全骨髓直接贴壁分离人骨髓间充质干细胞的生物学特性

背景：体外分离培养骨髓间充质干细胞成为实验研究和临床应用的关键环节。目的：采用全骨髓培养法分离人骨髓间充质干细胞,建立一种简单、有效的分离培养骨髓间充质干细胞的方法。方法：通过全骨髓培养法分离培养人骨髓间充质干细胞,并通过传代进行纯化和扩增培养。分别在特定诱导体系中诱导人骨髓间充质干细胞向脂肪、成骨及软骨细胞分化。结果与结论：采用全骨髓培养分离法能获得90%以上纯度的骨髓间充质干细胞;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD73、CD90、CD105,不表达造血细胞表型CD34、CD45和HLA-DR;细胞倍增时间为（24.04±0.49）h;细胞周期分析表明：G0~G1期和S＋G2＋M期所占比例分别为71.63%和28.37%;诱导分化结果显示,人骨髓间充质干细胞能够向脂肪、骨和软骨细胞分化。说明全骨髓分离培养法是一种较好的分离人骨髓间充质干细胞的方法。     

全骨髓直接贴壁分离人骨髓间充质干细胞的生物学特性

背景:体外分离培养骨髓间充质干细胞成为实验研究和临床应用的关键环节。目的:采用全骨髓培养法分离人骨髓间充质干细胞,建立一种简单、有效的分离培养骨髓间充质干细胞的方法。方法:通过全骨髓培养法分离培养人骨髓间充质干细胞,并通过传代进行纯化和扩增培养。分别在特定诱导体系中诱导人骨髓间充质干细胞向脂肪、成骨及软骨细胞分化。结果与结论:采用全骨髓培养分离法能获得90%以上纯度的骨髓间充质干细胞;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD73、CD90、CD105,不表达造血细胞表型CD34、CD45和HLA-DR;细胞倍增时间为(24.04±0.49)h;细胞周期分析表明:G0~G1期和S+G2+M期所占比例分别为71.63%和28.37%;诱导分化结果显示,人骨髓间充质干细胞能够向脂肪、骨和软骨细胞分化。说明全骨髓分离培养法是一种较好的分离人骨髓间充质干细胞的方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向诱导分化及免疫组化鉴定

目的建立体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法,体外诱导其向神经元样细胞方向分化。方法应用细胞培养技术从大鼠股骨、胫骨中分离、纯化骨髓间充质干细胞并在体外进行培养,以形态学方法鉴定间充质干细胞,在倒置显微镜下观察细胞的形态特征,利用含10 ng/ml bFGF的LG-DMEM及含200μmol/L BHA、2%DMSO的无血清DMEM诱导其向神经元样细胞分化,并通过免疫组化方法鉴定。结果经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,类似于成纤维细胞;成神经元诱导24 h后,多数MSCs变为典型的神经元样细胞,胞体向胞核收缩并有较多的长突起,免疫组化显示神经元特异性标志NSE、神经巢蛋白Nestin染色阳性。结论体外成功的进行了MSCs原代及传代培养,细胞生长稳定、增殖迅速并可多次传代,经诱导后具有向神经元样细胞分化潜能。     

豚鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨诱导

背景:利用骨髓间充质干细胞的取材灵活性及快捷性,对已掌握的培养技术及成骨诱导进一步探索性研究。目的:通过建立豚鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养法,探讨豚鼠骨髓间充质干细胞表型特征以及多项分化潜能。方法:利用贴壁培养法分离纯化豚鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增,流式细胞分析检测细胞表面分子CD29、CD44、CD45的表达。分别采用成骨诱导培养液和成脂诱导培养液定向诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞分化。结果与结论:原代分离的骨髓间充质干细胞在接种后96h贴壁,细胞形态为椭圆形,多角形及短梭形,8d时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。经传代扩增,细胞进一步纯化,细胞形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列,而且生长速率加快。流式细胞检测CD29、CD44阳性率分别为95.7%和65.7%。不同诱导剂定向诱导后,经油红O、茜素红S、碱性磷酸酶染色、免疫组织化学Ι型胶原酶鉴定,P3代骨髓间充质干细胞分别向脂肪细胞及成骨细胞分化。结果表明,通过贴壁筛选方法,体外分离培养的豚鼠骨髓间充质干细胞具有很强的增殖能力,并保持稳定的表型特征及多向分化潜能。     

脐血间充质干细胞的分离培养及生物学特性

背景：脐血富含干细胞,刺激后进入细胞周期的速度以及自泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血干细胞。目的：建立一种分离纯化、培养扩增脐血间充质干细胞的方法,并观察体外培养脐血间充质干细胞的生物学特性。方法：密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化脐血间充质干细胞。观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,应用流式细胞仪测定细胞周期,以免疫组织化学法（SP 法）测定 CD29,CD44,CD34。采用体积分数 20%马血清诱导脐血间充质干细胞分化为脂肪细胞,以油红 O 染色鉴定;0.1 μmol/L 地塞米松,10 mmol/L β-甘油磷酸钠和 50 μmol/L 抗坏血酸诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞,以碱性磷酸酶染色鉴定。结果与结论：分离获得了高纯度贴壁生长的间充质干细胞,间充质干细胞呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养 9 代,未发生形态学改变,无衰老征象。第 3 代间充质干细胞体外可以分化为脂肪细胞和成骨细胞。提示采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,可以获得纯度较高的脐血间充质干细胞,脐血间充质干细胞体外增殖和传代能力强。     

脐血间充质干细胞的分离培养及生物学特性

背景:脐血富含干细胞,刺激后进入细胞周期的速度以及自泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血干细胞。目的:建立一种分离纯化、培养扩增脐血间充质干细胞的方法,并观察体外培养脐血间充质干细胞的生物学特性。方法:密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化脐血间充质干细胞。观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,应用流式细胞仪测定细胞周期,以免疫组织化学法(SP 法)测定 CD29,CD44,CD34。采用体积分数 20%马血清诱导脐血间充质干细胞分化为脂肪细胞,以油红 O 染色鉴定;0.1 μmol/L 地塞米松,10 mmol/L β-甘油磷酸钠和 50 μmol/L 抗坏血酸诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞,以碱性磷酸酶染色鉴定。结果与结论:分离获得了高纯度贴壁生长的间充质干细胞,间充质干细胞呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养 9 代,未发生形态学改变,无衰老征象。第 3 代间充质干细胞体外可以分化为脂肪细胞和成骨细胞。提示采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,可以获得纯度较高的脐血间充质干细胞,脐血间充质干细胞体外增殖和传代能力强。     

人脐血间充质干细胞分离、培养及向成骨细胞分化的实验研究

目的探讨脐血间充质干细胞(MSCs)的分离培养及向成骨细胞的分化潜能。方法从足月儿脐血中获得间充质干细胞,体外培养传代,流式细胞检测细胞表面及抗原细胞周期;1.0×10-8mol/L地塞米松,2.0×10-4mol/L抗坏血酸,7.0×10-3mol/Lβ-磷酸甘油的IMDM培养基对MSCs进行诱导向脂肪细胞分化,von-Kossa染色鉴定。结果成功建立了脐血间充质干细胞分离及培养扩增的方法;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD105、CD29和CD44,不表达造血细胞表型CD34、CD45和内皮细胞表型CD31;经脂肪培养液诱导后细胞间可见黑色矿化物沉积阳性。结论脐血间充质干细胞能进行体外分离培养,并能诱导分化为成骨细胞。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及优势

背景：骨髓来源的间充质干细胞含量极低,体外纯化、扩增活性好、分化潜能高的骨髓间充质干细胞,对进一步研究至关重要。目的：进一步验证全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞的生物学特性、表型及多向分化潜能。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞标记物表达,分别进行成骨、成脂诱导分化。结果与结论：成功纯化、扩增了高细胞活性、高分化潜能的骨髓问充质干细胞。所得细胞呈成纤维细胞样;表达CD29、CD90,不表达CD45;成骨、成脂诱导分化后,茜素红染色、油红O染色阳性。证实全骨髓贴壁法操作简单、对细胞活性损伤小,可以得到高纯度、高活性、高分化潜能、生物学形态和特征稳定的骨髓间充质干细胞。     

贴壁和缩短胰酶消化时间培养大鼠骨髓间充质干细胞

背景：对于骨髓间充质干细胞的分离纯化、培养扩增目前已有几种方法,各自均有不同的优劣性。目的：观察贴壁法和缩短胰酶消化时间的方法体外分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞的特点。方法：培养初期频繁换液,去除混杂细胞;传代后加入不同诱导剂定向诱导分化,使之分别向脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞方向分化。结果与结论：该分离培养方法在第3代可以得到纯化的骨髓间充质干细胞。分离培养的细胞纯度高,有良好的增殖和分化潜能。定向诱导培养的细胞能向成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞方向分化。     

贴壁和缩短胰酶消化时间培养大鼠骨髓间充质干细胞

背景:对于骨髓间充质干细胞的分离纯化、培养扩增目前已有几种方法,各自均有不同的优劣性。目的:观察贴壁法和缩短胰酶消化时间的方法体外分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞的特点。方法:培养初期频繁换液,去除混杂细胞;传代后加入不同诱导剂定向诱导分化,使之分别向脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞方向分化。结果与结论:该分离培养方法在第3代可以得到纯化的骨髓间充质干细胞。分离培养的细胞纯度高,有良好的增殖和分化潜能。定向诱导培养的细胞能向成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞方向分化。     

成人骨髓间充质干细胞体外多向分化潜能特性的研究

目的研究体外不同诱导条件下成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞分化的能力。方法用细胞化学方法对诱导后的骨髓细胞进行脂肪细胞特异油红O染色；Von Kossa及改良的钙钴法进行成骨细胞鉴定；免疫组化方法检测诱导后的骨髓细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白-M(NF—M)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达。结果在不同的诱导条件下，诱导后的细胞油红O染色胞浆内可见橙红色脂滴；Von Kossa染色可见细胞间布满黑色颗粒，提示有矿化基质沉积；改良钙钻法碱性磷酸酶染色胞浆呈深棕色或深黑色。免疫组化染色显示向神经细胞方向诱导后细胞NSE( )、NF—M( )、GFAP(-)。结论成人骨髓间充质干细胞在体外具有多向分化的潜能。     

人骨髓间充质干细胞分离鉴定方法的改进

本研究的目的是建立一种基于临床移植需要的分离、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSC）的方法,为配合造血干细胞移植的临床应用提供实验基础.采用Percoll分离液（1.073/gml）从新鲜成人骨髓穿刺液中分离MSC,应用贴壁筛选法传代培养,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系（地塞米松0.1 μmol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、抗坏血酸磷酸盐50μmol/L）及脂肪诱导体系（地塞米松1μmol/L、牛胰岛素5 mg/L、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤0.5 mmol/L、消炎痛60μmol/L）分别诱导MSC定向分化,通过细胞形态观察及免疫化学染色进行鉴定.结果表明：从成人骨髓液中分离培养出MSC,稳定表达CD73、CD105、CD166,不表达CD34、CD45.定向诱导的成骨细胞表达碱性磷酸酶活性,脂肪细胞内出现明显的脂滴.结论：采用密度梯度离心联合贴壁筛选法并通过流式细胞术检测及定向诱导分化,能够从成人骨髓液中分离出MSC,并完成细胞表型及多向分化潜能的初步鉴定.本操作方案具有一定的临床应用价值.     

重型肝病患者血清诱导脐血间充质干细胞表达白蛋白和细胞角蛋白18

背景:脐血富含间充质干细胞,刺激后进入细胞周期的速度以及自分泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血干细胞。目的:观察肝衰竭患者血清对人脐血间充质干细胞的诱导分化作用。方法:密度梯度离心和贴壁培养法相结合分离纯化脐血间充质干细胞并鉴定,以20%肝衰竭患者血清诱导培养,培养7,14,21d采用免疫组织化学方法检测白蛋白和细胞角蛋白18的表达。结果与结论:实验分离获得了高纯度贴壁生长的间充质干细胞,人脐血间充质干细胞高表达CD44和CD29,不表达CD34,体外可以分化为脂肪细胞;人脐血间充质干细胞在肝病患者血清的低糖DMEM培养基中形态发生明显改变,镜下观察细胞变得稍大而扁平,呈类上皮样细胞,SP染色显示实验组培养7d时仅少数细胞表达白蛋白和细胞角蛋白18,培养14,21d,白蛋白和细胞角蛋白18表达阳性率逐渐升高,与对照组相比差异有显著性意义(P<0.05)。提示密度梯度离心和贴壁培养法相结合可以获得纯度较高的脐血间充质干细胞,肝衰竭患者血清可诱导间充质干细胞表达白蛋白和细胞角蛋白18。     

骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的研究5-氮胞苷（5-Aza）对培养人骨髓间充质干细胞（MSCs）的作用,并对分化后的心肌样细胞进行鉴定。方法采用密度梯度离心法分离到骨髓单个核细胞（MB-MNC）,用含200ml／L胎牛血清的低糖型DMEM培养液进行培养。采用差速贴壁法纯化MSCs,用流式细胞仪检测细胞表面抗原。以5-Aza诱导第3代MSCs 24h后,继续培养。于培养的第4周,采用免疫细胞化学方法检测肌系特异性标记抗原结合蛋白（nesmin）,RT-PCR检测心肌早期转录因子GATA-4和心肌特异性蛋白肌钙蛋白T（cTnT）。结果MSCs经5-Aza诱导分化后表达Desmin、GATA-4和cTnT,未经诱导的同培养天数的MSCs中均呈未见表达。结论MSCs经5-Aza诱导后可以表现心肌样细胞特征。     

猪骨髓间质干细胞的分离培养及分化潜能的鉴定

目的：建立猪骨髓间质干细胞(MSCs)的体外分离培养和鉴定的方法，探讨体外培养的间充质干细胞的一些生物学特点，为利用猪的实验研究提供实验基础。方法：猪的髂嵴穿刺吸取骨髓，经密度梯度离心得到骨髓单个核细胞，接种后形成单层贴壁的成纤维样的细胞。检测细胞周期，多向诱导分化鉴定分离的细胞。结果：体外培养的原代MSCs12～14d达到融合，传代后仍具有分化成骨的能力，细胞周期显示有80％的细胞处于GO／G1期。结论：体外培养猪的MSCs具有分化成骨的潜能，生长稳定，传代后仍保持未分化状态．猪骨髓间充质干细胞分离培养体系的建立为基础研究和组织工程提供了一个有价值的动物模型。     

补肾活血中药对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

背景:骨髓间充质干细胞因其获取容易、创伤微小、具有无限扩增和多分化潜能、自体移植不存在免疫排斥反应而受到医学研究者的青睐.目的:体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,观察不同浓度补肾活血中药含药血清对其增殖的影响.设计:完全随机对照的动物实验.单位:广州中医药大学第一附属医院髋中心.材料:选用健康雄性SD大鼠40只,SPF级,体质量170～180 g,由广州中医药大学实验动物中心提供.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.将实验动物按随机数字表分为4组,正常对照组和高、中、低剂量给药组,每组10只.方法:实验于2005-01/03在广州中医药大学实验动物中心完成.采用Percoll密度梯度离心法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养,建立大鼠骨髓间充质干细胞培养体系.高、中、低剂量给药组大鼠分别灌胃补肾活血中药4.4,2.2和1.1 g/kg,分别相当临床成人用量的20,10和5倍.正常对照组灌胃纯净水.连续给药1周.末次给药1 h后,无菌条件下,腹主动脉取血6 mL/只,2 000 r/min离心15 min,收集血清.高、中、低剂量给药组用10%大鼠含药血清代替10%的牛血清,正常对照组的培养基加入10%的血清.每天观察并记录细胞生长情况,绘制生长曲线.主要观察指标:①骨髓间充质干细胞的生长状况.②HE染色和吉姆萨染色观察骨髓间充质干细胞形态.③免疫细胞化学法检测骨髓间充质干细胞的抗原表达.④不同浓度含药血清对骨髓间充质干细胞生长情况的影响.结果:①骨髓间充质干细胞的生长状况:原代培养的骨髓细胞24 h后开始贴壁,7 d后可达80%融合.②骨髓间充质干细胞的一般形态:骨髓间充质干细胞的细胞多成长梭形或多角形,细胞体积小,胞核位于胞中或稍偏,核浆比略大.③髓间充质干细胞的抗原表达:单个核细胞的胞浆中有CD44表达,着蓝色,部分骨髓间充质干细胞表达c-Kit,在表型表达和细胞形态上具备骨髓间充质干细胞特征.④补肾活血中药对骨髓间充质干细胞生长曲线的影响:高、中、低剂量给药组在加入补肾活血中药血清3 d后,骨髓间充质干细胞数量比空白对照组明显增多,并与剂量呈正比.结论:补肾活血中药含药血清能促进骨髓间充质干细胞的体外增殖.     

鼠脑C6胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质千细胞向神经元样细胞的分化

目的:观察人骨髓间充质干细胞经鼠脑C6胶质瘤细胞上清液诱导后向神经元样细胞方向的分化情况.方法:取肝素抗凝人骨髓血,Percoll梯度法体外分离培养骨髓间充质干细胞,胰酶消化后传代扩增.取第4～6代骨髓间充质干细胞,当细胞达90%融合时,按2×103/孔接种于24孔板内,第2天分为两组,诱导组用含有50%C6胶质瘤细胞上清液的完全培养基(含体积分数为0.1胎牛血清的L-DMEM培养基)诱导,每隔2 d换液1次;对照组单纯加入完全培养基进行培养.诱导后3 d,两组细胞采用S-P法进行免疫细胞化学染色,检测神经元特异性标志物的表达.结果:诱导24 h后,诱导组多数骨髓间充质干细胞表现出典型的神经元样外观,对照组细胞形态无明显变化.诱导3 d后,诱导组神经元烯醇化酶阳性细胞率显著高于对照组(P<0.01);诱导组神经丝蛋白阳性细胞率为(44.2±2.4)%,对照组为阴性:两组胶质纤维酸性蛋白均呈阴性表达.结论:鼠脑C6胶质瘤细胞上清液可成功诱导入骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化.     

补肾活血中药对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

背景：骨髓间充质干细胞因其获取容易、创伤微小、具有无限扩增和多分化潜能、自体移植不存在免疫排斥反应而受到医学研究者的青睐。 目的：体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞，观察不同浓度补肾活血中药含药血清对其增殖的影响。 设计：完全随机对照的动物实验。 单位：广州中医药大学第一附属医院髋中心。 材料：选用健康雄性SD大鼠40只，SPF级，体质量170-180g，由广州中医药大学实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。将实验动物按随机数字表分为4组，正常对照组和高、中、低剂量给药组，每组10只. 方法：实验于2005-01/03在广州中医药大学实验动物中心完成。采用Percoll密度梯度离心法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞，体外培养，建立大鼠骨髓间充质干细胞培养体系。高、中、低剂量给药组大鼠分别灌胃补肾活血中药4.4，2．2和1．1g/kg，分别相当临床成人用量的20，10和5倍。正常对照组灌胃纯净水。连续给药1周。末次给药1h后，无菌条件下，腹主动脉取血6mid只，2000r／min离心15min，收集血清。高、中、低剂量给药组用10％大鼠含药血清代替10％的牛血清，正常对照组的培养基加入10％的血清。每天观察并记录细胞生长情况，绘制生长曲线。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的生长状况。②HE染色和吉姆萨染色观察骨髓间充质干细胞形态。③免疫细胞化学法检测骨髓间充质干细胞的抗原表达。④不同浓度含药血清对骨髓间充质干细胞生长情况的影响。 结果：①骨髓间充质干细胞的生长状况：原代培养的骨髓细胞24h后开始贴壁，7d后可达80％融合。②骨髓间充质干细胞的一般形态：骨髓间充质干细胞的细胞多成长梭形或多角形，细胞体积小，胞核位于胞中或稍偏，核浆比略大。③髓间充质     

大鼠骨髓间充质干细胞的纯化、冻存及成瘤性分析

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量极低,体外的长期培养过程中易丧失干细胞潜能以及体内移植后安全性等问题的存在,限制了骨髓间充质干细胞在临床上的广泛应用。目的：探索体外分离纯化、冻存大鼠骨髓间充质干细胞的最适方法,并观察以此方法培养的骨髓间充质干细胞移植体内后是否具有成瘤性。方法：分别采用差速贴壁结合24h首次换液、24h首次换液、48h首次换液的方法纯化培养骨髓间充质干细胞,筛选最适纯化方法进行后续实验。配制含体积分数为10%,20%,30%,40%,50%胎牛血清的细胞冻存液冻存细胞,复苏后计算细胞存活率,测定复苏后细胞的生长曲线及成脂诱导能力。将第3,15代骨髓间充质干细胞进行裸鼠肌肉、肝脏局部注射体内移植,45d后取注射部位行病理组织标本检查。结果与结论：差速贴壁结合24h首次换液法所获得骨髓间充质干细胞纯度最高,而细胞增殖能力与其他两组无明显差别,因此选用该方法纯化骨髓间充质干细胞,然后进行传代培养;含体积分数为30%血清冻存液既可保证细胞活性与增殖能力,又可保证干细胞特性及多向分化潜能。骨髓间充质干细胞传至15代仍保持间充质干细胞特性,骨髓间充质干细胞移植入裸鼠肝脏45d后仍可在肝脏局部存活,生长状态与体外培养相似,无异型性及向周围浸润生长,提示体外长时间培养15代以内的骨髓间充质干细胞可在裸鼠体内存活且无成瘤性。