rd29A启动子的克隆及提高烟草抗逆性的研究

根据GenBank上公布的rd29A基因序列(D13044),利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA中扩增得到了rd29A基因的启动子片段.序列分析表明,该片段与D13044有99%的同源性,它包括了DRE等4种完整的顺式作用元件.与GUS基因融合构建双元植物表达载体pBI-rd.转基因烟草的GUS活性组织染色分析及Northern杂交分析均表明,3种胁迫处理均可诱导GUS基因大量表达.其中,15%PEG和0.5%NaCl胁迫处理的转基因烟草比0℃低温处理的转基因烟草的GUS表达量高,而未经胁迫处理的转基因烟草的GUS基因只有少量表达.这些结果表明,rd29A属胁迫诱导型启动子,当植物遭受逆境胁迫时,rd29A启动子可以驱动下游目的基因超量表达,这就为通过基因工程途径提高植物抗逆性奠定了基础.     

受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,克隆Gh WRKY64(KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列,并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,该区域含18个组织器官表达及诱导表达关键元件,分别为6个ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件,4个CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个OSE2ROOTNODULE病菌诱导元件、2个GTIGMSCAM4盐调控元件和2个W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与GUS基因融合,构建p BIW64:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化法获得12个转基因烟草株系。选择GUS表达量最高的p BIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。GUS组织化学染色显示,苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有GUS活性,开花期在转基因烟草植株根、叶及叶柄均检测到GUS活性,特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深,在茎和花组织上未检测到GUS活性。对该转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理,诱导48 h后,转基因烟草幼苗根和叶片的GUS染色比未诱导处理的对照明显加深。结果表明,Gh WRKY64上游1064 bp长度的DNA序列,具有启动子的相关顺式作用元件,且为病原菌诱导型启动子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。     

大豆CHI1基因启动子的克隆及功能初探

为了解大豆ClassⅠ几丁酶基因(Chitinase gene)对不同胁迫响应的分子机制。利用PCR技术克隆了大豆ClassⅠChitinase基因的启动子片段(Gm CHI1p),序列分析表明,扩增片段(1 641 bp)与Gen Bank中的已知序列同源性达99.8%,且含有多个胁迫响应调控元件。利用GUS基因上游无启动子的表达载体p CAMBIA1391Z,构建GmCHI1p与GUS基因融合的植物表达载体pCAM-Gm CHI1p,并通过农杆菌介导法导入烟草中。在转基因烟草愈伤组织中检测到GUS活性,表明该启动子具有启动活性。对转基因烟草中的GUS活性进行初步定性分析,结果表明,GmCHI1p可驱动GUS基因在转基因烟草的根部特异性表达,而且在伤害处理的叶片中检测到GUS的强烈表达,表现出明显的根组织特异性及伤害诱导性。这种伤害诱导仅在伤害组织部位及其附近高效表达而没有被长距离传递,预计该启动子在转基因抗虫分子育种中具有巨大的应用前景。     

葡萄逆境胁迫诱导启动子的克隆及表达分析

为了研究葡萄抗逆基因(CAN70200.1)的表达特性,采用PCR技术从葡萄中克隆了CAN70200.1基因上游一段长度为1 354 bp的启动子片段,命名为PCAN。采用Plant CARE和PLACE启动子在线预测工具分析表明,PCAN启动子序列具有CAAT-box、TATA-box基本的顺式作用元件和一些参与非生物胁迫、光和植物激素应答相关的顺式作用元件。为验证启动子的表达特性,将PCAN启动子连接到p CAMBIA1391Z载体GUS基因的上游,构建成植物表达载体p1391Z-CAN,并通过农杆菌介导法转化烟草,经PCR鉴定,获得转基因植株。对转基因烟草植株进行逆境胁迫处理发现,在干旱处理120 min后,PCAN启动子活性达到最强;而4℃低温处理30~60 min时,PCAN启动子活性达到最强,表明PCAN启动子具有低温和干旱胁迫诱导表达特性。     

甘薯块根储藏蛋白(Sporamin)启动子克隆及功能验证

提取甘薯“川薯34”总DNA,设计引物,通过高保真PCR扩增获得了长为1 144bp的甘薯储藏蛋白(Sporamin)基因启动子SpoA-p.PLACE在线分析表明:Sporamin启动子具有基本的启动子元件CAAT-box,并包含大量与储藏蛋白表达相关、抗逆相关及蔗糖表达相关的功能组件.构建植物表达载体pBI-SpoA-p::GUS、农杆菌工程菌株EHA105:pBI-SpoA-p::GUS后导入烟草及甘薯,分别得到15株烟草和10株甘薯的阳性转基因植株,GUS染色分析表明烟草各部位中只在根中有基因表达,甘薯根、茎和叶各部位未检测到活性.5％蔗糖诱导处理24 h后,在烟草根、茎及叶均观察到GUS活性;在甘薯中只有根有GUS活性.因此,可以看出此启动子为甘薯根部特异的表达启动子,并受蔗糖诱导而表达.     

大豆sbp基因表达方式分析及其启动子调控活性研究

研究大豆蔗糖结合蛋白基因(sbp)的表达方式及其启动子的调控活性,为揭示sbp基因表达本质及其启动子功能研究、利用提供理论依据。利用qRT-PCR方法,检测sbp基因在不同逆境胁迫条件下及不同组织中的表达方式;利用PCR方法,克隆sbp基因5'端上游序列并对其进行预测分析;在转基因烟草中,研究sbp基因启动子在干旱胁迫条件下及不同组织中的调控活性。sbp基因受干旱诱导上调,而在盐、低温、ABA诱导下表达下降。sbp基因在大豆根、茎、叶、花中的相对表达量低,而在种子中的相对表达量高。克隆获得sbp基因5'端上游942 bp序列,命名为SP,预测分析表明,SP序列中含有多种典型的种子特异表达元件及与激素、逆境诱导相关的元件。组织化学分析表明,在转基因烟草中,SP启动子驱动gus基因在干旱胁迫下及种子中高表达。推测SP启动子兼具干旱诱导表达活性和种子特异表达特性。     

水稻稻瘟病菌诱导表达启动子OsQ16p的克隆与功能分析

qRT-PCR分析表明,日本晴OsQ16基因受稻瘟病菌诱导表达。利用PCR技术从日本晴基因组中克隆了该基因编码区5′端上游1 229 bp的启动子序列,命名为OsQ16p。用其取代pBI121中gus基因上游的CaMV35S启动子,构建重组表达载体pBIQ16p,经农杆菌介导转化日本晴,获得转基因植株。GUS组织化学染色和qRT-PCR分析表明: (1) gus基因在抗性愈伤组织和阳性转基因植株中均能表达; (2)转基因植株在接种稻瘟病菌后12 h,GUS表达量是处理前的2.7倍; (3)抗病相关信号分子水杨酸(salicylic acid,SA)和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)喷施转基因植株叶面后12 h,GUS表达量分别为处理前的3.1倍和3.5倍。以上结果表明,OsQ16p启动子具有启动活性,并明显受稻瘟病菌、MeJA和SA诱导表达。     

拟南芥热激启动子AtHSP70b的克隆与功能分析

从拟南芥Columbia生态型(Arabidopsis thaliana)的基因组DNA中扩增出热激启动子AtHSP70b基因,并检测其热激表达的严谨性。将热激启动子AtHSP70b插入到pSAU2008的gus基因及NOS终止子上游,构成热激启动子控制GUS报告基因的表达盒“AtHSP70b-GUS-Tnos”,并将其插入到pVCT2020中得到表达载体pV-HSP70bGUS。通过冻融法将其导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404,并转化烟草(W38)获得再生植株,通过PCR检测鉴定,表明“AtHSP70b-GUS-Tnos”表达盒已整合到烟草基因组中。并转化烟草检测启动子的表达活性。序列分析表明,克隆的启动子长度204bp与目前已经发表的启动子序列完全一致。GUS组织化学法检测证明启动子AtHSP70b在烟草中具有高温诱导表达的能力。但在常温下也有不同程度的表达,因此需要对该启动子进行序列改造以增强其热激表达的严谨性。     

GmCYP78A5基因启动子的克隆及表达分析

利用PCR技术从大豆(Glycine max L.Merrill)中分离了细胞色素P450基因(cytochrome P450,CYP-78A5)的启动子,序列分析结果表明,扩增片段大小为1 650 bp,与已报道序列的相应区域同源性达99.21%。RT-PCR结果表明,CYP78A5基因在大豆不同组织中的表达存在差异,在未成熟种子中表达水平较高,在茎(上胚轴与下胚轴)中有微弱表达,而在根、叶、花组织中不表达。将该启动子片段与GUS报告基因融合在一起,构建了植物表达载体,并用农杆菌介导法导入了烟草(Nicotiana tabacum)中。对转基因烟草植株中的GUS表达分析表明,Gm CYP78A5启动子可驱动GUS报告基因在转基因烟草的幼苗根上部组织、花器官的花萼和花柄组织及种子中高效表达,而在其他部位均未检测GUS活性。     

中棉(Gossypium arboreum)光锈导基因Gacab启动子在转基因烟草中的功能缺失分析

分离了金华中棉(Gossypiun arboreum var. jinhua)光诱导基因cab 5'上游的调控序列1 009 bp,并对其功能进行了分析,证明获得的这一DNA片段具有驱动光诱导表达的功能。为了进一步分离具有最大转录活性的最小光诱导启动子,根据光诱导表达调控元件所在的位置,构建了Gacab P和197 bp、504 bp、779 bp的5'端缺失体,并将这些缺失体分别与gus (uid A)基因融合,构建植物表达载体。用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因烟草。GUS组织化学分析表明,转基因烟草的T1代种子在光下培养时,只有Gacab P驱动gus基因在转基因烟草的叶片表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达;当转基因烟草的T1代种子在暗中萌发及培养时,Gacab P驱动gus基因在转基因烟草中无表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达。GUS定量分析表明,–504 ~ –1 bp的启动子缺失体启动活性最高,比CaMV35S启动子高0.6倍。上述结果表明只有全长的Gacab启动子具有光诱导和绿色组织特异表达特性,且–504 ~ –1 bp的启动子缺失体启动活性最高。     

拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶启动子在转基因烟草中的表达特性分析

通过对报告基因GUS产物的分析进行了拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶（MPBQ MT）启动子在转基因烟草中的表达特性的初步研究。构建含该启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化烟草,对转基因烟草进行GUS组织化学染色和GUS荧光定量分析该启动子表达特性。GUS在转基因烟草的根和种子中基本不表达,茎上有一定表达,叶上表达量最高,约是茎的4.7~10.9倍。结果表明MPBQ MT基因启动子主要在烟草绿色组织中特异性高表达。     

中棉(Gossypium arboreum)光诱导基因Gacab启动子在转基因烟草中的功能缺失分析

分离了金华中棉(Gossypiun arboreum var.jinhua)光诱导基因cab 5'上游的调控序列1 009 bp,并对其功能进行了分析,证明获得的这一DNA片段具有驱动光诱导表达的功能.为了进一步分离具有最大转录活性的最小光诱导启动子,根据光诱导表达调控元件所在的位置,构建了Gacab P和197 bp、504 bp、779 bp的5'端缺失体,并将这些缺失体分别与gus(uid A)基因融合,构建植物表达载体.用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因烟草.GUS组织化学分析表明,转基因烟草的T1代种子在光下培养时,只有Gacab P驱动gus基因在转基因烟草的叶片表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达;当转基因烟草的T1代种子在暗中萌发及培养时,GacabP驱动gus基因在转基因烟草中无表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达.GUS定量分析表明,-504～-1 bp的启动子缺失体启动活性最高,比CaMV35S启动子高0.6倍.上述结果表明只有全长的Gacab启动子具有光诱导和绿色组织特异表达特性,且-504～-1 bp的启动子缺失体启动活性最高.     

甘蔗ScHAK11基因启动子的克隆与初步分析

钾转运体ScHAK11基因是甘蔗钾转运体基因家族的重要成员。本研究以甘蔗为材料,通过染色体步移方法对ScHAK11上游启动子片段(pScHAK11)进行克隆,获得ScHAK11起始密码子ATG上游启动子序列,序列长度为2 018 bp。序列分析表明,该序列包含多个真核生物启动子核心元件TATA-box、CAAT-box以及与逆境胁迫、光响应、激素诱导、分生组织和叶肉栅栏组织表达等顺式作用元件,推测pScHAK11启动子受到多种激素和逆境胁迫诱导表达,并通过分生组织和叶肉栅栏组织等顺式调控元件参与对甘蔗组织发育的调控。将p ScHAK11启动子序列与包含GUS基因的载体pBI121连接进行活性分析,发现pScHAK11启动子片段能驱动GUS基因在烟草茎和根中瞬时表达。荧光定量PCR结果表明,ScHAK11主要在甘蔗叶片和根系表达,且其表达受发育时期的影响,该结果与pScHAK11启动子驱动的GUS基因在烟草中的表达结果不一致,结果表明p Sc HAK11启动子是组织特异型启动子。本研究结果有助于深入了解ScHAK11基因表达调控的分子机制,为研究ScHAK11基因的转录调控机制奠定基础。     

浮萍rbcS启动子组织特性研究

SSU5C启动子(全长1 438 bp)是从浮萍基因组中新克隆的一个rbc S(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit)启动子。本研究将SSU5C启动子与GUS基因融合,成功构建植物双元表达载p SSU5C-IGUS,并利用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因植株,探究SSU5C启动子在烟草中的组织表达特点。GUS检测结果表明:在T1烟草的营养器官中,SSU5C启动子主要驱动GUS基因在烟草叶片和叶柄、茎等绿色组织中表达,而在根部不表达;在生殖器官中,GUS基因主要在花冠裂片以及花药和柱头中表达。本研究首次发现浮萍rbc S启动子不仅在绿色组织中表达,而且在生殖器官中的花冠裂片以及花药和柱头中表达,这一发现可为SSU5C启动子在植物基因工程中的应用奠定基础。     

棉花CBF基因的克隆及其转基因烟草的抗寒性分析

从中棉12 (Gh12)、中棉36 (Gh36)和海岛棉7124 (Gb7124)品种中克隆并鉴定了棉花的CBF基因,该基因编码一个由184个氨基酸组成的蛋白CBF,该蛋白具有CBF转录因子典型的序列标签“PKRRAGRKKFQETRHP”和“FADSAW”。Southern杂交表明,CBF基因在3个棉花品种中均以基因家族的形式存在。围绕海岛棉7124的CBF基因(GbCBF1)开展的逆境表达谱分析表明,GbCBF1基因受低温、干旱、盐和ABA等多种逆境条件的诱导表达。将GbCBF1基因构建到由强启动子35S和弱启动子NOS这2种启动子控制的植物表达载体pCambia2301上并转化烟草NC89,经过筛选及PCR鉴定,共获得26株转基因烟草。对部分T₁代植株进行的PCR和RT-PCR检测表明,GbCBF1基因可以在烟草中正常转录并遗传。分析表明,在低温下,转基因烟草的电解质渗漏率普遍低于野生型烟草,而游离脯氨酸含量和可溶性糖含量均高于野生型烟草,说明转GbCBF1基因提高了烟草的耐寒性。     

陆地棉GhSAD2基因表达载体的构建、转化及抗寒性初步分析

为研究Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因的功能及其与植物抗寒性的相关性,以陆地棉GhSAD2基因(KX197920)为目的基因,构建植物表达载体pBI121-GhSAD2,将该表达载体通过电击法导入根癌农杆菌GV3101中,采用根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草。通过PCR和GUS活性染色鉴定外源GhSAD2基因是否导入并整合到烟草基因组上转录表达。将转pBI121-GhSAD2型和野生型烟草置于4℃下处理48 h后,检测其电解质渗漏率并观察其表型。研究结果证明目的基因GhSAD2已整合到烟草及棉花的基因组中,共获得转基因植株9株,转化率为75%。陆地棉GhSAD2基因能够显著增强非低温驯化植物烟草的抗寒性,从而提高植物细胞的低温防御能力,为进一步探究该基因的功能鉴定了基础。     

百子莲ApCathB启动子克隆及其对超低温保存的响应分析

组织蛋白酶B基因(ApCathB)是影响百子莲胚性愈伤组织超低温保存冻存率的关键基因,为探究ApCathB如何响应超低温保存复合逆境,利用染色体步移法扩增获得ApCathB的启动子序列,使用PlantCARE在线软件分析该启动子中含光、激素和非生物胁迫相关的顺式作用元件。将ProApCathB::GUS表达载体转化拟南芥,获得转基因植株,GUS组织化学染色表明ApCathB启动子在拟南芥幼苗时期和小花等部位活性较高,在成熟叶中较低。转基因拟南芥萌发60 h幼苗在超低温保存处理过程中,GUS基因和蛋白的表达量在脱水处理后显著提高,暗示ApCathB启动子受到脱水处理的诱导进而响应超低温保存复合逆境,这为进一步研究ApCathB在百子莲超低温保存中的功能及其相关调控机制提供了数据参考。     

烟草耐低温胁迫早花NtMYB15的克隆及功能分析

为研究哪些基因参与低温胁迫诱导烟草提前开花,本研究根据烟草芯片数据和PCR扩增获得烟草NtMYB15基因的全长846 bp CDS序列。蛋白序列比对结果显示该基因在进化过程中高度保守。将该基因322 bp的片段克隆至RNAi载体p Hellsgate12中,并通过叶盘法将该基因转入烟草K326中。对两个独立的转基因株系及非转基因植株进行低温胁迫处理,结果表明,与非转基因植株相比,RNAi转基因植株的开花时期被延迟。因此,本研究将为培育烟草耐早花品种提供有价值的研究信息。     

蓝莓VcMYB启动子克隆及其功能初步分析

为探究VcMYB启动子在转录过程中如何发挥调控作用,利用FPNI-PCR法从蓝莓中克隆到调控原花青素合成相关的转录因子VcMYB的768 bp启动子序列。用PLACE和Plant CARE在线启动子预测工具分析了该启动子,结果表明其序列中存在启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box,还包含一系列的响应元件,如光响应元件、低温响应元件、防御与胁迫响应元件和茉莉酸甲酯响应元件等。为进一步分析该启动子的功能,构建了该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体VcMYBpro::GUS,并用农杆菌转化拟南芥。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色分析,结果表明该VcMYB启动子能驱动GUS基因在转基因拟南芥中表达,并且经脱落酸(ABA)、4℃低温、LED光照和持续光照处理后,转基因拟南芥中GUS的表达活性增强,推测该基因受ABA、低温和光的调控。     

玉米ZmPR4启子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析

以玉米B73基因组DNA为模板, 通过特异PCR扩增, 克隆出玉米启动子ZmPR4序列。序列分析表明, 该启动子与AJ969166序列同源性为100%。构建了ZmPR4或玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子控制的报告基因GUS的表达载体。通过基因枪介导法转化小麦幼胚愈伤组织。瞬间表达实验表明, 在小麦幼胚愈伤组织中, 玉米ZmPR4启动子的本底表达活性明显比Ubi启动子的低, 但经纹枯病菌诱导后, ZmPR4 启动子控制的GUS基因的表达明显增强。PCR检测结果证实ZmPR4 启动子在小麦愈伤组织中具有表达活性, 能够驱动GUS基因的表达。因此, 玉米ZmPR4启动子在小麦抗病基因工程育种中具有潜在的应用价值。