养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)3种致病弧菌的分子鉴定及其系统发育学分析

从患病养殖大黄鱼分离到3株病原菌H040823-1、H050704-1、H050815-1,经常规生理生化鉴定均属于弧菌属的种类,API20E快速鉴定菌株H040823-1为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyti-cus),菌株H050815-1为溶藻弧菌(V.alginolyticus),菌株H050704-1不在API20E鉴定谱内。为了进一步确定其分类地位,测定了3株病原菌的16S rRNA和HSP60(heat shock protein,HSP60)基因部分序列。16S RNA基因系统进化分析表明,3株病原菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌亲缘关系较近,相互之间同源性均大于96.9%,差异不明显。HSP60基因序列分析表明,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1的HSP60基因序列分别与V.parahaemolyticus(AF230951)、V.harveyi(EU036994)、V.alginolyticus(DQ664545)的同源性最高,分别为96.7%、99.8%和98.0%,而与其他弧菌HSP60基因的同源性均低于91.9%,3株病原菌相互之间同源性低于92.3%,差异显著。HSP60基因构建的系统进化树表明,H040823-1、H050704-1、H050815-1分别与V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.alginolyticus聚类。综合以上结果,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1可分别鉴定为副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌。结果表明,HSP60基因比16S rRNA基因更适合用于海水鱼类致病性弧菌种间的分类研究。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)病原鳗利斯顿氏菌的鉴定

采用表观分类学及分子生物学方法,对从大菱鲆细菌性败血感染症的病(死)鱼中分离到的相应病原菌,进行了形态特征、理化特性等较系统的鉴定及代表菌株DNA中G Cmol%的测定;同时,择代表菌株进行了16SrRNA基因的分子鉴定,测定了16SrRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性、构建了系统发生树。结果表明,所检30株菌均为利斯顿氏菌属(ListonellaMacDonellandColwell1986)的鳗利斯顿氏菌[L·anguillarum(Bergeman1909)MacDonellandColwell1986],择S010610-1株、S010610-3株及S010623-1株作为代表菌株进行的16SrRNA基因序列测定,不包括引物结合区,所扩增的16SrRNA基因序列长度,S010610-1株为1466bp(GenBank登录号:AY963630)、S010610-3株为1416bp(GenBank登录号:AY963631)、S010623-1株为1424bp(GenBank登录号:AY963632),与GenBank数据库中弧菌属细菌的同源性在97%—99%。     

从患病黑鲪分离病原菌HV0811的鉴定及其系统发育分析

从症状为溃疡瞎眼的养殖黑鲪(Sebastodes fuscescens)病灶处分离到3株优势菌HV0811、PT0811和JH0811,以肌肉注射人工感染实验证实菌株HV0811为致病菌,其对黑鲪的半致死浓度为7.15×10~5 CFU/尾。通过对致病菌的形态学观察、生理生化分析表明:菌株HV0811为革兰氏阴性菌,极生单鞭毛,短杆状,直径1～3mm,需Na+生长,低于4℃、高于42℃不生长。基于16SrRNA和HSP60基因序列构建的系统发育树表明:HV0811分别与哈维氏弧菌(AY750578和AY332571)相类聚,其中16SrRNA基因序列与哈维氏弧菌(AY750578)聚合置信度较低,仅有10%,不能有效地确定该种;HSP60基因序列与哈维氏弧菌(AY332571)聚合为一个分支的置信度达100%。综合该菌的形态、生理生化及HSP60基因序列比对结果,表明分离到的病原菌HV0811为哈维氏弧菌。药敏试验结果显示病原哈维氏弧菌(HV0811)对庆大霉素、新霉素、氟哌酸等较为敏感。     

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)病原霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的表型与分子鉴定

从江苏连云港某养殖场养殖死亡的泥鳅肝脏、血液及腹水中分离出大量优势生长的细菌,人工感染试验证明其对泥鳅具有很强的致病性。采用表观分类学及分子生物学方法,对分离菌进行了形态特征、理化特性、胞外酶活性及溶血活性等生物学性状检验;用PCR方法同时扩增其16SrRNA和gyrB基因,分析了16SrRNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树,通过基因序列分析,比较了两种基因在相似细菌的检测和鉴定能力;基于16SrRNA和gyrB基因的系统发育学分析表明分离菌(LD081008B-1)所扩增的16SrRNA和gyrB基因序列均与GenBank数据库中霍乱弧菌具有较高的相似性,且gyrB基因用于细菌种间鉴定更具优越性;16SrRNA基因序列长度为1446bp(GenBank登录号:GQ205447),gyrB基因序列长度为1207bp(GenBank登录号:GQ205452);根据分离菌的表型特征及分子特征,判定病原菌为弧菌属(VibrioPacini1854)的霍乱弧菌(Vibriocholerae)。胞外酶活性及溶血活性检测表明分离菌均具有蛋白酶、卵磷脂酶、淀粉酶、明胶酶及DNA酶活性,在含7%家兔脱纤血...     

黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)“红头病”病原菌迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的分离及鉴定

用ATB微生物自动鉴定系统对分离自湖南湘潭地区人工养殖的患“红头病”的黄颡鱼体内的2株细菌（即HN004和HN005）进行了鉴定，发现它们的生理生化特征完全相同，均为革兰氏阴性短杆菌、接触酶阳性、吲哚阳性、H2S阳性；氧化酶阴性、V．P测定为阴性，与迟钝爱德华氏菌的表型特征非常相似。为进一步确定2株菌的分类学地位，测定了其16S rRNA基因序列，分析了相关细菌相应序列的同源性，构建分子系统发育树。结果表明，2菌株的序列完全一致，与迟钝爱德华氏菌的亲缘关系最近，相似性为99．0％。综合上述结果，2菌株可鉴定为迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）。     

抗鲶爱德华氏菌多克隆抗体的制备及特性分析

利用2株黄颡鱼"红头病"病原菌——鲶爱德华氏菌的灭活疫苗作为免疫原,免疫新西兰大白兔,制备了高效价的多克隆抗体。通过间接酶联免疫、间接免疫荧光和免疫印迹等技术对多克隆抗体特性进行了分析。测定获得多抗效价分别为1∶215和1∶214,2株病原菌之间存在很强的交叉反应,且2种多抗均与鲶爱德华氏菌、迟钝爱德华氏菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、火神弧菌、河流弧菌、创伤弧菌标准菌株存在交叉反应,与粪肠球菌、大肠杆菌、酿脓链球菌、海豚链球菌、杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、类产碱假单胞菌标准菌株均无交叉反应。免疫印迹实验结果表明,2株病原菌的主要抗原决定簇相同,分子量分别为61.1,46.6,41.3,28.8和19 kDa。本实验得到了黄颡鱼"红头病"致病菌高效价的多克隆抗体,可以作为初步筛选"红头病"病原菌的工具,为建立快速有效的疾病监测方法和进一步的免疫学防病研究提供了依据,奠定了基础。     

基于16S rRNA和recA香鱼鳗利斯顿氏菌的分离鉴定

为研究引起香鱼(Plecoglossus altivelis)出血溃烂症病因及致病菌系统发育地位,本研究从患病香鱼的肝脏、肾脏及体表分离到11株病原菌(编号:X0901-X0911),运用常规细菌生理生化方法鉴定致病菌所属种类;运用16SrRNA基因、recA基因序列分析方法研究致病菌的系统发育地位。细菌生理生化鉴定结果表明:致病菌为鳗利斯顿氏菌,11株细菌生理生化结果相同,均为革兰氏阴性杆菌、氧化酶阳性、接触酶阳性、吲哚阳性、精氨酸脱羧酶阳性、精氨酸双水解酶阳性、硝酸盐还原阳性、甘露醇阳性、MR测定阳性;H2S阴性、V-P测定阴性等。根据16SrRNA基因、recA基因序列分别构建弧菌科常见细菌系统进化树,结果表明:致病菌与鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)均聚为一枝,聚类结果与细菌生理生化鉴定结果相符。致病菌与鳗利斯顿氏菌16SrRNA基因、recA基因的同源性分别为99.9%、99.8%。以recA基因构建的系统进化树的拓扑学结构与16SrRNA基因建树结果相类似。此外,与16SrRNA基因相比,recA基因在不同物种之间具有更高的鉴别能力,本研究表明recA基因适合作为弧菌科常见细菌物种间进化关系研究的标记。     

养殖黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco) 鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)的分离鉴定与生物学特性研究

从四川眉山与新津两地患红头病的养殖黄颡鱼体内分离到2株优势菌(CHNYC001与CHNYC002),以腹腔注射与浸泡的方式进行人工感染试验,证实其为养殖黄颡鱼红头病的病原菌。根据分离菌株的形态、生理生化特性,结合16SrDNA序列测定(GenBank登录号分别为FJ766524、FJ766525)与系统发育分析,将其鉴定为鮰爱德华氏菌(Edwardsie lla ictaluri)。分离菌株最适生长温度为20—30℃,最适生长pH为7.0,在含盐量2%以上的培养基上不生长,对氟苯尼考、强力霉素、洛美沙星等敏感,对乙酰螺旋霉素、磺胺甲基异噁唑和麦迪霉素等不敏感。临床病理特征分析发现,养殖黄颡鱼感染爱德华氏菌临床上分为急性与慢性两种类型,急性型主要表现为败血症的病变特征,慢性型表现为头顶出血,发红与溃疡的病变特征。     

来自大黄鱼(Pseudosciaena crocea)肠道的弧菌拮抗菌的筛选与鉴定

采用点种法并以副溶血弧菌(Vp1.2164)和溶藻弧菌(Va-Y)为弧菌指示菌,对从健康的大黄鱼肠道内分离的115株细菌进行体外拮抗试验。并对筛选出的拮抗菌进行抗菌谱测定,最后利用VITEK-32细菌快速鉴定系统和16SrRNA基因序列对拮抗菌进行鉴定。结果表明,从中筛选到3株有较强拮抗作用的菌株,编号分别为X1402-1、X1108和X3914,且菌株X1402-1的抗菌作用最强,抗菌谱最广,21株病原指示菌中,对16株均能产生较强的抑制作用,其中对Vp-1.2164的抑菌直径最大,达到28.5mm,对Va-Y的抑菌直径为8.7mm;其次为菌株X1108和X3914,对两种指示弧菌的抑菌直径分别为:12.0mm、9.0mm和0mm、7.2mm。经VITEK-32细菌快速鉴定系统鉴定,3株拮抗菌分别与铜绿假单胞菌,恶臭假单胞菌,地衣芽孢杆菌的相似性均为99%。通过16SrRNA基因序列分析表明,3株拮抗菌分别与类产碱假单胞菌Pseudomonas pseudoalcaligenes(EU419918)、恶臭假单胞菌Pseudomon asputida(FJ440105)和地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis(DQ988136)的16SrRNA基因同源性最高,分别为100.0%、97.5%、99.0%。综合分析试验结果,X1402-1、X1108和X3914分别被确定为类产碱假单胞菌、恶臭假单胞菌和地衣芽孢杆菌。     

养殖大菱鲆腹水病病原的研究

从患腹水病的大菱鲆(Scophthalmus maximus)肝和腹水中分离得到优势菌株CW-7,人工感染证实该菌株对大菱鲆幼苗有较强的致病性,腹腔注射1.4×103cfu/尾,即可引起感染鱼100%的死亡,症状与自然发病鱼相似;病原菌为革兰氏染色阴性,直杆状(0.4~0.8)×(0.6~2.0)μm,周生鞭毛运动,氧化酶阴性,兼性厌氧菌,兼具葡萄糖氧化和发酵(O/F)2种代谢途径,其生理生化特征与迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)一致;对该菌的16SrDNA序列克隆、测序后在GenBank中进行了序列对比分析,结果与迟缓爱德华氏菌的序列高度一致(99.92%),进化树分析表明属于同一类群,确定该菌株为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。该菌株对庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素B等14种抗生素敏感,而对青霉素、萘啶酸、复方新诺明等14种药物均具有抗性。     

石莼属(Ulva)和浒苔属(Enteromorpha)绿藻的RAPD分析

于１９９７年下半年在大连石油庙海区采集石莼、孔石莼、砺菜、缘管浒苔、肠浒苔、管浒苔、刚毛藻等７种海藻样品,采用ＲＡＰＤ技术对大连地区绿藻门石莼属和浒苔属进行了初步的分子系统学研究。所试６０个引物中有３２个经扩增得到了２３７个多态片段。应用ＰＨＹＬＩＰ软件包,按照ＵＰＧＭＡ法和Ｎ－Ｊ法聚类分析的结果均表明,缘管浒苔（Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ ｌｉｎｚａ）与石莼属有较近的亲缘关系,应深水探究其分类地位     

野生重口裂腹鱼[Schizothorax(Racoma) davidi(Sauvage)]的性腺发育观察与人工繁殖研究

对野生重口裂腹鱼[Schizothorax(Racoma) davidi(Sauvage)]的性腺发育观察与人工繁殖进行了研究。结果表明,重口裂腹鱼雄鱼3龄达到性成熟,而雌鱼5龄以上方达到性成熟,其性腺指数随着年龄增加而显著上升(P<0.05);雌鱼性腺指数、绝对怀卵量和卵径随着年龄和体重增加明显上升(P<0.05orP<0.01)。对24尾5、6龄雌、雄重口裂腹鱼采用二针注射法进行人工催产实验,平均采卵数为1.33万粒和2.02万粒,采精量为25.4ml和34.8ml。其平均卵子受精率和受精卵出膜时间分别为74.2%和77.1%、203h和227h[水温(16.2±0.9)℃],6龄雌鱼受精卵的卵径、卵重均明显高于5龄雌鱼,6龄雌鱼的受精卵孵化率为41.9%,明显高于5龄雌鱼的30.6%(P<0.05orP<0.01),选用年龄较大的雌鱼作为亲鱼,是保证人工繁殖获得良好效果的关键。     

魁蚶(Scapharca broughtonii)半乳糖凝集素(SbGal)基因cDNA的克隆及表达分析

半乳糖凝集素(Galectin)作为动物凝集素家族的一员,是一种重要的免疫因子,在脊椎动物和无脊椎动物中都参与了重要的免疫防御反应。为明确魁蚶(Scapharca broughtonii)半乳糖凝集素基因的结构特征、组织分布及其对病原菌刺激的免疫反应规律,本研究从构建的魁蚶转录组文库中筛选得到半乳糖凝集素基因部分序列,通过c DNA末端快速扩增(rapid amplication of c DNA ends,RACE)技术获得该基因c DNA全长序列(命名为Sb Gal)。序列和结构分析表明,该c DNA全长3120bp,编码554个氨基酸,是一个含有4个糖识别结构域(CRD)的且在双壳贝类中较为独特的半乳糖凝集素;预测蛋白的分子量(Mw)为63.3158 k Da,理论等电点(p I)为4.99。同源性及系统分析表明,Sb Gal基因与美洲牡蛎、合浦珠母贝、海湾扇贝galectin的同源性分别为70%、65%、46%,Sb Gal基因四个CRD彼此的相似性为36%—41%。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)结果表明:Sb Gal m RNA在魁蚶血细胞、斧足、闭壳肌、外套膜、鳃和肝胰腺中均有表达,血细胞中的表达量最高,在肝胰腺中的表达量最低;注射鳗弧菌后,相对于对照组,Sb Gal基因在所检测的每个组织中m RNA水平上的表达量都显著上调(P0.01),而且表达量具有显著的时间依赖性和瞬时表达趋势,呈现先升高后降低的趋势。     

一种棕囊藻的形态特征与毒素分析

于１９９７年１１月,在广东省汕头地区饶平县海面采集棕囊藻,采用显微观察和光谱分析方法,进行形态特征与毒素结构的研究。结果表明,该种藻具有两处不同的藻体形态：一种是不运动的球形群体,外具胶质被,群体内的细胞有近千至数万个,每个细胞有２－３个黄褐色的叶绿体;另一种是游动的单细胞,具有两根几乎等托的鞭毛和一根短的定鞭丝,常呈球形,将反复冻融或冷冻干燥的藻细胞经有机溶剂提取,用新鲜牛血球测定显示出强的溶血     

日本鳗鲡(Anguilla japonica)和欧洲鳗鲡(A. anguilla)的微卫星差异

采用PCR扩增单位点微卫星的方法研究了日本鳗鲡(Anguilla japonica)和欧洲鳗鲡(A. anguilla)的遗传差异.结果表明,微卫星等位基因数目分布范围为8-26,35组被试(5个分类单元各7个位点)的显著性检验的结果表明其杂合性显著缺乏(P＜0.01),日本鳗鲡的4个亚种群的所有微卫星位点均偏离哈-温平衡,对日本鳗鲡种群分化进行的正合检验结果也否定了种内个体随机分布的假设.FST值为0.0098(P=0.00048)揭示了日本鳗鲡亚种群内存在较弱但显著的遗传分化.各分类单元间的FST及RST逐一对应矩阵显示了日本鳗鲡与欧洲鳗鲡两个远缘种之间存在显著差异.计算Goldstein的遗传距离并由此推算出两个种的分化时间约为200多万年.     

仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道源乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的分离鉴定及其益生特性分析

利用MRS固体培养基从南移仿刺参肠道中分离得到1株优势乳酸菌,命名为AJC-XP-15,其最适生长温度为30°C,最适生长pH为6.5;其表面疏水性和自聚率分别为34.56%和35.61%,经16S RNA基因序列分析,并结合形态学和生理生化特性将其鉴定为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。拮抗实验结果显示,菌株AJC-XP-15及其发酵上清液对塔氏弧菌(Vibriotubiashii)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus, VP)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等病原菌具有很好的抑制作用;体外益生实验表明,菌株AJC-XP-15对人工胃肠液的耐受性很好,在pH3.0的模拟人工胃液处理3 h后的存活率为71.43%,在pH 6.8的模拟人工肠液处理3 h后的存活率为92.1%;抗氧化能力结果显示,菌株AJC-XP-15的无细胞提取物对DPPH自由基和羟自由基的清除能力最强,分别为(82.67±6.92)%和(15.36±2.95)%,其发酵上清液对超氧阴离子自由基的清除能力最强,为(26.36±...     

毛蚶对汞积累和排出的室内试验

随着汞资源的开发利用,产生了大量的含汞废渣、废气和废水,它们绝大部分通过江河迳流和雨雪尘土的沉降而进入海洋。据估计,每年进入海洋的汞竞多达10,000吨,这就使某些港湾和局部海区遭受严重的汞污染,给海洋生物以至人类健康造成危害。自从日本发现由于汞引起的闻名世界的公害病——水俣病以后,许多国家的学者对汞污染的生物效应进行了大量研究。海洋生物是海洋中汞迁移转化过程的一个重要环节,国外学     

鲢鳙鱼的打印病致病细菌的研究

打印病是鲢、鳙鱼的主要病害之一,对鱼种、成鱼和亲鱼阶段都能感染。据我们调查,严重的发病鱼池其感染率可高达80％。我国各地都有发现,特别是华中和华北地区比较流行,有些地区河道中也有发现;一年四季都有,而以夏秋两季最易发生。严重影响鱼种和成鱼的生长及亲鱼的催情产卵。 打印病的症状是:鱼种和成鱼患病的部位通常在肛门附近的两侧,或尾鳍基部,极少数在身体前部;亲鱼患病没有固定部位,全身各处都可以出现病灶。初期症状是皮肤及其     

龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)选育品系及其野生型的ISSR指纹分析

采用ISSR标记对龙须菜一个野生型群体和选育品系两个不同年代的栽培群体，进行了亲缘关系分析，构建了龙须菜选育品系的指纹图谱。通过实验从22个ISSR引物中筛选出16条引物，可以产生清晰稳定及可重复的带，共扩增出118个位点；野生型和选育品系两个群体的遗传相似率分别为0．7301、0．7189，选育品系的两养殖种群间的遗传相似率为0．9375；遗传距离聚类分析证明，龙须菜选育品系与其青岛野生型亲缘关系很近。7条引物产生的12条特异片段可用于龙须菜选育品系的种质鉴定，每条引物都能将龙须菜选育品系和其野生型分开；根据引物S848扩增的位点构建了指纹图谱，可用于区分龙须菜选育种群及野生种群。     

钩沙菜和冻沙菜的比较研究

1.钩沙菜Hypnea musciformis是广布于世界温暖水域中的种类,各地的记录很多。日本藻类学家田中刚在“日本沙菜属的研究”一文中认为:著名的日本故藻类学家冈村金太郎以前报导的日本产的钩沙菜与世界其他各地产的不同,因而建立了另一新种,命名为H.japonica,中文学名称作冻沙菜。 2.冻沙菜创立后,除日本外,世界其他各地迄今没有任何报导,在田中建立冻沙菜这一新种前,我国广东省和香港地区也有钩沙菜的记录。解放以后,我所的工作同志曾采到大量的本种标本。为了正确 地鉴定这些标本的学名,我们参考了我所海洋植物标本室收藏的产于世界各地并被许多著名藻类学家所鉴定的钩沙菜标本。经过全面比较研究后,我们感到田中在建种时所提到的作为两种间区别特点的体形和体质,在世界各地产的被命名为钩沙菜的标本中存在着与冻沙菜之间的中间类型。最初,我们曾怀疑冻沙菜是否是一个独立种,但经仔细比较后,发现钩沙菜的四分孢子囊一般都集生在孢囊枝的中部或上部,在极少数情况下偶有下延的;而冻沙菜则极其规律地只集生在孢囊枝的下部或稍向中部延伸。因此,四分孢子囊集生在孢囊枝上的位置可作为两种间区别的主要特征。 3.根据两种间的主要区别特征,我们对国内外定名为钩沙菜的标本进行了重新鉴定,更正了一些国内外定名