高分子量谷蛋白亚基与加工品质研究综述

麦谷蛋白是小麦贮藏蛋白的重要组成部分,赋予制作面包的面团独特的粘-弹特性。而高分子量麦谷蛋白亚基与加工品质密切相关。笔者综述了HMWGS的分离方法、分子结构、基因定位、命名、研究现状与加工品质的关系及在品质育种中的应用。研究结果表明:某些HMWGS的出现(5+10亚基)与小麦品种的加工品质和食品制作特性有关,品种具有的HMWGS谱带越多,品质越好。最后提出了目前该研究中存在的问题及其未来研究的方向。     

PAGE法鉴定西瓜杂交种研究初报

本研究利用种子蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）等多种电泳技术对供试西瓜杂交种及其亲本种子进行了鉴定，结果表明干种子蛋白质ＰＡＧＥ法在分离胶Ｔ＝１４％，Ｃ＝０．３５％，ｐＨ５．８；浓缩胶Ｔ＝４．０％，Ｃ＝０．３３％，ｐＨ等于５条件下可将供试西瓜杂交种与其亲本种子明显区分开，因此，这种方法可以作为该组合种子真实性鉴定的手段，作为纯度鉴定方法还需进一步研究。     

大豆蛋白水解物的精制研究

碱性蛋白酶催化大豆蛋白水解以后，对所分离出的蛋白水解物进行脱臭、脱盐处理。结果表明，使用０．４％（ｗ／ｖ）的活性炭处理即可得到满意的结果，氮的回收率可达９５％以上；在用阴阳离子交换树脂对水解物脱盐时，脱盐率达８６％以上，并且氮的回收率不低于９４％。     

利用转基因番茄表达血管内皮生长因子的研究

【目的】应用基因工程技术,获得表达血管内皮生长因子（VEGF）的转基因番茄植株,为以番茄作为生物反应器生产药用蛋白奠定基础。【方法】利用植物偏好的密码子改造合成VEGF基因全长,构建植物表达载体p1390RVEGF,通过农杆菌菌株EHA105介导将其T-DNA区转入到番茄细胞中,再生后获得转基因番茄植株,对其进行分子和蛋白水平检测。【结果】成功构建了植物整株表达载体p1390R-VEGF,建立了高频的番茄再生培养体系;PCR检测、Southern blot和Western blot检测结果表明,VEGF基因已经转入番茄中,并成功得到了表达。【结论】得到了转基因番茄植株和果实,且VEGF蛋白有良好的抗原性。     

向日葵食用蛋白的提取和SDS-PAGE电泳技术研究

以向日葵种子为材料,采用SDS-PAGE电泳技术,以不同电泳条件对23种向日葵食用蛋白进行电泳谱带分析试验,研究不同电泳条件下向日葵食用蛋白的谱带变化,以选择出最佳的电泳条件。结果显示,最佳试验条件为:按照质量与体积比1∶3的比例用去离子水在4℃条件下30min提取水溶性蛋白。电泳时,在4℃条件下进行,凝胶板厚度1mm,分离胶浓度8%,浓缩胶浓度5%,电压300V,加样量控制在10μL。     

野生茄子托鲁巴姆StLTPa7的克隆与分析

【目的】从野生茄子托鲁巴姆（Solanum torvum Swartz）中克隆非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa7 cDNA,并解析其功能。【方法】采用同源基因设计引物,并根据RT-PCR方法克隆StLTPa7 cDNA序列;通过农杆菌浸染法转化烟草,构建StLTPa7过表达转基因烟草植株;采用菌丝生长速率法检测转基因烟草植株蛋白提取物对大丽轮枝菌的体外抑菌活性。【结果】托鲁巴姆中克隆获得1个StLTPa7 cDNA序列,该序列含有1个345 bp的开放阅读框,推测编码长114个氨基酸的蛋白,相对分子量为11.42 kD,理论等电点为9.01。StLTPa7受水杨酸（SA）和大丽轮枝菌诱导表达,在处理后24和48 h的表达量较高。为了分析StLTPa7对大丽轮枝菌的抗性,构建了过表达转基因烟草植株,共获得了4个PCR阳性转StLTPa7烟草株系。荧光定量PCR分析显示,该基因在转基因烟草株系L5和L7中过量表达。抑菌试验显示,转基因烟草株系L5蛋白提取物对大丽轮枝菌的抑菌率约为对照的2.5倍。【结论】从野生茄子托鲁巴姆中克隆到1个StLTPa7 cDNA序列,该基因与大丽轮枝菌的生长和增殖的抑制作用相关,可能参与植物对大丽轮枝菌的防卫过程。     

利用酵母双杂交系统筛选介体异沙叶蝉中与小麦矮缩病毒外壳蛋白互作的蛋白质

【目的】利用分离泛素酵母双杂交膜系统（split-ubiquitin yeast membrane system）,以小麦矮缩病毒（Wheat dwarf virus,WDV）的外壳蛋白（CP）基因为诱饵对异沙叶蝉（Psammotettix alienus L.）cDNA文库进行筛选,研究异沙叶蝉传播WDV的分子机制。【方法】以笔者实验室饲养的异沙叶蝉为材料,提取其总RNA后取100 ng进行纯化,利用SMART法反转录合成ds cDNA,经过Sfi I酶切纯化,连接到pPR3-N文库载体上,构建得到以pPR3-N为载体的异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库。同时,构建带有Sfi I酶切位点的诱饵载体pDHB1-WDV CP,经功能检测后用诱饵载体初步筛选pPR3-N空文库,寻找适合筛库的条件和确定His基因产物抑制剂3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）的使用浓度。然后用诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库,对筛选结果进行分析,再通过共转验证和β-半乳糖苷酶检测进一步验证是否发生互作。利用Uniprot和KEGG在线网站,对筛到的蛋白进行gene ontology（GO）注释和Pathway分析。【结果】初级文库库容量超过2.0×10⁶ cfu,文库实际扩增数量大于1.3×10⁶ cfu,文库重组率大于97%,扩增文库插入片段平均长度大于1 000 bp,表明异沙叶蝉cDNA文库的质量较高。酶切验证显示诱饵载体pDHB1-WDV-CP中CP的插入完整而准确。功能检测表明融合蛋白能够正确表达。在3-AT浓度为5 mmol?L^-1的筛选条件下,诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库得到280个克隆,经测序和Blast比对分析最终得到12个可能与WDV的CP发生互作的异沙叶蝉蛋白质。将这12个蛋白质再次进行共转验证和β-半乳糖苷酶检测,最终得到9个蛋白质与WDV CP互作。GO注释显示,9个蛋白参与的生物过程包括蛋白去磷酸化、碳水化合物代谢过程、先天性免疫应答、模式识别受体的信号通路、运输、同向运输和乙醇氧化等;分子功能包括金属离子结合活性、蛋白磷酸酶活性、信号模式识别受体的活性、水解酶活性、磷酸离子载体活性和叶酸运输活性等。参考KEGG数据库,这些蛋白参与的代谢途径有泛素介导的蛋白水解途径、内吞作用、花生四烯酸代谢途径、cAMP信号通路和模式识别受体的信号通路等。【结论】异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库的成功构建与筛选,为研究异沙叶蝉与小麦矮缩病毒的互作机制研究奠定了基础。