AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

利用杆状病毒表达系统对AsiaⅠ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白功能及建立AsiaⅠ型FMDV血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法从pGEM-T-Easy-AsiaⅠ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFastBacHTA-VP1再转入DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-VP 1,然后转染Sf9昆虫细胞。PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1,SDS-PAGE和Western-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5 ku的VP1蛋白。将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出AsiaⅠ型口蹄疫病毒阳性血清。AsiaⅠ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础。     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

利用杆状病毒表达系统对Asia Ⅰ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VPl基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究Asia Ⅰ型FMDV VP1蛋白功能及建立Asia Ⅰ型FMDV血清学诊断方法奠定基础.采用PCR方法从pGEM-T-Easy-Asia Ⅰ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFast-BaeHTA-VPl再转入DH10Bae感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Baemid-VPl,然后转染Sf9昆虫细胞.PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Baemid-VP1,SDS-PAGE和West-ern-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5 ku的VP1蛋白.将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出Asia Ⅰ型口蹄疫病毒阳性血清.Asia Ⅰ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为Asia Ⅰ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础.     

表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组塞内卡病毒的构建与鉴定

A型塞内卡病毒(SVA)是近年来新流行的一种传染性病原，与口蹄疫病毒(FMDV)具有相似的基因组结构，所致临床症状也十分相似。为了研发一种新型的基因工程活载体疫苗，用于预防塞内卡病毒感染和口蹄疫，以SVA全长感染性克隆pSVA-GX01为基础，在SVA 2A与2B基因之间插入O型FMDV的VP1基因，经双酶切及测序鉴定，成功获得了重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O。将重组质粒转染BHK-21细胞，拯救获得重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O,间接免疫荧光试验鉴定显示，该重组病毒可在细胞中表达O型FMDV的VP1蛋白。对该重组病毒进行体外生长增殖特性以及遗传稳定性分析表明，重组毒株和亲本毒株在BHK-21细胞上具有相似的增殖特性，插入的FMDV VP1基因可在细胞传代过程中稳定存在6代。研究结果为开发以塞内卡病毒为载体构建表达口蹄疫病毒VP1蛋白的重组基因工程活载体疫苗提供了参考。     

O型FMDV VP1基因的真核表达及其产物的生物学活性

根据已克隆的O型口蹄疫病毒VP1基因序列，设计了1对带有Sac Ⅰ和HindⅢ酶切位点的引物，用其将pMD18-T-VP1质粒中的VP1基因亚克隆到真核表达栽体pBlueBacHis2A中，成功地构建了重组表达质粒pBlueBacHis2A—VP1（633bp）。将pBIueBacHis2A—VP1（633bp）质粒与Bac-N—Blue^TM DNA共转染sf9昆虫细胞，蚀班筛选重组病毒后，将纯化的重组病毒感染sf9细胞，获得了32．6ku的目的蛋白条带。Dot—ELISA分析结果表明，该表达产物具有反应活性，可用于建立间接ELISA方法，进行口蹄疫病毒抗体检测。     

口蹄疫病毒VP2基因的原核表达及抗原性检测

将口蹄疫病毒VP2基因连接到原核表达载体pPROEX^TM HTb上，获得重组质粒pPR-VP2。将此质粒转化感受态菌DH5α中，经终浓度为1．0mmol／L的IPTG诱导，1h～6h依次收集菌液，SDS-PAGE电泳分析，在4h后表达量可达到高峰。经过软件分析，表达产物占总菌体蛋白的23．1％，大小为33Ku左右。根据Ni-NTA纯化系统说明操作，获得较纯的VP2融合蛋白。以牛抗O型口蹄疫病毒血清为第一抗体，通过Western blot和Dot ELISA鉴定，纯化后的VP2融合蛋白可以与牛抗O型口蹄疫病毒血清发生特异性反应。     

猪O型口蹄疫病毒样颗粒的构建及鉴定

为开发猪O型口蹄疫病毒(FMDV)病毒样颗粒(VLPs)基因工程亚单位疫苗,试验参考GenBank中登录的FMDV毒株基因序列(登录号:JN998085),设计针对VP1、VP2、VP3和VP4 4个基因片段的特异性引物,以O型FMDV O/MYA98/XJ/2010毒株的cDNA序列为模板,对目的基因进行PCR扩增;将获得的VP3、VP1和VP4、VP2基因片段分别插入2个杆状病毒供体质粒(pFastBacDual)的p10和pH双元启动子中,构建pFBD-VP3-VP1和pFBD-VP4-VP2 2个重组转座质粒;将验证正确的2个重组转座质粒分别转化含有穿梭载体(Bacmid)的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得2个重组杆粒rBacmid-VP3-VP1和rBacmid-VP4-VP2,经验证正确后,对其进行扩增和提取,将其分别转染Sf9贴壁昆虫细胞,构建2个重组杆状病毒rvAc-VP3-VP1和rvAc-VP4-VP2;2个重组杆状病毒共同感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞,利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞内对4个基因进行表达,目的蛋白通过间接免疫荧光试验(IFA)、SDS-PAGE、Western blotting及透射电镜(EM)进行检测。结果显示,本研究成功构建2株分别表达FMDV VP1、VP2、VP3和VP4 4个结构蛋白的重组杆状病毒;特异性抗体检测发现,4个蛋白VP1～VP4均成功表达,且具有良好的特异性反应;4个蛋白在Sf9昆虫细胞内能够完成自我组装,形成与天然病毒结构相似的VLPs,直径大小在25～30 nm。本研究利用共感染表达方式在Sf9昆虫细胞内成功制备出FMDV病毒颗粒,为开发高效安全的FMDV基因工程亚单位疫苗开辟了一条新思路。     

猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达

将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒双拷贝VP1基因的串联表达及其免疫原性

口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因含有T细胞和B细胞表位,是口蹄疫病毒的主要免疫原性基因。作者将亚洲Ⅰ型FMDV VP1基因首尾串联构建双拷贝的VP1基因（2VP1）,实现双拷贝VP1基因的原核表达,表达的重组蛋白（GST2VP1）经Sephadex-G200分子筛层析纯化后,Western blot证实其有反应原性,动物试验表明重组蛋白在加强免疫后能够产生和灭活疫苗相当的ELISA抗体和中和抗体;本试验结果为亚洲Ⅰ型FMDV免疫原性研究及GST2VP1蛋白的进一步应用奠定了基础。     

A群猪轮状病毒G5型OSU株VP7基因的克隆及其重组杆状病毒的鉴定

利用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增出A群猪轮状病毒（PRV）G5型OSU株长度约为1．0kb的基因片段，将其克隆到pMD18-T载体上进行测序鉴定，证明为该PRV的VP7蛋白基因，与已发表的该PRV，VP7基因序列的同源性为99．8％，将该基因黏端克隆至表达载体PblusBAChis C质粒中，酶切及PCR鉴定表明获得了PRV－VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子，纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5d后收获重组病毒，通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定，确定PRV－VP7基因已正确投入，将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后，获得了重组杆状病毒PRV－VP7蛋白的真核表达。     

鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备

为了制备鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒,本试验通过RT-PCR技术扩增出鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株JL株的VP2全长基因,并将其插入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建含有IBDV VP2基因的重组供体质粒pFast-VP2,转化DH10Bac E.coli感受态细胞中,经蓝白斑筛选,获得重组杆粒rBacmid-VP2,将重组杆粒rBacmid-VP2转染sf9细胞后得到重组杆状病毒vBac-VP2。rBac-VP2感染sf9细胞,提取DNA,经PCR电泳分析,得到1条与预期大小相符的特异性条带;间接免疫荧光检测,可见特异性荧光;Western-blotting分析,在大约53 000处出现1条特异性的蛋白条带;电镜观察感染重组杆状病毒的细胞上清和沉淀,均可见重组VP2蛋白自行组装形成的病毒样颗粒。试验结果表明IBDV VP2基因在昆虫细胞中得到了表达,并自组装成了IBDV病毒样颗粒。本试验为研制鸡传染性法氏囊病病毒样颗粒疫苗奠定了基础。     

透明颤菌血红蛋白基因(vgb)表达载体的构建及其诱导表达

利用PCR技术将透明颠菌血红蛋白基因(vhb)克隆到融合表达裁体pET28a，在大肠杆菌BL21(DE3)表达。重组蛋白分别在30℃和37℃诱导表达，30℃诱导获得可溶性表达。结果表明：在30℃，1．5mmol／L和2．5mmol／LIPTG诱导下，诱导4—8h透明颠菌血红蛋白可获得高表达——透明颠菌血红蛋白的表达量分别占菌体总蛋白的18．7％和27．7％。     

抗菌肽Cecropin P1基因表达载体构建与表达

根据大肠杆菌的密码子偏好性,人工设计并合成了3条抗菌肽Cecropin P1基因寡核苷酸片段,通过PCR扩增得到抗菌肽Cecropin P1基因,将此基因克隆到原核表达载体pMAL-p2X中,然后将重组质粒pMAL-p2X-Cecropin P1转化E.coliTB1,经IPTG诱导进行融合表达,以Amylose Resin亲和层析纯化。通过SDS-PAGE分析,融合蛋白MBP-Cecropin P1表达与纯化成功。抗菌肽Cecropin P1基因的成功表达为进一步研究其抗菌活性、抗菌机理及应用研究打下基础。     

细胞黏附分子1（ICAM-1）ScFv基因原核载体的构建及表达

应用PCR技术扩增ICAM-1ScFv基因,经纯化测序,得到约750bp的核苷酸片段,并构建了原核重组表达质粒pET20b-ICAM-1ScFv。将重组质粒转化至表达菌BL21（DE3）中,诱导后的SDS-PAGE分析显示,pET20b-ICAM-1ScFv表达量占菌体蛋白总量的18.4%。本试验将重组蛋白的表达条件进行优化,结果表明,ICAM-1ScFv蛋白在pET20b表达载体中的最佳表达条件为37℃诱导5h。     

牛结核分枝杆菌溶血磷脂酶真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达

为了研究牛结核分枝杆菌溶血磷脂酶基因(Lip)的生物学特性及其功能,试验构建了Lip-pEGFP融合基因的真核表达载体,利用脂质体(lipofectamine2000)将其转染到Hela细胞中,用荧光显微镜检测GFP在细胞中的表达情况。结果显示,重组Lip-pEGFP载体在Hela细胞中获得了高效表达,且能够稳定传代,为进一步研究Lip的生物学功能及其在牛结核分枝杆菌中的作用奠定了基础。     

戊型肝炎病毒RdRp基因真核表达质粒的构建及表达

目的 构建戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV )RdRp基因真核表达质粒,并检测其在PLC/PRF/5、A549和HepG2 3种细胞中的表达,为后续RdRp的研究提供实验依据.方法 利用RT-nPCR法从阳性HEV粪便中扩增RdRp基因片段,插入pcDNA3.0真核表达载体中,并在其3’端插入EGFP报告基因,构建融合表达质粒pcDNA3.0-RdRp-EGFP,脂质体法转染PLC/PRF/5、A549和HepG2细胞,荧光显微镜观察报告基因的表达,RT-nPCR检测RdRp基因mRNA的转录情况,Western blot检测RdRp蛋白的表达.结果 重组表达质粒经酶切鉴定和测序证实构建正确;RdRp基因和蛋白在A549和HepG2细胞中可高效、特异性表达.结论 成功构建了RdRp基因对真核表达质粒,并在A549和HepG2培养细胞中大量表达,为进一步研究RdRp在HEV复制过程中的功能奠定了基础.     

猪食欲肽受体2基因真核表达质粒的构建及其表达

构建带有myc标签和Kozak序列的猪食欲肽受体2(OX2R)基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-myc/OX2R,观察在HEK293T真核细胞中的表达。设计带有酶切位点(HindⅢ和XbaⅠ)的特异性引物,采用RT-PCR技术从猪的下丘脑中扩增OX2R基因,并克隆入pcDNA3.1(+)质粒中。用限制性内切酶酶切分析及测序分析证明构建成功后,用脂质体法转染HEK293T细胞,蛋白质印迹法检测OX2R基因的表达。结果,成功构建了带有myc标签和Kozak序列的pcDNA3.1(+)-myc/OX2R重组质粒,蛋白质印迹法检测该质粒可在真核细胞中表达。本研究为将来研究猪食欲肽受体2的功能奠定基础。     

鸡IL-18酵母表达载体的构建及表达条件的优化

应用PCR技术从含有罗曼鸡白介素18全长基因质粒pMD18-T-ChIL-18中扩增出鸡IL-18成熟肽基因,亚克隆于毕赤酵母表达载体pPICZαA上,构建了重组质粒pPICZαA-ChIL-18。经酶切、PCR和测序鉴定正确后,电转化入毕赤酵母菌X-33,筛选多拷贝单克隆进行诱导表达,并进一步分析了培养液pH值、诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度对重组菌表达水平的影响,从而获得最优化的表达条件。结果表明,重组毕赤酵母菌能够表达鸡IL-18,且在培养液pH6.0,甲醇诱导浓度1.5%,诱导温度26℃的条件下诱导96 h,目的蛋白的表达量最高,可占菌体总蛋白的60.2%。本文为鸡IL-18的规模化发酵生产奠定了基础。     

新孢子虫核糖体磷蛋白基因真核表达载体的构建及瞬时表达

采用PCR技术扩增出新孢子虫核糖体磷蛋白(NcP0)全长基因片段,并将其克隆入真核表达载体pVAX1中,构建pVAX1-NcP0表达载体。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染Vero细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测和IFA检测目的基因的转录与表达情况。结果表明克隆的P0蛋白基因序列全长为1 379 bp;RT-PCR结果显示目的基因已被成功转录;IFA检测证明目的基因被成功表达。本试验成功构建了NcP0的真核表达载体,转染Vero细胞,获得了NcP0的瞬时表达。