人肝癌细胞株QGY-7701蛋白质组学研究技术及二维电泳图谱的建立

目的:建立人肝癌细胞株QGY-7701蛋白质组学研究技术.方法:利用两种不同的裂解液提取细胞蛋白,进行双向电泳,经PDQuest软件分析与比较后,挑选匹配良好的10个蛋白点,进行基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的鉴定.结果:建立了稳定的人肝癌细胞株QGY-7701的双向电泳图谱,裂解液Ⅱ比裂解液Ⅰ提取的蛋白质量多25%,2-DE胶上蛋白点数多32%,从10个候选蛋白中鉴定出9个有意义的蛋白(P＜0.05).结论:初步建立了人肝癌细胞株QGY-7701的蛋白质组学研究技术,为进一步开展药物蛋白质组学研究奠定基础.     

塞来昔布诱导人肝癌细胞株QGY-7701凋亡的研究

目的探讨塞来昔布体外诱导人肝癌细胞株QGY-7701凋亡的作用。方法设立空白对照组(培养液中不加任何药物)及塞来昔布5、25、50、100、150μmol.L-1 5个剂量组,作用时间分为24、48、72 h,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察塞来昔布不同浓度和作用时间对QGY-7701细胞生存率的影响,选择合适的作用时间和3个剂量再做其他凋亡方法的检测;采用Hoechst 33258染色荧光显微镜观察凋亡细胞的形态学变化;采用双荧光染色(AnnexinV-EGFP/PI)流式细胞检测、末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记(TUNEL)检测、DNA含量分析(检测细胞周期)等方法多指标检测细胞凋亡率。结果通过Hoechst 33258染色可以从细胞形态上看出塞来昔布诱导QGY-7701细胞凋亡,而Annexin V-EGFP/PI流式细胞检测、TUNEL检测、细胞周期及MTT检测结果显示随着塞来昔布浓度升高和作用时间延长,凋亡率升高(P<0.05,P<0.01)。结论塞来昔布有诱导肝癌细胞QGY-7701凋亡,抑制其生长的作用,具有治疗肝癌的潜在功能。     

Cyr61与β-catenin在肝癌组织和细胞株中表达的相关性研究

目的 研究Cyr61与β-catenin在肝细胞肝癌和肝癌细胞株中的表达及其相关性,探讨二者在肝癌发生中的作用.方法 采用免疫组化法检测32例肝细胞肝癌患者肝癌组织中Cyr61与β-catenin蛋白的表达水平;免疫组化法和RT-PCR检测正常肝细胞株L02和肝癌细胞株HepG2、QGY-7701、H22中Cyr61与β-catenin蛋白与mRNA的表达水平;并比较二者的相关性.结果 65.63%(21/32)肝癌标本Cyr61蛋白阳性表达,71.88%(23/32)肝癌标本β-catenin蛋白阳性表达,二者合并阳性表达有56.25%(18/32),合并阴性表达有18.75%(6/32),Cyt61表达与β-catenin表达呈正相关(r=0.425,P<0.05);正常肝细胞株L02及肝癌细胞株HepG2、QGY-7701、H22中Cyr61与β-catenin mRNA与蛋白均有表达,二者表达一致性达100%.结论 Cyr61与β-catenin在肝癌和肝癌细胞株中高度一致阳性表达,提示Cyr61的表达可能与Bβ-eatenin的表达有关,二者可能在肝癌的发生中起到重要作用.     

肝癌细胞株HepG2蛋白双向电泳条件的优化

目的优化双向电泳条件,以获得高分辨率、重复性好的蛋白质双向电泳图谱。方法比较不同的细胞总蛋白质裂解液、不同的蛋白上样量、不同的等电聚焦电泳条件,选择最佳双向电泳条件。结果确定了适合肝癌细胞株HepG2的最佳细胞总蛋白质裂解液5、最佳蛋白上样量650μg和最佳等电聚焦电泳条件为最大电压34kV、30min。结论优化双向电泳方法获得的肝癌细胞株HepG2蛋白质双向电泳图谱高分辨率、重复性好。     

德氮吡格对人肝癌细胞株QGY-7701基因表达的影响

目的研究德氮吡格(TNBG)对人肝癌细胞株QGY-7701基因表达的影响,探讨其抗肿瘤作用的分子机制.方法采用基因芯片检测德氮吡格处理人肝癌细胞株QGY-7701前后mRNA的改变情况.结果基因芯片筛选出差异表达基因共1 200条,尤以脂代谢相关基因变化最显著:脂肪合成有关的10条基因表达上调,脂肪分解有关的3条基因和脂肪转移有关的1条基因表达下调.结论德氮吡格的抗肿瘤效应可能是通过干扰细胞的脂代谢来实现的.     

大鼠肾脏组织蛋白质组双向电泳分离体系的建立

目的:建立大鼠肾脏组织蛋白质组双向电泳分离体系。方法:提取大鼠肾脏组织的样品蛋白,按标准条件对蛋白质进行双向电泳分离,并对各个关键因素进行优化。结果:最终选择的裂解液配方是1%TBP,4%CHAPS,0.2%Bio-Lyte,40mmol/LTris,8mol/L尿素,2mol/L硫脲;使用pH 4～7的IPG胶条进行被动水化上样,等电聚焦采用缓慢升压模式,电泳参数根据Bio-Rad公司的预设方案进行调整;改良硝酸银法进行蛋白质斑点染色。从而获得了满意的蛋白质组双向电泳图谱。结论:成功建立具有较高分辨率和重复性的大鼠肾脏组织蛋白质组双向电泳分离体系,为后续实验研究提供有力的技术保障。     

人白细胞干扰素对人肝癌细胞株生长的抑制效应

干扰素(IFN)有抑制病毒和肿瘤细胞增殖的作用。本实验旨在探索IFN对组织培养下的人肝癌细胞株的抑制作用及其作用机制。材料与方法(一)材料①人白细胞干扰索(HLIFN):美国斯隆-凯特林癌中心M-Krin博士惠赠,比活性为§×10~6u/ml。②人肝癌细胞株及人食管癌细胞株:人肝癌QGY-7703株、BEL-7402株和肝癌的病人经手术切下的宿主肝细胞QSG-7701株;人食管癌Eca-109细胞株。③氢化考的松和消炎痛:均为国产制剂。在QGY-7703株的培养液里,一组仅加100u/mlHLIFN,另二组各再加氢化考的松2μg/ml     

人肝癌细胞株VEGF/VEGFR的检测及意义探讨

目的：筛选血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）高表达肝癌细胞株，为进一步研究VEGF在肝癌治疗中的作用提供理论依据。并探讨VEGF受体在肝癌细胞株的表达及意义。方法：ELISA法及Western blot法分别检测人肝癌细胞株培养上清及细胞内VEGF蛋白的表达。免疫细胞化学方法检测VEGFR在人肝癌细胞中的表达。结果：5株肝癌细胞株均见VEGF蛋白表达，其中SMMC-7721的VEGF表达量最高，VEGF特异性受体Fit-1在HepG2、HHCC、SMMC-7721、Bcl-7402见阳性表达，KDR在HepG2、HHCC、Bel-7402、QGY-7701见阳性表达。结论：肝癌细胞株中VEGF表达量不尽一致，VEGF在肝癌发生发展中可能存在自分泌作用方式。     

D-葡萄糖同系物作为人类肝癌细胞BEL-7402荧光探针的价值

目的 评价荧光D-葡萄糖同系物2-NBDG作为肝癌细胞BEL-7402荧光探针的价值.方法 肝癌细胞株BEL-7402培养24h后分为实验组及对照组,其中实验组加入5 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养基,对照组加入不合5 mmol/LD-葡萄糖的DMEM培养基,再将两组各分为两个亚组加入不同浓度的2-NBDG(0.3 mmol/L、1mmol/L),即共4组:0.3 mmol/L2-NBDG +5 mmol/L D-葡萄糖组、1 mmol/L 2-NBDG +5 mmol/L D-葡萄糖组、0.3 mmol/L 2-NBDG组、1mmol/L 2-NBDG组.比较各组细胞荧光强度,分析2-NBDG在肝癌细胞BEL-7402中的摄取及荧光成像情况,以及D-葡萄糖对2-NBDG的抑制竞争作用.结果 0.3 mmol/L 2-NBDG组的相对荧光强度为(78.72±3.78)％,低于1 mmol/L 2-NBDG组的(100.00±8.23)％(P＜0.05).0.3 mmol/L 2-NBDG +5 mmol/L D-葡萄糖组的相对荧光强度为(20.67±1.46)％,明显低于0.3 mmol/L 2-NBDG组的(78.72±3.78)％(P＜0.05).1 mmol/L 2-NBDG +5 mmol/L D-葡萄糖组的相对荧光强度为(22.23±2.01)％,明显低于1 mmol/L 2-NBDG组的(100.00±8.23)％(P＜0.05).结论 2-NBDG可被肝癌细胞BEL-7402快速摄取,并可通过荧光强度的方式量化其摄取程度,D-葡萄糖可竞争性抑制肝癌细胞BEL-7402对2-NBDG摄取.2-NBDG可以作为人源肝癌细胞株BEL-7402的检测荧光探针.     

杜氏盐藻高盐诱导蛋白的分离和鉴定

目的:对高盐和低盐培养条件下杜氏盐藻蛋白质组的双向电泳(2-DE)图谱进行比较分析,筛选高盐诱导蛋白并鉴定.方法:提取高盐(3.5 mol/L NaCl)和低盐(1.5 mol/L NaCl)培养条件下杜氏盐藻的总蛋白并进行2-DE,考马斯亮蓝染色后用Image-Scanner扫描仪扫描,ImageMaster 5.0...     

半枝莲抑制人肝癌QGY-7701细胞增殖研究

目的 探讨半枝莲抑制人肝癌QGY-7701细胞的初步机制。方法 MTT法检测半枝莲作用后QGY-7701细胞增殖的改变,光、电镜观察其形态变化,流式细胞仪检测其凋亡细胞比例、细胞周期的变化及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Fas表达。结果 半枝莲能抑制QGY-7701细胞的增殖,作用72h后,细胞呈现凋亡早期形态;凋亡细胞增多：G0／G1期细胞减少,G2／M期细胞增多;Bax表达增强,Bcl-2表达减少,Fas表达变化不明显。结论 半枝莲可抑制QGY-7701细胞增殖,可能与通过激活Bcl-2基因家族抑癌基因、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期有关。     

肿瘤相关抗原GCF2高水平表达的肝癌细胞株的筛选

目的 筛选出肿瘤相关抗原GCF2高表达的人肝癌细胞株,为进一步探讨GCF2对肝癌发生发展的可能作用奠定基础.方法 选择4种人肝癌细胞株(BEL-7404、HepG2、SMMC-7721和QGY-7703)及1种成人正常肝细胞株(HL-7702),培养后分别制作细胞爬片及提取蛋白后,采用免疫细胞染色技术和Western blot的方法筛选出GCF2表达量高的细胞株.结果 免疫细胞染色显示,GCF2在5种细胞中的胞核及胞质中均有表达.GCF2蛋白在肝癌细胞BEL-7404、HepG2、SMMC-7721和QGY-7703的表达要强于正常肝细胞HL-7702,其中以BEL-7404的表达量最高.通过Western blot检测,BEL-7404的GCF2相对表达量为0.875±0.134,较其他细胞株高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 BEL-7404细胞中GCF2蛋白水平的相对表达量最高,可以作为下一步探讨GCF2在肝癌发生发展的可能作用的实验材料.     

地西他滨联合三氧化二砷对肝癌SMMC-7721细胞株P15~(INK4B)及甲基化转移酶表达的影响

目的探讨地西他滨(DAC)和三氧化二砷(As_2O_3)对肝癌SMMC-7721细胞株P15~(INK4B)抑癌基因及甲基化转移酶表达的影响。方法 MTT方法检测地西他滨和三氧化二砷对SMMC-7721细胞株的抑制率。RT-PCR方法检测P15~(INK4B)、DNA甲基转移酶1(DNMT1)、DNMT3A、DNMT3B mRNA的表达。结果 2.0mmol/LDAC和2.0μmol/L As_2O_3联用,肝癌SMMC-7721细胞株细胞增殖抑制率均较4.0mmol/LDAC、4.0μmol/L As_2O_3单药组增强[(72h:(69.9±1.2)%比(33.8±0.7)%、(47.9±2.5)%,P0.05)]。地西他滨和As_2O_3作用细胞72h后P15~(INK4B)抑癌基因表达增强,联合组同4.0mmol/LDAC、4.0μmol/L As_2O_3单药组比较,差异有统计学意义[(0.74±0.14)比(0.57±0.15)、(0.56±0.11),P0.05];甲基化转移酶表达水平下调,联合组同4.0mmol/LDAC、4.0μmol/L As_2O_3单药组比较,差异有统计学意义[DNMT3A:(0.28±0.11)比(0.36±0.13)、(0.41±0.13),P0.05;DNMT3B:(0.32±0.13)比(0.39±0.12)、(0.45±0.16),P0.05;DNMT1:(0.31±0.15)比(0.44±0.19)、(0.44±0.12),P0.05]。结论地西他滨和三氧化二砷可能通过抑制肝癌SMMC-7721细胞株甲基化转移酶,增加P15~(INK4B)基因表达来抑制肝癌细胞增殖。     

HepG2细胞蛋白质组双向电泳条件的优化与图谱的建立

目的：优化双向电泳的样品处理方法,建立HepG2细胞蛋白质双向电泳图谱。方法：用含10%胎牛血清的RPM11640培养液培养HepG2细胞,胰酶消化后收集细胞,加入细胞裂解液使细胞充分裂解,冰浴超声离心后取上清液进行双向凝胶电泳,电泳图谱经考马斯亮蓝染色及图像扫描与分析。结果：通过对HepG2细胞蛋白提取液进行双向电泳,在13 cm pH 3~10（L）IPG胶条上可分离到（297±23）个重复性及分辨率均较好的蛋白质点,蛋白斑点的匹配率为83%。结论：HepG2细胞蛋白质组双向电泳条件的优化及图谱的建立,为进一步研究肝癌蛋白质组学奠定了基础。     

肝癌细胞铁蛋白磁共振成像的实验研究

目的 研究肝癌细胞中内源性铁蛋白的表达情况,并进一步分析铁蛋白的表达与磁共振成像（MRI）的信号关系如何。方法 对3种肝癌细胞株QGY-7703、HepG2、SK-Hep-1以及正常肝细胞L02,4种细胞株内源性铁蛋白表达情况进行检测,用RT-PCR方法 检测基因表达,Western blot检测细胞株中铁蛋白表达,同时测定细胞培养液上清中铁蛋白的分泌量。最后检测4种细胞磁共振信号的情况,分析细胞铁蛋白表达与磁共振信号的关系。结果 RT-PCR与Western Blot均显示铁蛋白的基因表达与蛋白表达,HepG2与QGY-7703表达最强,SK-Hep-1表达中等,L02表达很弱。4种细胞培养液上清中HepG2与QGY-7703分泌铁蛋白量较高,SK-Hep-1分泌较低,L02分泌量很低。磁共振细胞显像,T1WI、T2WI及PD均显示HepG2与QGY-7703磁共振信号强度低,而SK-Hep-1与L02信号强度较高。结论 各种肝癌细胞中铁蛋白表达水平不同,铁蛋白表达水平与磁共振细胞显像信号强度呈负相关。     

蛋白质组学技术对肝癌细胞株HepG2的G2/M期细胞的热激蛋白的鉴定

目的：采用蛋白质组学技术鉴定肝癌细胞株HepG2的G2／M期细胞内的热激蛋白。方法：提取肝癌细胞株HepG2的G2／M期细胞的蛋白质，采用双向电泳的方法分离蛋白质，应用图像扫描仪及质谱（MALDI—TOF—MS）分析鉴定HepG2的G2／M期细胞表达的蛋白质。结果：采用双向电泳技术分离，并用质谱成功鉴定出HepG2的G2／M期细胞的热激蛋白。结论：肝癌细胞株HepG2的G2／M期细胞内的热激蛋白的成功鉴定，为探讨HSP在细胞生长和增殖中的作用奠定了基础，并为临床上肿瘤的治疗提供参考依据。     

宫颈永生化细胞和癌细胞的胞质蛋白双向电泳图谱的建立及初步分析

目的:建立HPV-16阳性的宫颈上皮永生化细胞(H8细胞株)和宫颈癌细胞(CaSKi细胞株)胞质蛋白双向电泳图谱,并初步分析找出特征性的差异蛋白点.方法:分别培养H8和CaSki细胞,用亚细胞结构蛋白质提取试剂盒提取胞质蛋白进行双向电泳,用ImageMaster 2D V2002.1图像分析软件分析电泳图谱,筛选差异蛋白点.结果:获得了分辨率和重复性均较好的宫颈永生化细胞和癌细胞胞质蛋白2-DE图谱,并分析找出了显著的差异蛋白点8个,其中3种蛋白质在宫颈癌细胞株表达上调,1种蛋白质表达明显下调,2种蛋白质在宫颈癌细胞株表达缺失,2种蛋白质在永生化细胞株表达缺失.结论:应用亚细胞蛋白双向凝胶电泳技术对HPV-16阳性的宫颈癌前和癌变的胞质蛋白分析,能有效找出蛋白质表达差异点,为进一步确定宫颈癌前病变和癌细胞的关键性差异蛋白质的结构和功能奠定了基础.     

亲和毛细管电泳法测定茶碱人血清白蛋白的结合常数

目的:测定茶碱与人血清白蛋白的结合平衡常数.方法:亲和毛细管电泳法,以20 mmol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液(含氨基乙酸0.5 mol/L,EDTA 1 mmol/L)为运行缓冲液,茶碱作为运行缓冲液的添加剂,样品为含5%丙酮的30 μmol/L人血清白蛋白溶液,采用更加可靠的描述性指标--淌度比(M)估算了茶碱与人血清白蛋白的结合平衡常数,检测波长为214 nm.结果:测得的茶碱与人血清白蛋白的结合平衡常数与文献值基本吻合.结论:亲和毛细管电泳法可用于茶碱-蛋白结合常数的快速测定.     

BEL-7402肝癌细胞株的生长抑素受体放射分析

目的探讨生长抑素受体在肝癌细胞株中的表达. 方法用125I-[Tyr3]-octreotide作为生长抑素受体的放射性配体,检测肝癌细胞株BEL-7402上受体位点数和亲和常数.结果受体放射分析显示肝癌细胞株BEL-7402上的生长抑素受体与125I-[Tyr3]-octreotide的结合可以达到较满意的饱和曲线;表达的生长抑素受体位点数为1.0×105个/细胞,位点数多;与octreotide的平衡解离常数(Kd)为0.24×10-9 mol/L,亲和力强. 结论肝癌细胞株上有生长抑素受体表达,密度高,且与临床常用药octreotide有较好的亲和力.     

高糖环境对HSkMCs细胞株线粒体融合蛋白2表达及细胞凋亡的影响

目的:探讨高糖对人骨骼肌细胞株(HSkMCs)线粒体融合蛋白2(mfn2)表达及细胞凋亡的影响。方法:体外培养HSkMCs细胞株,将细胞分别以5.55 mmol/L,11.10 mmol/L,22.20 mmol/L葡糖糖培养48 h,检测mfn2mRNA表达及细胞凋亡情况。RT-PCR法测定基因表达,流式细胞技术检测细胞凋亡。结果:以5.55 mmol/L葡萄糖组培养48 h为基础对照,11.10 mmol/L组mfn2表达较对照组下降12.3%(P<0.05);22.20 mmol/L组mfn2表达较对照组降低47.3%(P<0.05);对照组细胞凋亡率为(1.80±0.57)%,11.10 mmol/L葡萄糖组细胞凋亡率为(13.23±1.47)%,22.20 mmol/L葡萄糖组细胞凋亡率为(24.03±3.05)%,均较对照组显著增加(P<0.05)。结论:高糖可诱导HSkMCs细胞mfn2 mRNA表达下调,增加其凋亡。